2.2. Chemical parametersGlucose and

2.2. Chemical parameters
Glucose and ethanol concentrations were determined using
the respective enzyme kits (Boehringer Mannheim, Mannheim,
Germany). Acetate and lactate concentrations were determined
by high performance liquid chromatography (HPLC) (Hitachi
L6300, Tokyo, Japan) with TSKgel OApak-A column
(7.8mm×30cm, Tosoh Co., Tokyo, Japan), 0.75M H2SO4
served as the mobile phase, and a UV detector.
2.3. Culture conditions and isolation
The fermentation broths were serially diluted in phosphate
buffered saline (PBS) and were spread onto the appropriate agar
plates, as described below. The GYP medium (pH 6.8) contained
(l−1): glucose, 30.0g; yeast extract (Becton Dickinson
and Co., Sparks, MD, USA), 5.0 g; tryptone peptone (Beckton
Dickinson and Co.), 3.0g; CaCO3, 10.0g; and agar, 15.0g. The
MRS medium (pH 6.2), which is favorable for the growth of
lactic acid bacteria, contained (l−1): MRS agar (Oxoid, Basingstoke,
UK), 62.0g; CaCO3, 5.0 g; and NaN3, 0.01mg. After
spreading the samples onto MRS medium, the same medium
was poured onto the agar plate. Cultivation was performed at
25 °C for 3–7 days under aerobic conditions. Acid-producing
colonies showing clear zones of CaCO3 were purified at least
three times. In addition, TSB medium (pH 6.8) was also used as
a non-selective medium, and consisted of tryptic soy broth
(Becton Dickinson and Co.), 30.0g/l and agar, 15.0g/l.
2.4. DNA extraction
Direct DNA extraction from the solid fraction and the isolated
bacterial cells was performed according to the benzyl
chloride method (Zhu et al., 1993). The final purification was
performed by RNase treatment followed by polyethylene glycol
treatment (Maniatis et al., 1982). The DNA preparations were
used as templates for the PCR experiments described below.
2.5. Phylogenetic analysis of isolated bacteria
The 16S rRNA gene sequences of isolated bacteria were
determined by direct sequencing of the PCR-amplified 16S
rRNA gene fragments. PCR was performed with universal bacterial
primers, 27F (forward) 5′-AGAGTTTGATCCTGGCT
CAG-3′ (Escherichia coli positions 8 to 27) and 1512R (reverse)
5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′ (E. coli positions 1512
to 1493) (Devereux and Willis, 1995) as described previously
(Kato et al., 2004). The purified DNA fragment was sequenced
using the ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing
Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Chiba, Japan) and an
ABI PRISM model 377 genetic analyzer (Applied Biosystems).
The 16S rRNA gene sequences obtained from the isolated
bacteria were compared with those from the DDBJ nucleotide
sequence database, using the program BLAST.
2.6. PCR amplification of the 16S or 18S rRNA gene fragment
for DGGE
The PCR amplification was performed using AmpliTaqGold
according to the manufacturer's instructions (AppliedBiosystems).
The V3 region of 16S rRNA gene was selected for bacterial
community analysis (Yu andMorrison, 2004). The primers used to
amplify the V3 regions were as follows: 357F, 5′-CTACGGGA
GGCAGCAG-3′ (E. coli positions 341 to 357), and 517R, 5′-AT
TACCGCGGCTGCTGG-3′ (E. coli positions 517 to 534)
(Muyzer et al., 1993). The primer 357F had a GC clamp sequence
at the 5′ end: CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGG
GGGCACGGGGGG. The temperature cycle for the PCRhas been
described previously (Haruta et al., 2002). Amplification of the 18S
rRNA gene of the fungal community was performed using the
following primers: NS3, GCAAGTCT GGTGCCAGCAGCC
(Saccharomyces cerevisiae positions 553 to 573) (White et al.,
1990) and YM951r, TTGGCAAATG CTTTCGC (S. cerevisiae
positions 951 to 935). The primer NS3 had the same GC clamp
sequence as the 357F primer. The primer YM951r was obtained by
the modification of NS951r (Wuyts et al., 2002) and the PCR
parameters were optimized as described below to widen the availability
of the primer. The composition of the reaction mixture was
that given in the manufacturer's instructions (Applied Biosystems)
with 3mM MgCl2. The thermal cycling parameters for the PCR
were as follows. After pre-incubation at 95 °Cfor 10min, a total of
31 cycles were performed at 93 °C for 1min, at the annealing
temperature for 1min, and at 72 °C for 3min. The annealing
temperature was decreased by 0.5 °C after each cycle, i.e.,
from 55 °C in the first cycle to 45 °C in the 21st cycle. In the
subsequent 10 cycles, the annealing temperature was 45 °C. The
temperature cycling was concluded with a final step of 5min at
72 °C. The products were examined by electrophoresis on 2%
agarose gel before they were applied to DGGE.
