[0150] hADSCs were purchased from I

[0150] hADSCs were purchased from Invitrogen, also known as Life
Technologies, of Carlsbad, CA, U.S.A., and were cultured as near confluent
monolayers in 100mm culture plates within a maintenance media consisting of
Complete MesenPro RS medium with growth supplement and L-glutamine obtained from Invitrogen®. The process of culturing, passage, and seeding the hADSCs is described below.
[0151] The subculture of hADSCs was performed when cell culture reached
confluence. To passage hADSCs, the following procedure is used: i) aspirate the
Complete MesenPRO RS medium from the cells; ii) rinse the surface area of the cell layer with Dulbecco's phosphate buffered saline (DBPS) buffer by adding the DPBS to the side of the vessel opposite the attached cell layer and rocking the vessel back and forth several times; iii) remove the DPBS by aspiration and discard; iv) detach the cells by adding a sufficient volume of pre-warmed trypsin-EDTA solution without phenol red to cover the cell layer; v) incubate at 37°C. for approximately 7 minutes; vi) observe the cells under a microscope to determine if additional incubation is needed; vii) add 3mL of the maintenance media to the plate, mix the cell suspension, add the suspension to a 15mL centrifuge tube and centrifuge at 210g for 5 minutes; viii) determine the total
number of cells and percent viability using a hemacytometer; ix) add Complete
MesenPRO RS medium to each vessel so that the final culture volume is 0.2mL —
0.5mL per cm2; x) seed the cells by adding the appropriate volume of cells to each vessel and incubate at 37°C., 5% CO2 and 90% humidity; and xi) three or four days after seeding, completely remove the medium and replace with an equal volume of Complete MesenPRO RS medium.

[0152] Before seeding the passaged hADSCs on fresh culture plates, the
surfaces of the culture ware are washed with sterile DPBS solution three times,
followed by multiple rinses with sterile water. The first layer of coating is poly-L-
ornithine. The coating is prepared by adding about 15 ถึงประมาณ 20 ❑g/mL of poly-L-
ornithine and incubating at 37°C. for one hour. The plate is washed three times with
DPBS, 15 minutes per wash. The second layer of coating is bovine plasma fibronectin. The fibronectin is diluted in DPBS from stock to 1:1000 and 500 pL is added to each well. The plate is left at room temperature for one hour. One final wash with 500 pL per well of DPBS is performed and the plate is used immediately.
[0153] The cells were then subjected to removal and reseeded at a density of 2x104 cells/ml (1x104 cells/well) onto 24-well culture plates that contained a poly-L-
ornithine and bovine plasma fibronectin coating.
[0154] Three days after seeding and priming; the culture medium was changed into neuronal differentiation medium. The culture plates were removed from the
incubator and all procedures were conducted in a laminar flow hood. The culture
medium was completely removed from each well. The hADSCs were then washed with sterile DPBS solution in an amount of about 1 ml per well, to remove excess culture medium. The DPBS solution was removed and replaced with neuronal differentiation medium. The formulation of the neuronal differentiation medium is such that
การสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่ would be attributed to the nutrient and not to the medium. The neuronal differentiation medium used was NeurobasalTM Medium, available from Invitrogen®, which ประกอบรวมด้วย the following ingredients listed below in Table 1.
Table 1: NeurobasalTM Medium
Components Molecular Concentration mM
Vitamins
Choline chloride 140 4 0.0286
D-Calcium pantothenate 477 4 0.00839
Folic Acid 441 4 0.00907
Niacinamide 122 4 0.0328
Pyridoxine hydrochloride 204 4 0.0196
Riboflavin 376 0.4 0.00106
Thiamine hydrochloride 337 4 0.0119
Vitamin B12 1355 0.0068 0.000005
i-Inositol 180 7.2 0.04
Inorganic Salts
Calcium Chloride (CaCl2) (anhyd.) 111 200 1.8
Ferric Nitrate (Fe(NO3)3"9H20) 404 0.1 0.000248
Magnesium Chloride (anhydrous) 95 77.3 0.814
Potassium Chloride (KCI) 75 400 5.33
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) 84 2200 26.19
Sodium Chloride (NaCI) 58 3000 51.72
Sodium Phosphate monobasic 138 125 0.906
(NaH2PO4-H20)
ซิงค์ sulfate (ZnSO4-7H20) 288 0.194 0.000674
Other Components
D-Glucose (Dextrose) 180 4500 25
HEPES 238 2600 10.92
Sodium Pyruvate 110 25 0.227







34
[0155] ALA was added to individual wells at various concentrations in the serum-
free medium. Pre-warmed serum-free medium contains Neural Basal medium with L-
glutamine, 20 ng/mL of bFGF, 20 ng/mL of EGF and N2 supplement. See Table 2
below.
Table 2. N2 Supplement.
Components Molecular Weight Concentration mM
(mg/L)
Proteins
Human transferrin (Holo) 10000 10000 1
Insulin recombinant full chain 5807.7 500 0.0861
Other components
Progesterone 314.47 0.63 0.002
Putrescine 161 1611 10.01
selenite 173 0.52 0.00301


