Evaluation of inhibitory effect on

Evaluation of inhibitory effect on human low
density lipoprotein peroxidation
The assay was performed following the method
of Dillon with slight modification [14]. The
procedure included LDL isolation, LDL oxidation
and TBARS assay. The use of human whole
blood in this study was approved by the Ethics
Committee of the Universiti Kebangsaan
Malaysia (approval no. FF-120-2007), following
the International Ethical Guidelines for
Biomedical Research Involving Human Subjects
(CIOMS and WHO) [15]. Whole blood was drawn
from the vein of healthy volunteers aged between
24 and 70 years who were normolipidemic, nonsmoking,
had not taken any medications and
supplements within the last two weeks and also
claimed they fasted for 8 h, prior to blood
withdrawal.
For LDL isolation, 9 ml of the blood was added
into 1 ml of 3.8 % (w/v) sodium citrate (Merck,
Darmstadt, Germany) solution as an
anticoagulant, then centrifuged at 2,000 g for 20
min to separate plasma. The plasma (3.2 ml)
was mixed well with 0.8 ml of OptiprepTM (60 %
iodixanol) (Sigma Chemical Co.) as the density
gradient medium to give a final iodixanol
concentration of 12 % (v/v). This mixture was
added in to 8.9 ml OptisealTM tube, then
carefully added 4 ml of 6 % iodixanol in saline,
after that topped up with 0.9 ml of saline. The
tube was ultracentrifuged at 402,000 times
gravity (g), 16 °C for 3 h 10 min using the Ti.70.1
rotor. The subfractions of lipoprotein: highdensity
lipoprotein (HDL), low-density lipoprotein
(LDL) and very low-density lipoprotein (VLDL)
was obtained. LDL was characterized by
measuring the amount of protein by using Bovine
serum albumin (Protein kit Sigma Chemical Co.)
as a standard. The purity of LDL was measured
by using electrophoresis. Agarose gel (Bio-Rad,
USA) was used as solid support in
electrophoresis. Samples were electrophoresed
at a constant 45 mA/gel for 45 min, then oven
dried at 85 °C for 20 min and stained with Sudan
Black (Sigma,USA). The band was visually
observed under UV detector. Then, LDL was
diluted with phosphate buffer saline (PBS) (pH
7.4) to a final concentration of 200 μg protein/ml
before oxidation testing.
For oxidation of LDL, the reaction was initiated
by adding freshly prepared 10 μM CuSO4
(Sigma, USA) solution. The samples were
dissolved in DMSO to obtain serial
concentrations of 1.25, 0.63, 0.31, 0.16 and 0.08
μg/μl. Five μl of the samples were added to a
cuvete containing 945 μl of LDL, 50 μl of 10 μM
CuSO4 and incubated at 37 °C for 5 h. The final
concentrations of the extracts in the mixture were
6.25, 3.13, 1.56, 0.78 and 0.39 μg/ml. 0.5 %