2.7. PCR-DGGE
DGGE was performed as described previously (Haruta et al.,
2002) with the DCode system (Bio-Rad Laboratories, Hercules,
CA, USA). For determination of the bacterial community, 6% to
12% of the polyacrylamide gradient was superimposed onto a
25% to 50% denaturant gradient, whereby 100% was defined as
7M urea with 40% formamide. For fungal community, a 12.5%
to 50% denat

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2. เคมีพารามิเตอร์กำหนดความเข้มข้นกลูโคสและเอทานอลโดยใช้ชุดเอนไซม์ที่เกี่ยวข้อง (Boehringer มานไฮม์ มานไฮม์ประเทศเยอรมนี) กำหนดความเข้มข้นของอะซิเตทและน้ำนมด้วยสารละลายน้ำ (HPLC) (ฮิตาชิL6300 โตเกียว ญี่ปุ่น) ด้วยคอลัมน์ OApak A TSKgel(7.8 มม. × 30 ซม. บริษัท Tosoh โตเกียว ญี่ปุ่น), H2SO4 0.75 ม.หน้าที่เป็นระยะมือถือ และเครื่องตรวจจับ UV2.3. วัฒนธรรมเงื่อนไขและแยกBroths หมักถูกเจือจางในฟอสเฟต seriallyบัฟเฟอร์น้ำเกลือ (PBS) และได้แพร่ลงบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่เหมาะสมแผ่น ตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง GYP ปานกลาง (pH 6.8) อยู่(l−1): น้ำตาลกลูโคส 30.0 g สารสกัดจากยีสต์ (Becton สันและ บริษัท ประกายไฟ MD สหรัฐอเมริกา), 5.0 g peptone tryptone (Becktonดิกคินสันและบริษัท), 3.0 g CaCO3, 10.0 g และ วุ้น 15.0 กรัม การนางปานกลาง (pH 6.2), ซึ่งเป็นอย่างดีสำหรับการเติบโตของแบคทีเรียกรดแลคติก อยู่ (l−1): อาหารเลี้ยงเชื้อ MRS (Oxoid, Basingstokeสหราชอาณาจักร), 62.0 กรัม CaCO3, 5.0 g และ NaN3, 0.01 มิลลิกรัม หลังจากกระจายตัวอย่างลงบน MRS ปานกลาง กลางเดียวกันถูกเทลงในจานอาหารเลี้ยงเชื้อ ทำการเพาะปลูกที่25 ° C 3 – 7 วันภายใต้สภาพแอโรบิก ผลิตกรดอาณานิคมแสดงโซนที่ชัดเจนของ CaCO3 ที่บริสุทธิ์น้อยสามครั้ง นอกจากนี้ TSB ปานกลาง (pH 6.8) ถูกใช้เป็นเลือกสื่อ และซุปถั่วเหลือง tryptic ที่ประกอบด้วย(Becton สัน และ จำกัด), 30.0 g/l และวุ้น 15.0 g/l2.4. สกัดดีเอ็นเอสกัดดีเอ็นเอโดยตรงจากเศษไม้และการแยกดำเนินการตามลสูตรเซลล์แบคทีเรียคลอไรด์วิธี (Zhu et al. 1993) คือการทำให้บริสุทธิ์ขั้นสุดท้ายดำเนินการ โดยรักษา RNase ตาม ด้วยเอทิลีนไกลคอลการรักษา (Maniatis et al. 1982) การเตรียมดีเอ็นเอได้ใช้เป็นแม่แบบสำหรับการทดลอง PCR ที่อธิบายไว้ด้านล่าง2.5. ผลการวิเคราะห์แยกแบคทีเรียลำดับที่ยีน 16S rRNA ของแบคทีเรียที่แยกได้ตามลำดับโดยตรงของการขยาย PCR 16SrRNA บางส่วนของยีน ทำ PCR กับแบคทีเรียสากลไพรเมอร์ 27F (ข้างหน้า) 5 ′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ (Escherichia coli ตำแหน่ง 8-27) และ 1512R (ย้อนกลับ)5 ′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′ (ตำแหน่ง E. coli 1512การ 1493) (ท่องและ Willis, 1995) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้(คา et al. 2004) ส่วนดีเอ็นเอบริสุทธิ์ถูกเรียงลำดับใช้การปริซึม ABI BigDye เทอร์มิเนเตอร์วงจรการจัดลำดับพร้อมชุดปฏิกิริยา (ศาสตร์เชิงชีวภาพประยุกต์ ชิบะ ญี่ปุ่น) และปริซึม