2. Materials and methods2.1. Starch

2. Materials and methods
2.1. Starches and chemicals
Wheat starch (Cerestar, CV. GL04) and wild type pea starch were gifts from Prof. C. Hedley and Prof. T. Bogracheva (formerly of the John Innes Centre, Norwich, UK). Purified potato starch was bought from the National Starch and Chemical Company (member of the ICI group, London, UK). Maize, waxy maize and high amylose maize starch were gifts from Dr. C. Pelkman at Ingredion. Rice starch was obtained from Sigma–Aldrich Ltd. Durum wheat grains for durum wheat starch extraction were bought from Millbo, Italy and extracted by the method described in Vansteelandt and Delcour (1999). The method was modified in that the grains were blended using an Ultra-Turrax homogeniser and passed through 250 and 125 μm sieves (Vansteelandt & Delcour, 1999). Phosphate buffered saline (PBS) tablets were purchased from Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, UK. When dissolved according to the manufacturer's instructions, a solution of pH 7.3 ± 0.2 at 25 °C is obtained. Porcine pancreatic α-amylase (type 1A, DFP treated) was purchased from Sigma–Aldrich Company Ltd. (Poole, Dorset, UK) as a suspension in 2.9 M NaCl solution containing 3 mM CaCl2. The activity stated by the supplier was approximately 1333 units/mg protein. A unit corresponds to 0.97 IU at 25 °C (Tahir, Ellis, & Butterworth, 2010). The purity of α-amylase was verified by SDS-PAGE that also confirmed the molecular weight of 56 kDa. All other reagents were purchased from Sigma–Aldrich Ltd.

2.2. Characterisation of starches
Starch moisture was determined gravimetrically by weighing the starch sample onto pre-dried aluminium pans that were then heated overnight at approximately 103 °C. Upon removal, the dried weight was recorded and the moisture content was calculated by the difference between fresh weight and dry weight. The amylose/amylopectin content for the starches was analysed using the iodine dye binding method of Knutson, 1986 and Knutson, 2000. Briefly, starch samples including amylose standards, were dissolved in dimethyl sulphoxide (DMSO) containing iodine and water. Samples were then diluted and left for 30 min to allow colour development, before the absorbance was recorded spectrophotometrically at 600 nm (CE 2041, Cecil Instruments, Cambridge, UK). The amylose content was then calculated from appropriate amylose standards. Protein content was determined using the bicinchoninic (BCA) assay, which involves dissolving 50–100 mg of starch in 2% sodium dodecyl sulphate (SDS) before boiling for 2 h to extract the proteins (Baldwin, 2001). Each sample was then centrifuged at 13,000 rpm for 10 min before 50 μL was removed and tested by the BCA assay.

2.3. Preparation and digestion of starches
A 5 mg/mL solution of native starch was prepared in PBS and incubated at 37 °C with 4.5 nM (approximately 0.33 IU) porcine pancreatic α-amylase on an inclined rotating table to allow constant end-over-end mixing. Samples were withdrawn at timed intervals up to 120 min and transferred to ice-cold 0.3 M Na2CO3 stop solution in Eppendorf tubes. The ice-cold stop solution rapidly cools the reaction sample and raises the pH to a level where amylase is no longer active. The Eppendorfs were then centrifuged and the supernatant was collected and used for determination of reducing sugar concentration by a Prussian blue assay (Slaughter, Ellis, & Butterworth, 2001). Each sample was diluted in water before 150 μL aliquots of solution A (16 mM KCN, 0.19 M Na2CO3 in distilled H2O) and solution B (1.18 mM K3Fe(CN)6 in distilled H2O) were added. Samples were then boiled for 15 min and allowed to cool at room temperature before 750 μL of solution C (3.11 mM NH4Fe(SO4)2, 0.1% (w/w) SDS, 0.2% (v/v) H2SO4 in distilled H2O) was added. The tubes were allowed to stand at room temperature for 2.5 h before the absorbance was recorded at 695 nm. Maltose standards ranging from 0 to 100 μM were treated similarly and used for quantification of the content of reducing sugar expressed as maltose equivalents. For studies of gelatinised material, starch was heated for 20 min at 90 °C and then cooled to 37 °C before α-amylase was added to produce a final concentration of 2.25 nM. Starch containing retrograded material was prepared by similar heat treatment followed by a storage period of 24 h at room temperature before α-amylase was added to give an enzyme concentration of 2.25 nM for digestibility measurements.