DMSO was used as control and blank while
probucol (Sigma, USA) was used as the positive
control. The oxidation of LDL was terminated by
rapid freezing and kept at -20 °C with no longer
than 24 h.
For thiobarbituric reactive substances (TBARS)
assay, 100 μl of sodium dodecyl sulphate (SDS)
(Zeptometrix Co., USA) and 2.5 ml of
thiobarbituric acid (TBA) (Zeptometrix Co., USA)
were added to the mixture. Then, it was
incubated at 95 °C for 1 h to promote
peroxidation. The mixture was put on ice for 10
min to cool down and stop the peroxidation
process. The precipitate formed was removed by
centrifugation at 3000 rpm, 15 min. The
absorbance was measured at 532 nm. Then, the
malondialdehyde (MDA) in the supernatant was
calculated and expressed as nmoles of MDA/mg
LDL protein. Standard MDA was used as a
reference and plotted the standard curve.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การประเมินผลต่ำบุคคลลิปกลอสไขperoxidation ไลโพโปรตีนความหนาแน่นการทดสอบทำตามวิธีการของดิลลอนมีปรับเปลี่ยนเล็กน้อย [14] ที่ขั้นตอนรวม LDL แยก ออกซิเดชัน LDLและทดสอบ TBARS การใช้ของมนุษย์ทั้งหมดเลือดในการศึกษานี้ได้รับการอนุมัติ โดยมารยาทในคณะกรรมการของเคบางซานยูนิเวอซิตี้มาเลเซีย (อนุมัติไม่ FF-120-2007), ต่อไปนี้แนวทางจริยธรรมสากลสำหรับงานวิจัยทางชีวการแพทย์ที่เกี่ยวข้องกับเรื่องของมนุษย์(CIOMS และ) [15] ทั้งเลือดออกจากหลอดเลือดดำของอาสาสมัครสุขภาพดีอายุระหว่าง24 และ 70 ปีที่ normolipidemic เบดได้รับยาใด ๆ และผลิตภัณฑ์เสริมอาหารภายในล่าสุดสองสัปดาห์ และยังอ้างว่า พวกเขาอดสำหรับ 8 h ก่อนเลือดถอนสำหรับ LDL แยก เพิ่ม 9 มล.ของเลือดใน 1 มิลลิลิตรของ 3.8% (w/v) โซเดียมซิเตรต (เมอร์คดาร์มส เยอรมนี) แก้ปัญหาเป็นการanticoagulant, centrifuged แล้ว ที่ g 2000 สำหรับ 20นาทีเพื่อแยกพลาสม่า พลาสม่า (3.2 ml)ถูกผสมกับ 0.8 ml ของ OptiprepTM (60%iodixanol) (ซิกเคมี Co.) เป็นความหนาแน่นสื่อไล่ระดับให้ iodixanol สุดท้ายความเข้มข้น 12% (v/v) ส่วนผสมนี้ได้เพิ่มใน 8.9 มล OptisealTM หลอด แล้วมล. 4 เพิ่มอย่างระมัดระวังของ iodixanol 6% ในน้ำเกลือหลังจากนั้นราดค่า 0.9 ml ของน้ำเกลือ ที่หลอดเป็น ultracentrifuged เวลา 402,000แรงโน้มถ่วง (g), 16 ° C สำหรับ 3 h 10 นาทีโดยใช้การ Ti.70.1ใบพัด Subfractions ของไลโพโปรตีน: highdensityไลโพโปรตีน (HDL), low-density ไลโพโปรตีน(LDL) และไลโพโปรตีน low-density มาก (VLDL)ได้รับ LDL มีลักษณะการตรวจวัดปริมาณของโปรตีน โดยใช้วัวserum albumin (โปรตีนชุดซิกเคมี จำกัด)เป็นมาตรฐาน เป็นวัดความบริสุทธิ์ของ LDLโดยใช้ electrophoresis Agarose เจล (ไบ-Radใช้เป็นสนับสนุนแข็งในสหรัฐอเมริกา)electrophoresis ตัวอย่างที่ electrophoresedที่มา/เจคง 45 สำหรับ 45 นาที เตาอบแห้งที่ 85 ° C สำหรับ 20 นาที และสีซูดานดำ (ซิก สหรัฐอเมริกา) วงดนตรีมีสายตาสังเกตภายใต้ UV เครื่องตรวจจับ แล้ว LDL