ABI รุ่น 377 วิเคราะห์ทางพันธุกรรม (ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ)การ 16S rRNA ยีนลำดับได้จากการแยกแบคทีเรียเปรียบเทียบกับผู้ที่มาจากนิวคลีโอไทด์ DDBJฐานข้อมูลลำดับ ใช้โปรแกรมระเบิด2.6. กระบือของ 18 ปีหรือ 16S rRNA ยีนส่วนสำหรับ DGGEกระบือที่ดำเนินการโดยใช้ AmpliTaqGoldตามคำแนะนำของผู้ผลิต (AppliedBiosystems)เลือกภูมิภาค V3 ของยีน 16S rRNA สำหรับแบคทีเรียการวิเคราะห์ชุมชน (Yu andMorrison, 2004) ไพรเมอร์ที่ใช้ในการขยาย V3 ที่ภูมิภาคมีดังนี้: 357F, CTACGGGA-5 ′GGCAGCAG-3′ (E. coli ตำแหน่ง 341 357), และ 517R, AT 5 ′TACCGCGGCTGCTGG-3′ (E. coli ตำแหน่ง 517 534)(Muyzer et al. 1993) ลำดับแคลมป์ GC มีไพรเมอร์ 357Fที่ปลาย 5 ′: CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG วงจรอุณหภูมิสำหรับการ PCRhas รับอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Haruta et al. 2002) การขยายของ 18 ปียีนใน rRNA ของชุมชนเชื้อราถูกดำเนินการโดยใช้การไพรเมอร์ดังต่อไปนี้: NS3, GCAAGTCT GGTGCCAGCAGCC(Saccharomyces cerevisiae ตำแหน่ง 553 573) (ขาว et al.,ปี 1990) และ YM951r, TTGGCAAATG CTTTCGC (S. cerevisiaeตำแหน่ง 951 935) รองพื้น NS3 มีแคลมป์ GC เดียวกันลำดับเป็นไพรเมอร์ 357F รองพื้น YM951r ได้รับโดยการปรับเปลี่ยน NS951r (Wuyts et al. 2002) และการ PCRพารามิเตอร์ถูกปรับให้เหมาะสมตามที่อธิบายไว้ด้านล่างเพื่อขยายความพร้อมใช้งานพื้น แก้ไของค์ประกอบของส่วนผสมของปฏิกิริยาที่กำหนดให้ในคำแนะนำของผู้ผลิต (ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ)กับ 3 มม. MgCl2 ความร้อนขี่จักรยานพารามิเตอร์สำหรับการ PCRมีดังนี้ หลังจากบ่มก่อนที่ 95 ° Cfor 10 นาที รวมรอบ 31 ดำเนินการ 93 ° c 1 นาที เวลาการหลอมอุณหภูมิ 1 นาที และ 72 ° c เป็นเวลา 3 นาที การหลอมอุณหภูมิลดลง โดย 0.5 ° C หลังจากแต่ละวงจร เช่นจาก 55 ° C ในรอบแรกถึง 45 ° C ในรอบ 21 ในตามมา 10 รอบ อุณหภูมิการหลอมเป็น 45 องศาเซลเซียส การอุณหภูมิขี่จักรยานประกอบ ด้วยขั้นตอนสุดท้ายของ 5 นาทีที่72 องศาเซลเซียส ผลิตภัณฑ์ถูก examined โดยอิ 2%agarose เจลก่อนที่พวกเขาใช้ DGGE2.7 PCR DGGEDGGE ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Haruta et al.,2002) กับระบบ DCode (เชื้อ ดาวCA, USA) สำหรับการกำหนดชุมชนแบคทีเรีย 6%12% ของการไล่ระดับการตรวจสอบวิเคราะห์ถูกซ้อนทับลงบนตัวไล่ระดับสี denaturant 25% ถึง 50% โดย 100% ถูกกำหนดเป็นยูเรีย 7M ด้วย formamide 40% สำหรับเชื้อราชุมชน 12.5%การ denat 50%

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 พารามิเตอร์เคมี
กลูโคสและเอทานอลความเข้มข้นได้รับการพิจารณาโดยใช้
ตามลำดับชุดเอนไซม์ (Boehringer Mannheim, มันไฮม์,
เยอรมนี) อะซิเตทและแลคเตทความเข้มข้นได้รับการพิจารณา
โดยมีประสิทธิภาพสูงของเหลว chromatography (HPLC) (ฮิตาชิ
L6300 โตเกียวประเทศญี่ปุ่น) กับ TSKgel OApak-คอลัมน์
(7.8mm × 30 ซม Tosoh Co. , กรุงโตเกียวประเทศญี่ปุ่น) 0.75 H2SO4
ทำหน้าที่เป็นโทรศัพท์มือถือที่ ขั้นตอนและเครื่องตรวจจับรังสียูวี.