[0156] Treatments of ALA was tested at a concentration of 5 lag/ml. ALA was
tested individually and compared to the positive control, DHA at 20 pM, and the
negative control (no treatment) under phase contrast microscopy at 3 hours and 24 hours. The experiments were repeated in triplicate.
[0157] After images were collected, data analysis and comparison was made to determine the effectiveness of ALA in promoting การสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่. Neuronal differentiation is determined by neuronal morphology. Some of these changes include shrinkage of the cytoplasm, and formation of axons and dendrite-like cytoplasmic projections
(neurites). These changes begin with the cytoplasm of hADSCs retracting towards the nucleus to form contracted cell bodies with cytoplasmic extensions. Cells eventually develop a morphology that resembles bi-polar, tri-polar and multi-polar neuronal cells. See Figs. 1A and 1B.
[0158] Generally, if the hADSCs display neuronal morphology this result is attributed to the การสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่ capability of the neurologic component added, in this example ALA. For example, the hADSCs in the control wells with no treatment
maintained their putative morphology as large, flat and spread cells on the culture surface, suggesting no obvious การสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่. See. รูป 2A.
[0159] Noticeably, among the additions of ALA at 5 lag/ml demonstrated a strong effect to enhance การสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่ as shown by the neuronal morphology displayed by the
hADSCs in Figure. 2C. In light of these results, it was determined that ALA can serve as a naturally-occurring nutrient that possesses การสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่ actions. The addition of ALA, also promoted การสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่ when compared to the negative control. As
illustrated, in รูป 2C, ALA at a concentration of 5 pg/ml demonstrated การสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่, showing extensive neurite outgrowth, shrinkage of cytoplasm and neuronal
differentiation of the hADSCs.
[0160] The additions of DHA at 20pM to hADSCs as a positive control enhanced neuronal morphology of hADSCs when compared to the negative control. Further, in the presence of DHA at 20pM, a few of the hADSCs changed dramatically from their putative morphology into neuronal cell morphology as the cytoplasm shrank and
neurities began to protrude from the hADSCs. See รูป 2B.
[0161] Moreover, as can be seen from comparing รูป 2B, cells treated with
DHA, to รูป 2C, cells treated with ALA, the hADSCs treated with ALA showed obvious neuronal changes in terms of morphology, suggesting that ALA may have different
การสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่ pattern from that of DHA. ALA displayed a robust ability to promote
การสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่ in terms of neurite outgrowth when compared with DHA. Further, the neurite outgrowth produced by the treatment of ALA shows neurite extensions
connecting with other neurite extensions to form neuronal network like structures. Thus ALA robustly promotes การสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่.
[0162] Moreover wells treated with ALA displayed less cell death overall, as
compared to DHA, suggesting that ALA promotes การสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่ robustly while having lower cellular toxicity. Compare รูป 2B to รูป 2C.
FORMULATION EXAMPLES
[0163] Table 1 provides an example embodiment of a neurologic component that may be incorporated or added to the nutritional compositions described herein. This example provides the amount of each ingredient to be included per 100kcal serving of nutritional composition.
Table 1. Nutrition profile of an example neurologic component
per 100 kcal
Nutrient
Minimum Maximum
ALA (mg) 3.7 37
ซิงค์ Sulfate (mg) 0.1 2
อัลลิล Sulfide (mg) 1 170







36

อัลลิล ไดซัลไฟด์ (mg) 1 200
ซัลโฟราเฟน (mg) 1.5 7.5
แลคโตเฟอร์ริน (mg) 10 250


[0164] Table 2 provides an example embodiment of a nutritional composition
according to the การเปิดเผยนี้ and describes the amount of each ingredient to be included per 100 kcal serving.
Table 2. Nutrition profile of an example nutritional composition
per 100 kcal
Nutrient