The slopes of digestibility curves were measured at various time points throughout the incubation period, converted to logarithmic form and then fitted to the first-order kinetic model (see Butterworth et al. (2012) for details of the relatively straightforward calculations). Accurate estimate of the pseudo rate constant, k, and the total digestible starch, C∞, are obtainable from plots of LOS against time.

2.4. FTIR-ATR spectroscopy
Absorbance spectra were recorded using a Perkin Elmer Spectrum Two® FTIR spectroscope equipped with a SensIR technologies IR II Durascope® diamond cell ATR device. The spectroscope was fitted with PerkinElmer Spectrum 10© software for peak detection. This was accompanied with a diamond crystal with an angle of incidence of 45°. A 10 μL aliquot of 10 mg/mL starch in distilled H2O was placed on the surface crystal of the ATR device. The starch sample was then scanned over a wavelength range of 4000 cm−1 to 550 cm−1, and averaged from a total of 24 scans with a resolution of 4 cm−1. For gelatinised material, a 10 mg/mL mixture was heated in distilled H2O at 90 °C for 20 min, returned to room temperature (20 °C) and allowed to cool to 37 °C, before FTIR spectra were taken. Retrograded starch was prepared by a similar heat treatment procedure but stored at room temperature for 24 h before a spectrum was taken. A spectrum for distilled H2O was also measured and subtracted from the final sample spectra before the data were normalised and compared (Warren et al., 2011).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1 สมบัติ และเคมีภัณฑ์แป้งข้าวสาลี (Cerestar, GL04 พันธุ์) และแป้งถั่วชนิดป่าได้ของขวัญจาก Hedley C. รศ.และศ.ต. Bogracheva (ชื่อเดิมของจอห์น Innes ศูนย์ นอริช UK) แป้งมันฝรั่งบริสุทธิ์ถูกซื้อจากแป้งแห่งชาติและ บริษัทเคมี (สมาชิกของกลุ่มเหมา ลอนดอน สหราชอาณาจักร) ข้าวโพด แว็กซี่ข้าวโพด และแป้งข้าวโพดปรับได้ของขวัญจากดร. C. Pelkman ที่ Ingredion แป้งได้รับจาก Durum จำกัดซิก-Aldrich ข้าวสาลีธัญพืชสกัดแป้งข้าวสาลี durum ที่ซื้อจาก Millbo อิตาลี และสกัด โดยวิธีการอธิบายไว้ใน Vansteelandt และ Delcour (1999) วิธีการปรับเปลี่ยนที่เกรนถูกผสมโดยใช้ homogeniser เป็นอัลตร้า Turrax และผ่าน 250 และ 125 μm sieves (Vansteelandt & Delcour, 1999) เม็ดน้ำเกลือ (PBS) ฟอสเฟต buffered ถูกซื้อจาก Oxoid จำกัด Basingstoke แฮมเชียร์ UK เมื่อส่วนยุบตามคำแนะนำของผู้ผลิต การแก้ไขปัญหาค่า pH 7.3 ± 0.2 ที่ 25 ° C ได้รับ ช่วงตับอ่อนα-amylase (ชนิด 1A รักษา DFP) ถูกซื้อจากบริษัทซิก-Aldrich จำกัด (Poole ดอร์เซ็ท UK) เป็นระงับใน 2.9 M NaCl โซลูชันประกอบด้วย 3 มม. CaCl2 กิจกรรมที่ระบุ โดยผู้ผลิตได้ประมาณ 1333 หน่วย/มิลลิกรัมโปรตีน หน่วยตรงกับ 0.97 IU ที่ 25 ° C (Tahir เอลลิส และบัตเตอร์ เวิร์ท 2010) ความบริสุทธิ์ของα-amylase ได้ตรวจสอบ โดย SDS เพจที่ยัง ยืนยันน้ำหนักโมเลกุลของ 56 kDa Reagents อื่น ๆ ซื้อจากซิก-Aldrich จำกัด2.2 การตรวจลักษณะเฉพาะของของสมบัติความชื้นของแป้งถูกกำหนด gravimetrically โดยชั่งตัวอย่างแป้งบนกระทะอะลูมิเนียมก่อนแห้งที่ถูกอุ่นค้างคืนที่ประมาณ 103 องศาเซลเซียสแล้ว เมื่อเอาออก บันทึกน้ำหนักแห้ง และชื้นถูกคำนวณ โดยความแตกต่างระหว่างน้ำหนักสดและน้ำหนักแห้ง เนื้อหา ปรับ/amylopectin ของสมบัติเป็น analysed ใช้ย้อมไอโอดีนผูกวิธี Knutson, 1986 และ Knutson, 2000 แป้งรวมทั้งมาตรฐานและตัวอย่างสั้น ๆ ถูกละลายใน sulphoxide dimethyl (DMSO) ประกอบด้วยไอโอดีนและน้ำ ตัวอย่างแล้วทำให้เจือจาง และทิ้งใน 30 นาทีให้สีพัฒนา ก่อน absorbance ที่บันทึก spectrophotometrically ที่ 600 nm (CE 2041 เซซิลเครื่อง เคมบริดจ์ สหราชอาณาจักร) เนื้อหาและมีคำนวณแล้วจากมาตรฐานและความเหมาะสม โปรตีนถูกกำหนดใช้ทดสอบ bicinchoninic (BCA) ซึ่งเกี่ยวข้องกับการยุบ 50 – 100 มิลลิกรัมของแป้งใน 2% โซเดียม dodecyl ซัลเฟต (SDS) ก่อนที่จะต้มใน 2 h แยกโปรตีน (บอลด์วิน 2001) ตัวอย่างแต่ละถูกแล้ว centrifuged ที่ 13000 rpm สำหรับ 10 นาทีก่อนเอาออก และทดสอบ โดยทดสอบ BCA 50 μL2.3 การเตรียมการและการย่อยอาหารของสมบัติโซลูชัน 5 mg/mL ของแม่แป้งเตรียมใน PBS และ incubated ที่ 37 ° C กับ 4.5 nM (ประมาณ 0.33 IU) ช่วงตับอ่อนα-amylase ในตารางการหมุนกินให้สิ้นสุดมากกว่าส่วนผสมคง ตัวอย่างถูกถอนในช่วงเวลา 120 นาทีและโอนย้ายไปฉ่ำ 0.3 M Na2CO3 โซลูชั่นครบใน Eppendorf หลอด โซลูชั่นครบฉ่ำน่าตัวอย่างปฏิกิริยาอย่างรวดเร็ว และเพิ่ม pH ระดับ amylase ไม่ใช้งาน Eppendorfs ถูก centrifuged แล้ว และ supernatant ถูกรวบรวม และใช้สำหรับการกำหนดความเข้มข้นของน้ำตาลที่ลดลง โดยวิเคราะห์ Prussian