2.3 เงื่อนไขวัฒนธรรมและการแยก
ซุปมิโสะหมักถูกปรับลดลำดับในฟอสเฟต
บัฟเฟอร์น้ำเกลือ (พีบีเอส) และได้รับการแพร่กระจายลงบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่เหมาะสม
แผ่นตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง GYP กลาง (pH 6.8) ที่มี
(L-1): กลูโคส 30.0g; สารสกัดจากยีสต์ (Becton ดิกคินสัน
และ Co. , ประกายไฟ, MD, USA) 5.0 กรัม Tryptone เปปโตน (Beckton
ดิกคินสันและร่วม) 3.0G; CaCO3, 10.0g; และวุ้น 15.0g
MRS กลาง (pH 6.2) ซึ่งเป็นอย่างดีสำหรับการเจริญเติบโตของ
เชื้อแบคทีเรียกรดแลคติกที่มีอยู่ (L-1): MRS agar (Oxoid เบซิง,
สหราชอาณาจักร), 62.0g; CaCO3 5.0 กรัม และ NaN3, 0.01mg หลังจาก
การแพร่กระจายไปยังกลุ่มตัวอย่างขนาดกลาง MRS ที่สื่อเดียวกัน
ถูกเทลงบนจานเลี้ยงเชื้อ การเพาะปลูกได้รับการดำเนินการที่
25 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3-7 วันภายใต้เงื่อนไขแอโรบิก กรดผลิต
อาณานิคมแสดงโซนที่ชัดเจนของ CaCO3 บริสุทธิ์อย่างน้อย
สามครั้ง นอกจากนี้สื่อ TSB (pH 6.8) นอกจากนี้ยังถูกใช้เป็น
สื่อที่ไม่ได้รับเลือกและประกอบไปด้วยทริปซิซุปถั่วเหลือง
(Becton ดิกคินสันและร่วม) 30.0g / L และวุ้น 15.0g / ลิตร.
2.4 สกัดดีเอ็นเอ
สกัดดีเอ็นเอตรงจากส่วนที่เป็นของแข็งและแยก
เซลล์แบคทีเรียได้ดำเนินการตามที่ benzyl
วิธีคลอไรด์ (จู้ et al., 1993) บริสุทธิ์สุดท้ายที่ถูก
ดำเนินการโดยการรักษา RNase ตามด้วยคอลเอทิลิน
รักษา (Maniatis et al., 1982) การเตรียมดีเอ็นเอถูก
นำมาใช้เป็นแม่แบบสำหรับการทดลอง PCR ที่อธิบายด้านล่าง.
2.5 การวิเคราะห์วิวัฒนาการของเชื้อแบคทีเรียที่แยกได้
16S rRNA ลำดับยีนของแบคทีเรียที่แยกได้ถูก
กำหนดโดยลำดับโดยตรงของ PCR-amplified 16S
rRNA เศษยีน PCR ได้ดำเนินการกับแบคทีเรียสากล
ไพรเมอร์ 27 (Forward) 5'-AGAGTTTGATCCTGGCT
CAG-3 '(Escherichia coli ตำแหน่ง 8-27) และ 1512R (ย้อนกลับ)
5'-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3' ( E. coli ตำแหน่ง 1512
ที่จะ 1493) ( เดอเวโรและวิลลิส, 1995) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้
(Kato et al., 2004) ส่วนดีเอ็นเอบริสุทธิ์ติดใจ
ใช้ ABI PRISM BigDye Terminator วงจรลำดับ
ปฏิกิริยา Kit พร้อม (Applied Biosystems ชิบะประเทศญี่ปุ่น) และ
ABI PRISM รุ่น 377 วิเคราะห์ทางพันธุกรรม (Applied Biosystems).