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

hADSCs [0150] ซื้อจาก Invitrogen หรือที่เรียกว่าชีวิตเทคโนโลยี คาร์ลส CA สหรัฐอเมริกา และอ่างเป็นใกล้ confluentmonolayers ในแผ่นวัฒนธรรม 100 มม.ภายในสื่อบำรุงรักษาประกอบด้วยขนาดกลาง MesenPro RS สมบูรณ์เสริมการเจริญเติบโตและได้รับจาก Invitrogen ® glutamine L กระบวนการ culturing กาล และเมล็ด hADSCs จะอธิบายได้ดังนี้[0151] วัฒนธรรมของ hADSCs ทำการเพาะเลี้ยงเซลล์ถึง บรรจบกัน ให้พาส hADSCs ขั้นตอนต่อไปนี้ใช้: ฉัน) aspirate MesenPRO RS ขนาดกลางที่สมบูรณ์จากเซลล์ ii) ล้างพื้นที่ผิวของชั้นเซลล์กับฟอสเฟตของดุลเบกโก buffered saline บัฟเฟอร์ (DBPS) โดยการเพิ่ม DPBS ที่ข้างเรือตรงข้ามชั้นเซลล์แนบ และโยกไปมาหลายครั้ง เรือ iii) เอา DPBS ด้วยความใฝ่ฝันและละทิ้ง iv) เซลล์แยกออก โดยการเพิ่มปริมาณที่เพียงพอของทริปซิน EDTA warmed ก่อนโดยวางแดงกลบชั้นเซลล์ v) ฟักที่ 37 องศาเซลเซียส ประมาณ 7 นาที vi) สังเกตเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์การตรวจสอบถ้าบ่มเพิ่มเติมเป็นสิ่งจำเป็น vii) เพิ่ม 3 mL บำรุงรักษาสื่อจาน ผสมระงับเซลล์ เพิ่มการระงับ 15 mL หลอดเครื่องหมุนเหวี่ยงและเครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 210 g 5 นาที viii) กำหนดรวม จำนวนของเซลล์และใช้ hemacytometer ชีวิตร้อยละ ix) เพิ่มเสร็จสมบูรณ์ MesenPRO RS ปานกลางถึงเรือแต่ละเพื่อให้สุดท้ายวัฒนธรรมเสียงเป็น 0.2mL —0.5mL per cm2; x) seed the cells by adding the appropriate volume of cells to each vessel and incubate at 37°C., 5% CO2 and 90% humidity; and xi) three or four days after seeding, completely remove the medium and replace with an equal volume of Complete MesenPRO RS medium.[0152] Before seeding the passaged hADSCs on fresh culture plates, thesurfaces of the culture ware are washed with sterile DPBS solution three times,followed by multiple rinses with sterile water. The first layer of coating is poly-L-ornithine. The coating is prepared by adding about 15 ถึงประมาณ 20 ❑g/mL of poly-L-ornithine and incubating at 37°C. for one hour. The plate is washed three times withDPBS, 15 minutes per wash. The second layer of coating is bovine plasma fibronectin. The fibronectin is diluted in DPBS from stock to 1:1000 and 500 pL is added to each well. The plate is left at room temperature for one hour. One final wash with 500 pL per well of DPBS is performed and the plate is used immediately.[0153] The cells were then subjected to removal and reseeded at a density of 2x104 cells/ml (1x104 cells/well) onto 24-well culture plates that contained a poly-L-ornithine and bovine plasma fibronectin coating.[0154] Three days after seeding and priming; the culture medium was changed into neuronal differentiation medium. The culture plates were removed from the incubator and all procedures were conducted in a laminar flow hood. The culture medium was completely removed from each well. The hADSCs were then washed with sterile DPBS solution in an amount of about 1 ml per well, to remove excess culture medium. The DPBS solution was removed and replaced with neuronal differentiation medium. The formulation of the neuronal differentiation medium is such that
การสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่ would be attributed to the nutrient and not to the medium. The neuronal differentiation medium used was NeurobasalTM Medium, available from Invitrogen®, which ประกอบรวมด้วย the following ingredients listed below in Table 1.
Table 1: NeurobasalTM Medium
Components Molecular Concentration mM
Vitamins
Choline chloride 140 4 0.0286
D-Calcium pantothenate 477 4 0.00839
Folic Acid 441 4 0.00907
Niacinamide 122 4 0.0328
Pyridoxine hydrochloride 204 4 0.0196
Riboflavin 376 0.4 0.00106
Thiamine hydrochloride 337 4 0.0119
Vitamin B12 1355 0.0068 0.000005
i-Inositol 180 7.2 0.04
Inorganic Salts
Calcium Chloride (CaCl2) (anhyd.) 111 200 1.8
Ferric Nitrate (Fe(NO3)3"9H20) 404 0.1 0.000248
Magnesium Chloride (anhydrous) 95 77.3 0.814
Potassium Chloride (KCI) 75 400 5.33
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) 84 2200 26.19
Sodium Chloride (NaCI) 58 3000 51.72
Sodium Phosphate monobasic 138 125 0.906
(NaH2PO4-H20)
ซิงค์ sulfate (ZnSO4-7H20) 288 0.194 0.000674
Other Components
D-Glucose (Dextrose) 180 4500 25
HEPES 238 2600 10.92
Sodium Pyruvate 110 25 0.227