ได้ผสมกับน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) (ค่า pH7.4) กับความเข้มข้นสุดท้ายของ μg 200 โปรตีน/mlก่อนที่จะเกิดออกซิเดชันทดสอบการเกิดออกซิเดชันของ LDL เริ่มปฏิกิริยาโดยการเพิ่มซึ่งทำ 10 μM CuSO4แก้ปัญหา (ซิก สหรัฐอเมริกา) ตัวอย่างดีละลายใน DMSO รับประจำความเข้มข้น 1.25, 0.63, $ 0.31, 0.16 และ 0.08Μg/μl Μl 5 ตัวอย่างถูกเพิ่มเข้าไปประกอบด้วย μl 945 ของ LDL, 50 μl ของ 10 μM cuveteCuSO4 และ incubated ที่ 37 ° C สำหรับ 5 h สุดท้ายความเข้มข้นของสารสกัดจากส่วนผสมได้6.25, 3.13, 1.56, 0.78 และ 0.39 μg / มล. 0.5%ใช้ DMSO เป็นตัวควบคุมและขณะว่างเปล่าprobucol (ซิก สหรัฐอเมริกา) ถูกใช้ในแง่บวกควบคุม เกิดออกซิเดชันของ LDL ถูกยกเลิกโดยจุดเยือกแข็งอย่างรวดเร็ว และเก็บไว้ที่-20 ° C มีไม่กว่า 24 ชมสำหรับปฏิกิริยาสาร thiobarbituric (TBARS)วิเคราะห์ μl 100 ของโซเดียมซัลเฟต dodecyl (SDS)(Zeptometrix Co. สหรัฐอเมริกา) และ 2.5 ml ของกรด thiobarbituric (TBA) (Zeptometrix Co. สหรัฐอเมริกา)มีเพิ่มการผสม แล้ว มันถูกincubated ที่ 95 ° C สำหรับ h 1 เพื่อส่งเสริมperoxidation ส่วนผสมที่ใส่น้ำแข็ง 10นาทีการเย็นลง และหยุดการ peroxidationกระบวนการ Precipitate เกิดขึ้นถูกเอาออกโดยcentrifugation ที่ 3000 รอบต่อนาที 15 นาทีมีวัด absorbance ที่ 532 nm นั้นmalondialdehyde (MDA) ใน supernatant ถูกคำนวณ และแสดงเป็น nmoles ของ MDA/มิลลิกรัมโปรตีน LDL มาตรฐาน MDA ถูกใช้เป็นอ้างอิง และพล็อตเส้นโค้งมาตรฐาน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การประเมินผลการยับยั้งในระดับต่ำของมนุษย์
ความหนาแน่นของไลโปโปรตีน peroxidation
ทดสอบได้ดำเนินการดังต่อไปนี้วิธีการ
ของดิลลอนที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย [14]
ขั้นตอนรวมถึงการแยก LDL ออกซิเดชัน LDL
และทดสอบ TBARS การใช้งานของทั้งมนุษย์
เลือดในการศึกษาครั้งนี้ได้รับการอนุมัติโดยจริยธรรม
คณะกรรมการ Universiti Kebangsaan
Malaysia (ไม่มีการอนุมัติ. FF-120-2007) ตาม
แนวทางจริยธรรมระหว่างประเทศเพื่อ
การวิจัยทางการแพทย์ที่เกี่ยวข้องกับมนุษย์
(CIOMS และ WHO) [15] . เลือดถูกดึงออกมา
จากหลอดเลือดดำของอาสาสมัครที่มีสุขภาพดีอายุระหว่าง
24 และ 70 ปีที่อยู่ normolipidemic, สูบบุหรี่,
ไม่ได้นำยาและ
ผลิตภัณฑ์เสริมอาหารภายในสองสัปดาห์ที่ผ่านมาและยัง
อ้างว่าพวกเขาอดอาหารเป็นเวลา 8 ชั่วโมงก่อนที่จะมีเลือด
ถอน.
สำหรับ LDL แยก 9 มิลลิลิตรของเลือดที่ถูกเพิ่ม
เข้ามาใน 1 มิลลิลิตร 3.8% (w / v) โซเดียมซิเตรท (เมอร์ค,
Darmstadt, เยอรมนี) เป็นวิธีการแก้ปัญหา
การแข็งตัวของเลือด, ปั่นแล้วที่ 2,000 กรัมเป็นเวลา 20
นาทีถึงพลาสม่าที่แยกต่างหาก พลาสม่า (3.2 ml)
ผสมกันได้ดีกับ 0.8 มิลลิลิตร OptiprepTM (60%
iodixanol) (Sigma เคมี จำกัด ) เป็นความหนาแน่น
ปานกลางลาดเพื่อให้ iodixanol สุดท้าย
ความเข้มข้น 12% (v / v) ส่วนผสมนี้ถูก
เพิ่มเข้ามาใน 8.9 มลหลอด OptisealTM แล้ว
เพิ่มความระมัดระวัง 4 มิลลิลิตร iodixanol 6% ในน้ำเกลือ
หลังจากนั้นเติมด้วย 0.9 มลน้ำเกลือ
หลอดถูก ultracentrifuged ที่ 402,000 ครั้ง