blue (ฆ่า เอลลิส และบัตเตอร์ เวิร์ท 2001) แต่ละตัวอย่างถูกทำให้เจือจางในน้ำก่อน 150 μL aliquots ของ A (16 มม. KCN, 0.19 M Na2CO3 ใน H2O กลั่น) และโซลูชั่น B (1.18 mM K3Fe (CN) 6 ใน H2O กลั่น) เพิ่มขึ้น ตัวอย่างแล้วต้มใน 15 นาที และอนุญาตให้เย็นอุณหภูมิห้องก่อน μL 750 ของ C (3.11 มม. NH4Fe (SO4) 2, 0.1% (w/w) SDS, 0.2% (v/v) กำมะถันใน H2O กลั่น) เพิ่มขึ้น หลอดได้รับอนุญาตให้ตั้งอุณหภูมิห้อง 2.5 h ก่อน absorbance ที่ถูกบันทึกไว้ที่ 695 nm มาตรฐาน maltose ตั้งแต่ 0 ถึง 100 μM ได้ถือว่าทำนองเดียวกัน และใช้สำหรับนับเนื้อหาลดน้ำตาลแสดงเป็นเทียบเท่า maltose ศึกษาวัสดุ gelatinised แป้งถูกความร้อนใน 20 นาทีที่ 90 ° C แล้ว ระบายความร้อนด้วยถึง 37 ° C ก่อนα-amylase ได้เพิ่มการผลิตเข้มข้นสุดท้ายของ 2.25 nM แป้งที่ประกอบด้วยวัสดุ retrograded ถูกเตรียม ด้วยคล้ายกันความร้อนตามระยะเวลาเก็บ 24 ชมที่อุณหภูมิห้องก่อนα-amylase ได้เพิ่มให้มีความเข้มข้นเอนไซม์ของ 2.25 nM สำหรับ digestibility วัดลาดของ digestibility โค้งวัด ณจุดเวลาต่าง ๆ ตลอดระยะเวลาการบ่ม แปลงฟอร์มลอการิทึมแล้ว พอดีกับแรกสั่งเดิม ๆ รุ่น (ดู al. และบัตเตอร์เวิร์ท (2012) สำหรับรายละเอียดของการคำนวณที่ค่อนข้างตรงไปตรงมา) ประเมินความถูกต้องของค่าคงอัตราหลอก k และรวม digestible แป้ง C∞ มีสิทธิได้รับจากผืนลอสกับเวลา2.4 การก FTIR-เอทีอาร์แรมสเป็คตรา absorbance ถูกบันทึกไว้โดยใช้ spectroscope FTIR ®เพอร์เอลเมอสเปกตรัมสองที่เพียบพร้อมไป ด้วย SensIR เทคโนโลยี IR II Durascope ®ไดมอนด์เซลล์เอทีอาร์อุปกรณ์ Spectroscope ถูกอาบ 10 สเปกตรัม PerkinElmer © ซอฟต์แวร์สำหรับตรวจสอบยอด นี้ถูกพร้อมคริสตัลเพชรกับการเกิดของมุม 45 องศา ส่วนลงตัว 10 μL ของแป้ง 10 mg/mL ใน H2O กลั่นถูกวางบนคริสตัลพื้นผิวของอุปกรณ์เอทีอาร์ ตัวอย่างแป้งแล้วสแกนช่วงความยาวคลื่นของ cm−1 4000 ไป 550 cm−1 และ averaged จากทั้งหมด 24 สแกนด้วยความละเอียดของ 4 cm−1 สำหรับวัสดุ gelatinised ผสม 10 mg/mL ถูกความร้อนใน H2O กลั่นที่ 90 ° C สำหรับ 20 นาที กลับสู่อุณหภูมิห้อง (20 ° C) และอนุญาตให้เย็นถึง 37 ° C ก่อนที่ถ่าย FTIR แรมสเป็คตรา Retrograded แป้งไว้ ด้วยกระบวนความร้อนรักษาคล้ายกัน แต่เก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องใน 24 ชมก่อนหลัก ๆ ถูกนำ สเปกตรัมสำหรับ H2O กลั่นยังมีวัด และหักออกจากแรมสเป็คตราตัวอย่างสุดท้ายก่อนที่ข้อมูลถูก normalised และเปรียบเทียบ (วอร์เรน et al., 2011)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 แป้งและสารเคมี