16S rRNA ลำดับยีนที่ได้จากการแยก
เชื้อแบคทีเรียที่ถูกนำมาเปรียบเทียบ กับผู้ที่มาจาก DDBJ เบื่อหน่าย
ฐานข้อมูลลำดับโดยใช้โปรแกรม BLAST.
2.6 ขยาย PCR ของชิ้นส่วนของยีน 16S หรือ 18S rRNA
สำหรับ DGGE
ขยาย PCR ได้ดำเนินการโดยใช้ AmpliTaqGold
ตามคำแนะนำของผู้ผลิต (AppliedBiosystems).
ภูมิภาค V3 ของ 16S rRNA ยีนได้รับเลือกให้แบคทีเรีย
วิเคราะห์ชุมชน (Yu andMorrison, 2004) ไพรเมอร์ที่ใช้ในการ
ขยายภูมิภาค V3 มีดังนี้ 357F, 5'-CTACGGGA
GGCAGCAG-3 '( E. coli ตำแหน่ง 341-357) และ 517R, 5'-AT
TACCGCGGCTGCTGG-3' ( E. coli ตำแหน่ง 517 เพื่อ 534)
(Muyzer et al., 1993) ไพรเมอร์ 357F มีลำดับ GC ยึด
ที่ปลาย 5 ': CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGG
GGGCACGGGGGG วงจรอุณหภูมิ PCRhas ถูก
อธิบายไว้ก่อนหน้า (Haruta et al., 2002) ขยายของ 18S
ยีน rRNA ของชุมชนเชื้อราได้รับการดำเนินการโดยใช้
ไพรเมอร์ต่อไปนี้: NS3, GCAAGTCT GGTGCCAGCAGCC
(. สีขาว, et al (Saccharomyces cerevisiae ตำแหน่ง 553-573)
1990) และ YM951r, TTGGCAAATG CTTTCGC (เอส cerevisiae
ตำแหน่ง 951-935 ) NS3 ไพรเมอร์มี GC ยึดเดียวกัน
ลำดับเป็นไพรเมอร์ 357F ไพรเมอร์ YM951r ได้มาจาก
การเปลี่ยนแปลงของ NS951r นี้ (Wuyts et al., 2002) และวิธี PCR
พารามิเตอร์มีประสิทธิภาพสูงสุดตามที่อธิบายไว้ด้านล่างเพื่อขยายความพร้อม
ของไพรเมอร์ องค์ประกอบของผสมปฏิกิริยาถูก
ที่ได้รับในคำแนะนำของผู้ผลิต (Applied Biosystems)
กับ 3mm MgCl2 พารามิเตอร์การขี่จักรยานการระบายความร้อนสำหรับ PCR
มีดังนี้ หลังจากที่ก่อนการบ่มที่ 95 ° Cfor 10min ทั้งหมด
31 รอบได้ดำเนินการที่ 93 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีในการอบ
อุณหภูมิ 1min และที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 นาที อบอ่อน
อุณหภูมิลดลง 0.5 องศาเซลเซียสหลังจากแต่ละรอบคือ
ตั้งแต่ 55 องศาเซลเซียสในรอบแรกถึง 45 ° C ในรอบที่ 21 ใน
ภายหลัง 10 รอบอุณหภูมิการหลอมเป็น 45 ° C
วัฏจักรอุณหภูมิสรุปได้ด้วยขั้นตอนสุดท้ายของ 5 นาทีที่
72 ° C ผลิตภัณฑ์ที่ได้รับการตรวจสอบโดยอิเลค 2%
agarose gel ที่ก่อนที่จะถูกนำไปใช้กับ DGGE.