แรงโน้มถ่วง (G), 16 ° C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง 10 นาทีโดยใช้ Ti.70.1
โรเตอร์ subfractions ของไลโปโปรตีน: highdensity
ไลโปโปรตีน (HDL), ไลโปโปรตีนความหนาแน่นต่ำ
(LDL) และไลโปโปรตีนความหนาแน่นต่ำมาก (VLDL)
ที่ได้รับ LDL ก็มีลักษณะ
การวัดปริมาณของโปรตีนโดยใช้วัว
อัลบูมิซีรั่ม (โปรตีนชุด Sigma เคมี จำกัด )
เป็นมาตรฐาน ความบริสุทธิ์ของ LDL วัด
โดยใช้อิเล็ก Agarose เจล (Bio-Rad,
USA) ถูกนำมาใช้กับการสนับสนุนที่แข็งแกร่งใน
electrophoresis ตัวอย่าง electrophoresed
ที่คงที่ 45 mA / เจลสำหรับ 45 นาทีแล้วอบ
แห้งที่ 85 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 นาทีและย้อมด้วยซูดาน
ดำ (Sigma, ประเทศสหรัฐอเมริกา) เป็นวงดนตรีที่สายตา
สังเกตภายใต้การตรวจจับรังสียูวี จากนั้น LDL ถูก
เจือจางด้วยน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (พีบีเอส) (pH
7.4) ที่จะมีความเข้มข้นสุดท้ายของ 200 ไมโครกรัมโปรตีน / ml
ก่อนการทดสอบการเกิดออกซิเดชัน.
สำหรับการเกิดออกซิเดชันของ LDL ปฏิกิริยาได้ริเริ่มขึ้น
โดยการเพิ่มเตรียมสด 10 ไมครอน CuSO4
(Sigma, สหรัฐอเมริกา ) การแก้ปัญหา ตัวอย่างที่ถูก
ละลายใน DMSO ที่จะได้รับอนุกรม
เข้มข้น 1.25, 0.63, 0.31, 0.16 และ 0.08
ไมโครกรัม / ไมโครลิตร ห้าไมโครลิตรของกลุ่มตัวอย่างที่ถูกเพิ่มเข้าไปใน
cuvete มี 945 ไมโครลิตรของ LDL, 50 ไมโครลิตรของ 10 ไมครอน
CuSO4 และบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 ชั่วโมง สุดท้าย
ความเข้มข้นของสารสกัดในส่วนผสมเป็น
6.25, 3.13, 1.56, 0.78 และ 0.39 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร 0.5%
DMSO ถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมและว่างเปล่าในขณะที่
probucol (Sigma, ประเทศสหรัฐอเมริกา) ถูกใช้เป็นบวก
ควบคุม ออกซิเดชันของ LDL ถูกยกเลิกโดย
การแช่แข็งอย่างรวดเร็วและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 ° C ที่มีไม่
เกิน 24 ชม.
สำหรับด่างทั้งหมดที่ระเหยสารปฏิกิริยา (TBARS)
ทดสอบ 100 ไมโครลิตรของโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS)
(Zeptometrix Co. , USA) และ 2.5 มิลลิลิตรของ
กรดด่างทั้งหมดที่ระเหย (TBA) (Zeptometrix Co. , USA)
มีการเพิ่มส่วนผสม จากนั้นมันก็
บ่มที่อุณหภูมิ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมงเพื่อส่งเสริมการ
peroxidation ส่วนผสมที่วางอยู่บนน้ำแข็งเป็นเวลา 10
นาทีที่จะเย็นลงและหยุด peroxidation
กระบวนการ ตะกอนที่เกิดขึ้นถูกลบออกโดย
การหมุนเหวี่ยงที่ 3000 รอบต่อนาที, 15 นาที
การดูดกลืนแสงวัดที่ 532 นาโนเมตร จากนั้น
Malondialdehyde (MDA) ในสารละลายที่ถูก
คำนวณและแสดงเป็น nmoles ของภาคตะวันออกเฉียงเหนือ / มิลลิกรัม
โปรตีน LDL ภาคตะวันออกเฉียงเหนือมาตรฐานถูกใช้เป็น
ข้อมูลอ้างอิงและพล็อตกราฟมาตรฐาน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ประเมินว่าผลกระทบของความหนาแน่นต่ำไลโปโปรตีน
-
( มีการปฏิบัติตามวิธีการของดิลลอนที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย
[ 14 ]