แป้งข้าวสาลี (Cerestar, CV. GL04) และประเภทป่าแป้งถั่วเป็นของขวัญจากศ. C. Hedley และศต Bogracheva (ก่อนถึงจอห์นอินส์เซ็นเตอร์วิชสหราชอาณาจักร) แป้งมันฝรั่งบริสุทธิ์ถูกซื้อมาจาก National Starch และ Chemical Company (สมาชิกของกลุ่มไอซีไอลอนดอนสหราชอาณาจักร) ข้าวโพดเลี้ยงสัตว์ข้าวโพดข้าวเหนียวและแป้งข้าวโพดอะมิโลสสูงเป็นของขวัญจากดร. C. Pelkman ที่ Ingredion ข้าวแป้งที่ได้รับจาก จำกัด บริษัท Sigma-Aldrich Durum เมล็ดข้าวสาลีสำหรับการสกัดแป้งข้าวสาลี durum ถูกซื้อจาก Millbo อิตาลีและสกัดด้วยวิธีการอธิบายใน Vansteelandt และ Delcour (1999) วิธีการปรับเปลี่ยนในการที่เมล็ดถูกผสมโดยใช้ homogeniser พิเศษ Turrax และผ่าน 250 และ 125 ไมโครเมตร sieves (Vansteelandt & Delcour, 1999) ฟอสเฟตน้ำเกลือบัฟเฟอร์ (PBS) แท็บเล็ตที่ซื้อมาจาก Oxoid จำกัด เบซิง Hampshire, UK เมื่อละลายตามคำแนะนำของผู้ผลิต, การแก้ปัญหาของค่า pH 7.3 ± 0.2 ที่ 25 ° C จะได้รับ ตับอ่อน Porcine αอะไมเลส (ชนิด 1A, DFP ได้รับการรักษา) ซื้อมาจาก บริษัท Sigma-Aldrich จำกัด (พูลดอร์เซ็สหราชอาณาจักร) เป็นระงับใน 2.9 M แก้ปัญหาโซเดียมคลอไรด์ที่มี 3 มม CaCl2 กิจกรรมที่ระบุไว้โดยผู้จัดจำหน่ายอยู่ที่ประมาณ 1,333 หน่วย / มก. โปรตีน หน่วยสอดคล้องกับ 0.97 IU ที่ 25 ° C (อับเอลลิสและบัตเตอร์, 2010) ความบริสุทธิ์ของαอะไมเลสได้รับการตรวจสอบโดยวิธี SDS-PAGE ที่ยังยืนยันน้ำหนักโมเลกุล 56 กิโลดาลตัน ทั้งหมดน้ำยาอื่น ๆ ที่ซื้อมาจาก บริษัท Sigma-Aldrich จำกัด2.2 ลักษณะเฉพาะของแป้งแป้งความชื้นถูกกำหนด gravimetrically โดยการชั่งน้ำหนักตัวอย่างแป้งลงบนกระทะอลูมิเนียมก่อนแห้งที่ถูกความร้อนแล้วค้างคืนที่ประมาณ 103 ° C เมื่อกำจัดน้ำหนักแห้งจะถูกบันทึกและความชื้นที่คำนวณได้จากความแตกต่างระหว่างน้ำหนักสดและน้ำหนักแห้ง อะมิโลส / เนื้อหา amylopectin สำหรับสตาร์ชได้รับการวิเคราะห์โดยใช้วิธีการผูกย้อมไอโอดีนของ Knutson 1986 และ Knutson 2000 สั้น ๆ ตัวอย่างแป้งรวมถึงมาตรฐานอะไมโลสถูกกลืนหายไปใน dimethyl sulphoxide (DMSO) ที่มีไอโอดีนและน้ำ ตัวอย่างถูกเจือจางแล้วและเหลือเวลา 30 นาทีเพื่อให้การพัฒนาสีก่อนที่จะดูดกลืนแสงที่ถูกบันทึกไว้ spectrophotometrically ที่ 600 นาโนเมตร (CE 2041, เซซิล, เครื่องดนตรี, เคมบริดจ์, สหราชอาณาจักร) ปริมาณอะไมโลที่คำนวณแล้วจากมาตรฐานอะไมโลสที่เหมาะสม