34
[0155] ALA was added to individual wells at various concentrations in the serum-
free medium. Pre-warmed serum-free medium contains Neural Basal medium with L-
glutamine, 20 ng/mL of bFGF, 20 ng/mL of EGF and N2 supplement. See Table 2
below.
Table 2. N2 Supplement.
Components Molecular Weight Concentration mM
(mg/L)
Proteins
Human transferrin (Holo) 10000 10000 1
Insulin recombinant full chain 5807.7 500 0.0861
Other components
Progesterone 314.47 0.63 0.002
Putrescine 161 1611 10.01
selenite 173 0.52 0.00301


[0156] Treatments of ALA was tested at a concentration of 5 lag/ml. ALA was
tested individually and compared to the positive control, DHA at 20 pM, and the
negative control (no treatment) under phase contrast microscopy at 3 hours and 24 hours. The experiments were repeated in triplicate.
[0157] After images were collected, data analysis and comparison was made to determine the effectiveness of ALA in promoting การสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่. Neuronal differentiation is determined by neuronal morphology. Some of these changes include shrinkage of the cytoplasm, and formation of axons and dendrite-like cytoplasmic projections
(neurites). These changes begin with the cytoplasm of hADSCs retracting towards the nucleus to form contracted cell bodies with cytoplasmic extensions. Cells eventually develop a morphology that resembles bi-polar, tri-polar and multi-polar neuronal cells. See Figs. 1A and 1B.
[0158] Generally, if the hADSCs display neuronal morphology this result is attributed to the การสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่ capability of the neurologic component added, in this example ALA. For example, the hADSCs in the control wells with no treatment
maintained their putative morphology as large, flat and spread cells on the culture surface, suggesting no obvious การสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่. See. รูป 2A.
[0159] Noticeably, among the additions of ALA at 5 lag/ml demonstrated a strong effect to enhance การสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่ as shown by the neuronal morphology displayed by the
hADSCs in Figure. 2C. In light of these results, it was determined that ALA can serve as a naturally-occurring nutrient that possesses การสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่ actions. The addition of ALA, also promoted การสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่ when compared to the negative control. As
illustrated, in รูป 2C, ALA at a concentration of 5 pg/ml demonstrated การสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่, showing extensive neurite outgrowth, shrinkage of cytoplasm and neuronal
differentiation of the hADSCs.
[0160] The additions of DHA at 20pM to hADSCs as a positive control enhanced neuronal morphology of hADSCs when compared to the negative control. Further, in the presence of DHA at 20pM, a few of the hADSCs changed dramatically from their putative morphology into neuronal cell morphology as the cytoplasm shrank and
neurities began to protrude from the hADSCs. See รูป 2B.
[0161] Moreover, as can be seen from comparing รูป 2B, cells treated with
DHA, to รูป 2C, cells treated with ALA, the hADSCs treated with ALA showed obvious neuronal changes in terms of morphology, suggesting that ALA may have different
การสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่ pattern from that of DHA. ALA displayed a robust ability to promote
การสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่ in terms of neurite outgrowth when compared with DHA. Further, the neurite outgrowth produced by the treatment of ALA shows neurite extensions
connecting with other neurite extensions to form neuronal network like structures. Thus ALA robustly promotes การสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่.
[0162] Moreover wells treated with ALA displayed less cell death overall, as
compared to DHA, suggesting that ALA promotes การสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่ robustly while having lower cellular toxicity. Compare รูป 2B to รูป 2C.
FORMULATION EXAMPLES
[0163] Table 1 provides an example embodiment of a neurologic component that may be incorporated or added to the nutritional compositions described herein. This example provides the amount of each ingredient to be included per 100kcal serving of nutritional composition.
Table 1. Nutrition profile of an example neurologic component
per 100 kcal
Nutrient
Minimum Maximum
ALA (mg) 3.7 37
ซิงค์ Sulfate (mg) 0.1 2
อัลลิล Sulfide (mg) 1 170







36

อัลลิล ไดซัลไฟด์ (mg) 1 200
ซัลโฟราเฟน (mg) 1.5 7.5
แลคโตเฟอร์ริน (mg) 10 250


[0164] Table 2 provides an example embodiment of a nutritional composition
according to the การเปิดเผยนี้ and describes the amount of each ingredient to be included per 100 kcal serving.
Table 2. Nutrition profile of an example nutritional composition
per 100 kcal
Nutrient