รวม LDL ออกซิเดชันกระบวนการแยก , LDL และปกติ ตามลำดับ การใช้เลือด
มนุษย์ในการศึกษานี้ได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรม

ของมหาวิทยาลัยแห่งชาติมาเลเซีย ( ff-120-2007 ไม่ อนุมัติ ดังต่อไปนี้
)ระหว่างประเทศแนวทางจริยธรรมการวิจัยทางการแพทย์ที่เกี่ยวข้องกับคน

( cioms ใคร ) [ 15 ] เลือดจากหลอดเลือดดำของวาด

อาสาสมัครที่มีสุขภาพดีอายุระหว่าง 24 และ 70 ปี ที่ normolipidemic 1
, , ไม่เคย โรคใด ๆและ
อาหารเสริมภายในสองสัปดาห์สุดท้ายและยัง
อ้างว่าพวกเขาอดอาหาร 8 ชั่วโมง ก่อนเลือด

( แยก , การถอน9 มิลลิลิตรของเลือดเพิ่ม
1 ml 3.8 % ( w / v ) โซเดียมซิเตรต ( เมอร์ค
ดาร์มสตัดท์ , เยอรมนี ) โซลูชั่นเป็น
เลือด แล้วไฟฟ้าที่ 2000 G 20
มินแยกพลาสมา พลาสมา ( 3.2 ml )
ผสมได้ดีกับ 0.8 มิลลิลิตร optipreptm ( 60 %
iodixanol ) ( Sigma Chemical Co . ) ในขณะที่ความหนาแน่น
ลาดกลางเพื่อให้ความเข้มข้น iodixanol
สุดท้าย 12 เปอร์เซ็นต์ ( v / v ) ส่วนผสมนี้
เพิ่มใน optisealtm 8.9 ml หลอดแล้ว
ให้ดีเพิ่ม 4 มิลลิลิตร iodixanol 6% ในดินเค็ม
หลังจากนั้น , เติมด้วย 0.9 ml ของน้ำเกลือ

ultracentrifuged หลอดที่ 402000 ครั้งแรงโน้มถ่วง ( g ) , 16 ° C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง 10 นาทีใช้ Ti . 70.1
ใบพัด . การ subfractions ของไฮ เดนซิตี้ไลโปโปรตีนไลโปโปรตีน :
( HDL ) ความหนาแน่นต่ำไลโปโปรตีนความหนาแน่นต่ำ ( LDL ) และมาก

lipoprotein ( VLDL ) ได้ .LDL เป็น characterized โดย
การวัดปริมาณของโปรตีนโดยใช้วัว
ซีรัมอัลบูมิน ( โปรตีนชุด Sigma Chemical Co . )
เป็นมาตรฐาน ความบริสุทธิ์ของ LDL วัด
โดยใช้เรส เจล ( ไบแรด
ใช้ , USA ) การสนับสนุนที่มั่นคงใน
เรส จำนวน electrophoresed
ที่คงที่ 45 มา / เจลสำหรับ 45 นาที แล้วอบแห้งที่อุณหภูมิ 85 องศา C

20 นาทีและย้อมซูดานสีดำ ( Sigma , USA ) วงดนตรี
สังเกตสายตาภายใต้เครื่องยูวี แล้วแอลก็
เจือจางด้วยน้ำเกลือ ( PBS ) ( ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH
7.4 ) ความเข้มข้นสุดท้าย 200 μกรัมโปรตีน / ml

สำหรับก่อนการทดสอบการเกิดออกซิเดชัน ออกซิเดชันของ LDL , ปฏิกิริยาเริ่มต้น
โดยเพิ่มเตรียมสด 10 μ M CuSO4
( Sigma , USA ) โซลูชั่น จำนวน
ละลายใน DMSO เพื่อขอรับ Serial
ความเข้มข้น 1.25 , 063 , 0.31 , 0.16 และ 0.08
μกรัม / ลิตร 5 ลิตรμμจำนวนเพิ่มให้
cuvete ที่มี 945 μ L ( , 50 μ L 10 CuSO4 M
μบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 5 ชั่วโมง ความเข้มข้นของสารสกัดสุดท้าย

ในส่วนผสมเป็น 6.25 , 3.13 , 1.56 , 0.78 และ 0.39 μกรัม / มล. 0.5% DMSO ที่ใช้เป็นระบบควบคุมและ

ว่างในขณะที่โพบูคอล ( Sigma , USA ) ถูกใช้เป็นตัวควบคุมบวก

ออกซิเดชันของ LDL ถูกยกเลิกโดย
รวดเร็วแช่แข็งและเก็บไว้ที่ - 20 องศา C ไม่เกิน 24 ชม.

สำหรับเท่ากับปฏิกิริยาสาร ( ปกติ )
3 , 100 μลิตรโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต ( SDS )
( zeptometrix Co . , USA ) และ 2.5 มล.
เท่ากับ acid ( TBA ) ( zeptometrix Co . , USA )
) เพิ่มส่วนผสม งั้น มันคือ
บ่มที่อุณหภูมิ 95 องศา C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง เพื่อส่งเสริม
- .ส่วนผสมจะถูกวางบนน้ำแข็ง 10
มินให้เย็นลงและหยุดกระบวนการที่ดี

ที่รูปถูกลบโดย
3 ที่ 3000 รอบต่อนาที 15 นาที
ค่าวัดที่ 532 นาโนเมตร งั้น
มาลอนไดอัลดีไฮด์ ( MDA ) ในน่านถูก
คำนวณและแสดงเป็นในของ MDA / มิลลิกรัมโปรตีน (
. น้ำตาลที่ใช้เป็นมาตรฐานอ้างอิง และวางแผน
เส้นโค้งมาตรฐาน