2.7 PCR-DGGE
DGGE ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Haruta et al.,
2002) กับระบบ DCode (Bio-Rad ห้องปฏิบัติการ, Hercules,
CA, USA) สำหรับการกำหนดของชุมชนแบคทีเรีย, 6% ถึง
12% ของการไล่ระดับสีอะคริเลตที่ถูกซ้อนทับลงบน
ลาด denaturant 25% ถึง 50% โดย 100% ถูกกำหนดเป็น
7M ยูเรีย 40% formamide ชุมชนเชื้อรา 12.5%
denat ถึง 50%

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2 . พารามิเตอร์ทางเคมีน้ำตาลและเอทานอลความเข้มข้นสารละลาย โดยใช้ชุด 2 ( Boehringer Mannheim Mannheim , เอนไซม์ ,เยอรมนี ) อะซิเตท และแลคเตทความเข้มข้นสารละลายโดยวิธีโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง ( HPLC ) ( บริษัท ฮิตาชิl6300 , โตเกียว , ญี่ปุ่น ) กับ tskgel oapak-a คอลัมน์( 7.8mm × 30 TOSOH Co . , โตเกียว , ญี่ปุ่น ) , 0.75m กรดซัลฟิวริกทำหน้าที่เป็นเฟสเคลื่อนที่และ UV , เครื่องตรวจจับ2.3 เงื่อนไขทางวัฒนธรรม และแยกาถูกเจือจางในการหมักเป็นฟอสเฟตในน้ำเกลือ ( PBS ) และถูกกระจายลงบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่เหมาะสมแผ่น ตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง พวกต้มตุ๋นกลาง ( pH 6.8 ) ประกอบด้วย( L − 1 ) : กลูโคส , 30.0g ; สารสกัดจากยีสต์ ( เบ็กเติ้นดิคและ บริษัท สปาร์ค , MD , USA ) , 5.0 กรัม ; ทริพโทนเปปโตน ( เบ็คตันดิกคินสันและ บริษัท ) , 3.0g ; CaCO3 , 10.0g และวุ้น 15.0g .นางกลาง ( pH 6.2 ) ซึ่งเป็นอย่างดีสำหรับการเจริญเติบโตของแบคทีเรียกรดแลคติกที่มี ( L − 1 ) : MRS agar ( oxoid Basingstoke , ,สหราชอาณาจักร ) , 62.0g ; CaCO3 , 5.0 กรัม และ nan3 0.01mg , . หลังจากแพร่กระจายตัวอย่างลงบนนางกลาง กลางเดียวกันถูกเทลงบนวุ้นแผ่น การกระทำที่25 ° C เป็นเวลา 3 - 7 วัน ภายใต้สภาวะแอโรบิก . การผลิตกรดอาณานิคมแสดงโซนที่ชัดเจนของ CaCO3 เป็นบริสุทธิ์อย่างน้อยสามครั้ง นอกจากนี้ TSB ปานกลาง ( pH 6.8 ) ก็ใช้เป็นไม่เลือกขนาดกลาง มีน้ำซุปถั่วเหลืองอาหาร( เบคตอนดิกคินสันและ บริษัท ) , 30.0g/l และวุ้น 15.0g/l .2.4 . การสกัดดีเอ็นเอการสกัดดีเอ็นเอโดยตรงจากส่วนที่เป็นของแข็งและแยกเซลล์แบคทีเรียที่ถูกดำเนินการไปตามเบนซิลวิธีคลอไรด์ ( Zhu et al . , 1993 ) ทำให้สุดท้ายคือดำเนินการโดยการรักษาตามด้วยพอลิเอทิลีนไกลคอลเลสการรักษา ( maniatis et al . , 1982 ) การเตรียมดีเอ็นเอคือใช้เป็นแม่แบบสำหรับเทคนิคการทดลองที่อธิบายไว้ด้านล่าง2.5 วิวัฒนาการการวิเคราะห์แยกแบคทีเรียการลำดับเบส 16S rRNA ยีนของแบคทีเรียที่แยกได้คือกำหนดโดยลำดับของยีน 16S ขยายโดยตรงrRNA ยีนเอนไซม์ PCR คือการสากล แบคทีเรียไพรเมอร์ 27f ( ต่อ ) 5 ’ - agagtttgatcctggctcag-3 MBC ( Escherichia coli ตำแหน่ง 8 27 ) และ 1512r ( ย้อนกลับ )5 ’ - ’ ( E . coli acggctaccttgttacgact-3 ตำแหน่ง 1501เพื่อจัด ) ( เดเวอเรอ และ วิลลิส , 1995 ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้( คาโต้ et al . , 2004 ) ทำให้เป็นลำดับเบสดีเอ็นเอโดยใช้ปริซึม bigdye Terminator รอบการบิชุดปฏิกิริยาพร้อม ( Applied Biosystems , Chiba , ญี่ปุ่น ) และABI ปริซึมแบบเป็นพันธุกรรมวิเคราะห์ ( Applied Biosystems )การลำดับเบส 16S rRNA ยีนที่ได้จากการแยกแบคทีเรียถูกเปรียบเทียบกับลำดับเบสจาก ddbjฐานข้อมูลลำดับโดยใช้โปรแกรมระเบิด2.6 การเพิ่มปริมาณของดีเอ็นเอหรือยีน 18S rRNA ( ส่วนสำหรับการทดลองร่วมขยายการใช้ amplitaqgoldตามคำแนะนำของผู้ผลิต ( appliedbiosystems )ในเขตของ 16S rRNA ยีน V3 ได้รับเลือกสำหรับแบคทีเรียการวิเคราะห์ชุมชน ( ยู andmorrison , 2004 ) ไพรเมอร์ใช้ขยาย V3 ภูมิภาคมีดังนี้ 357f 5 ’ - ctacgggaggcagcag-3 MBC ( E . coli ) 341 ถึง 357 ) และ 517r 5 ’ - ที่taccgcggctgctgg-3 MBC ( E . coli ตำแหน่งที่จะ 534 )( muyzer et al . , 1993 ) ไพรเมอร์ 357f มี GC ยึดลำดับที่ 5 : cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgg นั้นสิ้นสุดgggcacgggggg . วงจรอุณหภูมิสำหรับ pcrhas ถูกอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( haruta et al . , 2002 ) การเพิ่มปริมาณของพบrRNA ยีนของชุมชนที่มีการใช้วิธีสร้าง gcaagtct ggtgccagcagcc , ดังต่อไปนี้ :( Saccharomyces cerevisiae ตำแหน่งเธอจะ 573 ) สีขาว ( et al . ,1990 ) และ ym951r ttggcaaatg ctttcgc ( S . cerevisiae ,ตำแหน่งเจ้าหน้าที่ให้ 935 ) ไพรเมอร์มีคีม GC เดียวกันสร้างลำดับเป็น 357f รองพื้น ไพรเมอร์ ym951r ได้โดยการเปลี่ยนแปลงของ ns951r ( wuyts et al . , 2002 ) และดีเอ็นเอพารามิเตอร์ที่เหมาะสมตามที่อธิบายไว้ด้านล่างเพื่อขยายห้องพักของไพรเมอร์ องค์ประกอบของปฏิกิริยาผสมที่ระบุในคําแนะนําของผู้ผลิต ( Applied Biosystems )มี 3 ไอโซโทป โดยจักรยานพารามิเตอร์สำหรับดีเอ็นเอมีดังนี้ หลังจากที่ก่อนการบ่มที่ 95 องศา C เป็นเวลาวัน รวมของ31 รอบแสดงที่ 93 องศา C เป็นเวลา 1 นาที ในการอบอ่อนอุณหภูมิเสียและ 72 ° C 3min . การอบอ่อนอุณหภูมิลดลง 0.5 ° C หลังจากแต่ละรอบ เช่นจาก 55 ° C ในรอบแรก 45 ° C ในรอบ 21 ในต่อมา 10 รอบ , อุณหภูมิการอบอ่อน 45 ° C .จักรยานอุณหภูมิได้ด้วยขั้นตอนสุดท้ายของ 5 นาทีที่72 องศา ผลิตภัณฑ์จะถูกตรวจสอบโดยวิธีอิเล็กโทรโฟรีซีสบน % 2เจล ก่อนที่จะถูกใช้เพื่อการทดลอง .2.7 . ดีเอ็นเอ 9 แถบบ่งชี้การทดลองได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( haruta et al . ,2002 ) กับระบบ dcode ( ไบโอ ราดห้องปฏิบัติการ , Hercules ,แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา ) สำหรับการกำหนดชุมชน 6 ) แบคทีเรีย12% ของอะคริลาไมด์ที่ซ้อนทับลงบนลาด25% ถึง 50% ทำให้ผิดธรรมชาติลาด โดย 100 % หมายถึง7M ยูเรียกับ 40% Formamide . สำหรับชุมชนรา , 12.5 %denat 50 เปอร์เซ็นต์