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

[0150] hADSCs ที่ซื้อมาจาก Invitrogen
ยังเป็นที่รู้จักชีวิตเทคโนโลยีของคาร์ลส, CA, USA และเพาะเลี้ยงที่ใกล้ไหลมารวมกัน
monolayers ใน 100mm
แผ่นวัฒนธรรมภายในสื่อการบำรุงรักษาที่ประกอบด้วยสื่อที่สมบูรณ์MesenPro อาร์เอสที่มีการเสริมการเจริญเติบโตและ L-glutamine ที่ได้รับจากInvitrogen® กระบวนการของการเพาะเลี้ยงทางเดินและการเพาะ hADSCs จะอธิบายไว้ด้านล่าง.
[0151] ที่วัฒนธรรมของ hADSCs
ได้ดำเนินการเพาะเลี้ยงเซลล์เมื่อถึงจุดบรรจบ เพื่อ hADSCs ผ่านขั้นตอนต่อไปนี้จะใช้ i)
ดูดกลางที่สมบูรณ์MesenPRO อาร์เอสมาจากเซลล์; ii) การล้างพื้นที่ผิวของชั้นเซลล์ที่มีฟอสเฟต Dulbecco ของน้ำเกลือบัฟเฟอร์ (DBPs) โดยการเพิ่มบัฟเฟอร์ DPBS ไปทางด้านตรงข้ามของเรือชั้นเซลล์ที่แนบมาและโยกเรือไปมาหลายครั้ง; iii) การลบ DPBS โดยความทะเยอทะยานและทิ้ง; iv) การแยกเซลล์โดยการเพิ่มปริมาณเพียงพอก่อนการแก้ปัญหาความอบอุ่น trypsin-EDTA โดยไม่ต้องสีแดงฟีนอลที่จะครอบคลุมชั้นเซลล์; V) ฟักที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ประมาณ 7 นาที; vi) การสังเกตเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์เพื่อตรวจสอบว่าการบ่มเพิ่มเติมเป็นสิ่งจำเป็น; vii) เพิ่ม 3ml ของสื่อการบำรุงรักษาแผ่นผสมเซลล์แขวนลอยเพิ่มการระงับการหลอด centrifuge 15ml และหมุนเหวี่ยงที่ 210 กรัมเป็นเวลา 5 นาที viii)
กำหนดรวมจำนวนของเซลล์และมีศักยภาพในการใช้ร้อยละhemacytometer นั้น ix)
เพิ่มสมบูรณ์กลางMesenPRO RS เรือแต่ละเพื่อให้ปริมาณวัฒนธรรมสุดท้ายคือ 0.2mL -
0.5mL ต่อ cm2; x) เมล็ดพันธุ์เซลล์โดยการเพิ่มปริมาณที่เหมาะสมของเซลล์แต่ละเรือและฟักไข่ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส, CO2 5% และความชื้น 90%. และจิน) สามหรือสี่วันหลังจากการเพาะสมบูรณ์ลบกลางและแทนที่ด้วยปริมาณที่เท่ากันของกลางที่สมบูรณ์ MesenPRO อาร์เอส. [0152] ก่อนที่จะเพาะ hADSCs passaged บนจานวัฒนธรรมสดพื้นผิวของเครื่องวัฒนธรรมที่มีการล้างด้วยDPBS ผ่านการฆ่าเชื้อ วิธีการแก้ปัญหาสามครั้งตามด้วยการล้างหลายน้ำหมัน ชั้นแรกของการเคลือบเป็นโพลี L- ornithine เคลือบที่เตรียมไว้โดยการเพิ่มประมาณ 15 ถึงประมาณ 20 ❑g / มิลลิลิตรโพลี L- ornithine และบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลาหนึ่งชั่วโมง แผ่นล้างสามครั้งด้วยDPBS 15 นาทีต่อการซัก ชั้นที่สองของการเคลือบเป็น fibronectin พลาสม่าวัว fibronectin จะเจือจางใน DPBS จากสต็อก 1: 1,000 และ 500 PL จะถูกเพิ่มไปละกัน แผ่นถูกทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลาหนึ่งชั่วโมง ล้างสุดท้ายกับ 500 PL ต่อกันดีของ DPBS จะดำเนินการและแผ่นที่มีการใช้งานได้ทันที. [0153] เซลล์จากนั้นก็อยู่ภายใต้การขนย้ายและการ reseeded ความหนาแน่น 2x104 เซลล์ / มิลลิลิตร (1x104 cells / ดี) เข้าสู่วัฒนธรรม 24 หลุม แผ่นที่ประกอบด้วยโพลี L- ornithine และพลาสม่าวัวเคลือบ fibronectin. [0154] สามวันหลังจากการเพาะและรองพื้น; อาหารเลี้ยงเชื้อที่ถูกเปลี่ยนเป็นสื่อกลางในความแตกต่างของเส้นประสาท แผ่นวัฒนธรรมที่ถูกถอดออกจากศูนย์บ่มเพาะและทุกขั้นตอนได้ดำเนินการในเครื่องดูดควันไหล วัฒนธรรมกลางจะถูกลบออกจากกันอย่างสมบูรณ์ดี hADSCs ถูกล้างแล้วกับการแก้ปัญหา DPBS หมันจำนวนประมาณ 1 มิลลิลิตรต่อกันในการลบกลางวัฒนธรรมส่วนเกิน วิธีการแก้ปัญหา DPBS ถูกลบออกไปและแทนที่ด้วยความแตกต่างของสื่อประสาท สูตรของกลางความแตกต่างของเส้นประสาทเป็นเช่นนั้นการสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่จะนำมาประกอบกับสารอาหารและไม่ให้สื่อ สื่อที่แตกต่างของเส้นประสาทที่ใช้เป็น NeurobasalTM กลางสามารถใช้ได้จากInvitrogen®ซึ่งประกอบรวมด้วยส่วนผสมที่ระบุไว้ด้านล่างต่อไปนี้ในตารางที่ 1 ตารางที่ 1: NeurobasalTM กลางส่วนประกอบของโมเลกุลเข้มข้นมิลลิวิตามินโคลีนคลอไรด์140 4 0.0286 D-แคลเซียมแพนโทธี 477 4 0.00839 โฟลิก กรด 441 4 0.00907 Niacinamide 122 4 0.0328 Pyridoxine ไฮโดรคลอไร 204 4 0.0196 Riboflavin 376 0.4 0.00106 ไฮโดรคลอไรวิตามินบี 337 4 0.0119 วิตามินบี 12 1355 0.0068 0.000005 ฉัน Inositol 180 7.2 0.04 เกลือนินทรีย์แคลเซียมคลอไรด์ (CaCl2) (Anhyd.) 111 200 1.8 Ferric ไนเตรต ( เฟ (NO3) 3 "9H20) 404 0.1 0.000248 แมกนีเซียมคลอไรด์ (ปราศจากน้ำ) 95 77.3 0.814 โพแทสเซียมคลอไรด์ (KCI) 75 400 5.33 โซเดียมไบคาร์บอเนต (NaHCO3) 84 2200 26.19 โซเดียมคลอไรด์ (NaCI) 58 3000 51.72 โซเดียมฟอสเฟต monobasic 138 125 .906 ( NaH2PO4-H20) ซิงค์ซัลเฟต (ZnSO4-7H20) 288 .194 0.000674 ส่วนประกอบอื่น ๆD-กลูโคส (Dextrose) 180 4500 25 HEPES 238 2600 10.92 โซเดียมไพรู 110 25 .227 34 [0155] ALA ถูกบันทึกอยู่ในหลุมที่ระดับความเข้มข้นของแต่ละบุคคลต่าง ๆ ในซีรั่ม - ขนาดกลางฟรี เซรั่มขนาดกลางฟรี Pre-อุ่นมีสื่อประสาทที่มีฐาน L- กลูตา 20 นาโนกรัม / มิลลิลิตร bFGF 20 นาโนกรัม / มิลลิลิตร EGF N2 และอาหารเสริม ดูตารางที่ 2 ด้านล่าง. ตารางที่ 2 N2 เสริม. ส่วนประกอบน้ำหนักโมเลกุลมิลลิเข้มข้น(mg / L) โปรตีนมนุษย์ transferrin (Holo) 10000 10000 1 อินซูลินห่วงโซ่เต็ม recombinant 5,807.7 500 0.0861 ส่วนประกอบอื่น ๆProgesterone 314.47 0.63 0.002 putrescine 161 1611 10.01 ยิบ 173 0.52 0.00301 [0156] การรักษา ALA ได้รับการทดสอบที่ความเข้มข้น 5 ล่าช้า / มิลลิลิตร ALA ได้รับการทดสอบเป็นรายบุคคลและเมื่อเทียบกับการควบคุมในเชิงบวกดีเอชเอที่20 PM, และการควบคุมลบ(ไม่มีการรักษา) ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ตรงกันข้ามเฟสที่ 3 ชั่วโมงและ 24 ชั่วโมง การทดลองซ้ำในเพิ่มขึ้นสามเท่า. [0157] หลังจากที่ภาพถูกเก็บรวบรวมและการวิเคราะห์ข้อมูลและการเปรียบเทียบถูกสร้างขึ้นมาเพื่อตรวจสอบประสิทธิภาพของ ALA ในการส่งเสริมการสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่ ความแตกต่างของเส้นประสาทจะถูกกำหนดโดยลักษณะทางสัณฐานวิทยาของเซลล์ประสาท บางส่วนของการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้รวมถึงการหดตัวของพลาสซึมและการก่อตัวของซอนและประสาทเหมือนประมาณการนิวเคลียส(neurites) การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้เริ่มต้นด้วยพลาสซึมของ hADSCs งุ้มไปสู่นิวเคลียสในรูปแบบหดร่างกายของเซลล์ที่มีนามสกุลนิวเคลียส เซลล์ในที่สุดก็พัฒนาลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่มีลักษณะสองขั้วไตรขั้วโลกและเซลล์หลายขั้วโลก ดูมะเดื่อ 1A และ 1B. [0158] โดยทั่วไปถ้า hADSCs แสดงลักษณะทางสัณฐานวิทยาประสาทผลนี้มีสาเหตุมาจากการสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่สามารถขององค์ประกอบทางระบบประสาทที่เพิ่มในตัวอย่าง ALA นี้ ยกตัวอย่างเช่น hADSCs ในหลุมควบคุมที่มีการรักษาไม่มีการบำรุงรักษาสัณฐานสมมุติของพวกเขาที่มีขนาดใหญ่แบนและการแพร่กระจายของเซลล์บนพื้นผิววัฒนธรรมบอกชัดเจนไม่มีการสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่ ดู. รูป 2A. [0159] เห็นได้ชัดในหมู่เพิ่มเติมของ ALA ที่ 5 ล่าช้า / ml แสดงให้เห็นถึงผลกระทบที่แข็งแกร่งเพื่อเพิ่มการสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่ตามที่แสดงโดยลักษณะทางสัณฐานวิทยาของเซลล์ประสาทแสดงโดยhADSCs ในรูป 2C ในแง่ของผลการเหล่านี้มันก็ตั้งใจว่า ALA สามารถทำหน้าที่เป็นสารอาหารธรรมชาติที่เกิดขึ้นที่มีการสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่การกระทำ นอกจากนี้ ALA ยังการส่งเสริมการสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่เมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุมเชิงลบ ในฐานะที่แสดงในรูป 2C, ALA ที่ความเข้มข้น 5 pg / ml แสดงให้เห็นถึงการสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่แสดงให้เห็นผลพลอยได้ neurite กว้างขวาง, การหดตัวของพลาสซึมและเส้นประสาทแตกต่างของhADSCs ได้. [0160] เพิ่มเติมของดีเอชเอที่ 20pM เพื่อ hADSCs เป็นตัวควบคุมบวกเพิ่มสัณฐานวิทยาของเส้นประสาท hADSCs เมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุมเชิงลบ นอกจากนี้ในการปรากฏตัวของดีเอชเอที่ 20pM ไม่กี่ของ hADSCs การเปลี่ยนแปลงอย่างรวดเร็วจากสัณฐานสมมุติของพวกเขาในการเปลี่ยนรูปร่างของเซลล์ประสาทเป็นพลาสซึมหดตัวและneurities เริ่มที่จะยื่นออกมาจาก hADSCs ดูรูป 2B. [0161] นอกจากนี้ยังเป็นสามารถเห็นได้จากการเปรียบเทียบรูป 2B เซลล์รับการรักษาด้วยDHA เพื่อรูป 2C เซลล์รับการรักษาด้วย ALA, hADSCs ที่ได้รับ ALA แสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงของเซลล์ประสาทที่เห็นได้ชัดในแง่ของลักษณะทางสัณฐานวิทยาบอกว่า ALA อาจ ที่แตกต่างกันมีการสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่รูปแบบจากที่ของดีเอชเอ ALA แสดงความสามารถที่มีประสิทธิภาพในการส่งเสริมการสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่ในแง่ของผลพลอยได้neurite เมื่อเปรียบเทียบกับดีเอชเอ นอกจากนี้ผลพลอยได้ neurite ผลิตโดยการรักษา ALA แสดงนามสกุล neurite การเชื่อมต่อกับส่วนขยาย neurite อื่น ๆ ในรูปแบบเครือข่ายเส้นประสาทเช่นโครงสร้าง ดังนั้น ALA ทนทานส่งเสริมการสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่. [0162] หลุมนอกจากนี้การรักษาด้วย ALA แสดงการตายของเซลล์น้อยลงโดยรวมเมื่อเทียบกับดีเอชเอบอกว่าALA ส่งเสริมการสร้างเซลล์ประสาทขึ้นใหม่แข็งแกร่งในขณะที่มีความเป็นพิษต่ำกว่าโทรศัพท์มือถือ เปรียบเทียบรูป 2B เพื่อรูป 2C. ตัวอย่างการพัฒนาสูตร[0163] ตารางที่ 1 ให้เป็นศูนย์รวมตัวอย่างขององค์ประกอบทางระบบประสาทที่อาจจะรวมหรือเพิ่มองค์ประกอบทางโภชนาการบรรยายในที่นี้ ตัวอย่างนี้มีปริมาณของส่วนผสมแต่ละที่จะรวม 100kcal ต่อการให้บริการขององค์ประกอบทางโภชนาการ. ตารางที่ 1 รายละเอียดโภชนาการขององค์ประกอบทางระบบประสาทเช่นต่อ100 กิโลแคลอรีสารอาหารน้อยกว่าไม่เกินALA (มก.) 3.7 37 ซิงค์ซัลเฟต (มก.) 0.1 2 อัลลิ ลซัลไฟด์ (มก.) 1 170 36 อัลลิลไดซัลไฟด์ (มก.) 1 200 ซัลโฟราเฟน (มก.) 1.5 7.5 แลคโตเฟอร์ริน (มก.) 10 250 [0164] ตารางที่ 2 ให้ ตัวอย่างเช่นศูนย์รวมขององค์ประกอบทางโภชนาการตามการเปิดเผยนี้และอธิบายถึงปริมาณของส่วนผสมแต่ละที่จะถูกรวม100 กิโลแคลอรีต่อการให้บริการ. ตารางที่ 2 รายละเอียดของโภชนาการตัวอย่างองค์ประกอบทางโภชนาการต่อ100 กิโลแคลอรีสารอาหาร