ปริมาณโปรตีนที่ถูกกำหนดโดยใช้ bicinchoninic (BCA) การทดสอบที่เกี่ยวข้องกับการละลาย 50-100 มิลลิกรัมของแป้งใน 2% โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS) ก่อนที่จะเดือดเป็นเวลา 2 ชั่วโมงในการสกัดโปรตีน (บอลด์วิน, 2001) ตัวอย่างแต่ละคนได้ปั่นแล้วที่ 13,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาทีก่อนที่จะ 50 ไมโครลิตรถูกลบออกและทดสอบโดยการทดสอบ BCA. 2.3 การจัดเตรียมและการย่อยแป้ง5 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรวิธีการแก้ปัญหาของแป้งถูกจัดทำขึ้นในพีบีเอสและบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสกับ 4.5 นาโนเมตร (ประมาณ 0.33 IU) หมูตับอ่อนαอะไมเลสบนโต๊ะหมุนเอียงเพื่อให้คงที่แบบ end-กว่าสิ้น การผสม ตัวอย่างถูกถอนออกในช่วงเวลาที่กำหนดได้ถึง 120 นาทีและโอนไปยังเย็น 0.3 M Na2CO3 โซลูชั่นครบวงจรในหลอด Eppendorf โซลูชั่นแบบครบวงจรเย็นอย่างรวดเร็วเย็นตัวอย่างการเกิดปฏิกิริยาและเพิ่มค่า pH ให้อยู่ในระดับที่อะไมเลสจะไม่มีการใช้งานอีกต่อไป Eppendorfs ถูกปั่นแล้วและใสถูกเก็บรวบรวมและใช้สำหรับการกำหนดของการลดความเข้มข้นของน้ำตาลโดยการทดสอบสีฟ้าปรัสเซีย (ฆ่าเอลลิสและบัตเตอร์, 2001) แต่ละตัวอย่างถูกเจือจางในน้ำก่อน 150 ไมโครลิตรส่วนลงตัวของการแก้ปัญหา (16 มิลลิคณะ, 0.19 M Na2CO3 ใน H2O กลั่น) และการแก้ปัญหา B (1.18 มิลลิ K3Fe (CN) 6 กลั่น H2O) ถูกเพิ่ม ตัวอย่างที่ถูกต้มแล้ว 15 นาทีและได้รับอนุญาตให้เย็นที่อุณหภูมิห้องก่อนที่ 750 ไมโครลิตรของการแก้ปัญหา C (3.11 มิลลิ NH4Fe (SO4) 2, 0.1% (w / W) SDS, 0.2% (v / v) ใน H2SO4 กลั่น H2O) ถูกเพิ่มเข้ามา หลอดได้รับอนุญาตให้ยืนที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2.5 ชั่วโมงก่อนที่จะดูดกลืนแสงที่ถูกบันทึกไว้ที่ 695 นาโนเมตร มาตรฐานมอลโตสตั้งแต่ 0-100 ไมครอนได้รับการรักษาในทำนองเดียวกันและใช้สำหรับปริมาณของเนื้อหาของการลดน้ำตาลแสดงเป็นรายการเทียบเท่ามอลโตส สำหรับการศึกษาของวัสดุ gelatinised แป้งที่ถูกความร้อนเป็นเวลา 20 นาทีที่ 90 ° C แล้วระบายความร้อนถึง 37 องศาเซลเซียสก่อนที่จะαอะไมเลสถูกเพิ่มเข้ามาในการผลิตที่มีความเข้มข้นสุดท้ายของ 2.25 นาโนเมตร แป้งที่มีส่วนผสมของวัสดุรีโทรเกรดได้รับการจัดทำขึ้นโดยการรักษาความร้อนที่คล้ายกันตามระยะเวลาการเก็บรักษา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องก่อนที่จะαอะไมเลสถูกเพิ่มเข้ามาเพื่อให้ความเข้มข้นของเอนไซม์ 