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

[ 0150 ] hadscs ซื้อจาก Invitrogen เรียกว่าชีวิต
เทคโนโลยีของ Carlsbad , CA , USA และถูกเลี้ยงเป็นใกล้กระจู๋กระจี๋
monolayers ในจานเพาะ 100 มม. ภายในการบำรุงรักษาสื่อประกอบด้วย
สมบูรณ์ mesenpro RS กลางกับเสริมการเจริญเติบโตและ Glutamine ได้จาก Invitrogen ® . กระบวนการของการเพาะเลี้ยง , ทางเดิน , และเมล็ด hadscs
อธิบายด้านล่าง[ 0151 ] วัฒนธรรมย่อยของ hadscs ได้เมื่อเพาะเลี้ยงเซลล์ถึง
บรรจบกัน ไปทาง hadscs ขั้นตอนต่อไปนี้จะใช้ : I )
mesenpro RS หรือสื่อสมบูรณ์จากเซลล์2 ) ล้างพื้นที่ผิวของชั้นเซลล์กับดัลเบโค่ของฟอสเฟตในน้ำเกลือ ( dbps ) บัฟเฟอร์โดยเพิ่ม dpbs กับด้านข้างของเรือตรงข้ามแนบชั้นเซลล์หลอดเลือด และโยกไปมาหลายครั้ง ; 3 ) เอา dpbs โดยปณิธานและละทิ้ง ;4 ) แยกเซลล์โดยการเพิ่มปริมาณเพียงพอของก่อนออกทริป EDTA สารละลายฟีนอลเรดโดยไม่ครอบคลุมชั้นเซลล์ ; V ) บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศา ประมาณ 7 นาที ; 6 ) สังเกตเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์เพื่อตรวจสอบหากพบเพิ่มเติมคือ ต้อง ม. 7 ) เพิ่มในการบำรุงรักษาสื่อกับจาน การผสมเซลล์ระงับเพิ่มระบบกันสะเทือน เพื่อเหวี่ยงและทาหลอด centrifuge ที่ 210g 5 นาที ; 8 ) ตรวจสอบจำนวนและร้อยละของ
เซลล์โดยใช้ hemacytometer ; 9 ) เพิ่มให้
mesenpro RS กลางแต่ละภาชนะเพื่อให้สุดท้ายวัฒนธรรมปริมาณ 0.2ml -
0.5ml ต่อ CM2 ; x ) เมล็ดเซลล์โดยการเพิ่ม ปริมาณที่เหมาะสมของเซลล์ แต่ละเรือและบ่มที่ 37 ° C ,คาร์บอนไดออกไซด์ 5% และความชื้น 90% และ Xi ) สามหรือสี่วัน น้ำหนักลบปานกลาง และแทนที่ ด้วยปริมาณเท่ากัน mesenpro RS สมบูรณ์ปานกลาง ลา

[ ] ก่อนที่เมล็ด passaged hadscs สดวัฒนธรรมแผ่น
พื้นผิวของสินค้าวัฒนธรรมจะถูกล้างด้วยโซลูชั่น dpbs หมันสามครั้ง
ตามด้วย , rinses หลายกับน้ำหมันชั้นแรกของการเคลือบ poly-l -
ออร์นิทีน . เคลือบที่เตรียมไว้ โดยการเพิ่มประมาณ 15 ถึงประมาณ 20 ❑ g / ml และ poly-l -
ออร์นิทีน เพาะที่อุณหภูมิ 37 องศา เป็นเวลาหนึ่งชั่วโมง จานถูกล้างสามครั้งด้วย
dpbs 15 นาทีต่อซัก ชั้นที่สองของโคพลาสม่าเคลือบไฟโบรเนกติน . ส่วนไฟโบรเนกตินจะเจือจางใน dpbs จาก 500 000 หุ้นและคุณเพิ่มแต่ละครั้งได้อีกด้วยจานไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมง หนึ่งล้างครั้งสุดท้ายกับคุณต่อ 500 ดี dpbs จะดําเนินการและจานใช้ทันที เครื่อง
[ ] เซลล์แล้วต้องถอดและ reseeded ที่ความหนาแน่นของ 2x104 เซลล์ / มิลลิลิตร ( 1x104 เซลล์ / ดี ) ลงบนแผ่น 24 ดีวัฒนธรรมที่อยู่ poly-l -
ออร์นิทีนโคพลาสมาและไฟโบรเนกตินเคลือบ