2.25 นาโนเมตรสำหรับการตรวจวัดการย่อย. ลาดชันของเส้นโค้งการย่อยได้ถูกวัดที่จุดเวลาต่างๆ ตลอดระยะเวลาการบ่มแปลงรูปแบบลอการิทึมแล้วพอดีกับลำดับแรกรูปแบบการเคลื่อนไหว (ดูบัตเตอร์เวิ et al. (2012) สำหรับรายละเอียดของการคำนวณที่ค่อนข้างตรงไปตรง) ประมาณการที่แม่นยำของอัตราหลอกคงที่ k และแป้งที่ย่อยรวมC∞จะได้รับจากการแปลง LOS กับเวลา. 2.4 สเปกโทรสโก FTIR-ATR สเปกตรัมการดูดกลืนแสงที่ถูกบันทึกไว้โดยใช้คลื่นความถี่ Perkin Elmer Two® FTIR สเปกโตรสโคปพร้อมกับเทคโนโลยี SensIR IR II Durascope®เพชรมือถืออุปกรณ์ ATR สเปกโตรสโคปก็พอดีกับ PerkinElmer สเปกตรัม 10 ©ซอฟแวร์สำหรับการตรวจหาจุดสูงสุด นี้ได้รับการพร้อมกับคริสตัลเพชรกับมุมตกกระทบ 45 องศา aliquot ไมโครลิตร 10 10 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรแป้งใน H2O กลั่นถูกวางลงบนพื้นผิวของผลึกอุปกรณ์ ATR ตัวอย่างแป้งได้รับการสแกนแล้วกว่าช่วงความยาวคลื่นของ 4000 cm-1-550 เซนติเมตร-1, และเฉลี่ยจากทั้งหมด 24 สแกนด้วยความละเอียด 4 เซนติเมตร-1 สำหรับวัสดุ gelatinised, 10 mg / มิลลิลิตรผสมร้อนใน H2O กลั่นที่ 90 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 นาทีกลับไปที่อุณหภูมิห้อง (20 องศาเซลเซียส) และได้รับอนุญาตให้เย็นถึง 37 องศาเซลเซียสก่อนที่จะ FTIR สเปกตรัมถูกนำ แป้งรีโทรเกรดได้รับการจัดทำขึ้นโดยมีขั้นตอนการรักษาความร้อนที่คล้ายกัน แต่เก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 24 ชั่วโมงก่อนที่จะถูกนำคลื่นความถี่ คลื่นความถี่สำหรับกลั่น H2O วัดและยังหักออกจากสเปกตรัมตัวอย่างสุดท้ายก่อนที่จะมีข้อมูลปกติและเมื่อเทียบกับ (วอร์เรน et al., 2011)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . แป้งและสารเคมี
แป้งข้าวสาลี ( เซรีสตาร์ , CV . gl04 ) และประเภทแป้งป่าถั่วได้ของขวัญจาก ศ. ซี. Hedley และ ศ. ต. bogracheva ( เดิมจากศูนย์ , จอห์น นน นอริช สหราชอาณาจักร ) และแป้งมันฝรั่งซื้อแห่งชาติจากแป้งและบริษัทเคมี ( สมาชิกของกลุ่ม , ลอนดอน , ICI ) ข้าวโพดข้าวโพดข้าวเหนียว ข้าวโพดและข้าวโพดอะไมโลสสูง แป้งเป็นของขวัญจาก ดร. ซี. pelkman ที่ ingredion . ข้าวแป้งที่ได้จากข้าวสาลี durum ดิช– Sigma จำกัดธัญพืชข้าวสาลี durum สำหรับการสกัดแป้งซื้อจาก millbo , อิตาลี และ สกัดโดยวิธีที่อธิบายไว้ใน vansteelandt และ delcour ( 1999 )วิธีการแก้ไขในธัญพืชผสมโดยใช้อัลตร้า turrax homogeniser ผ่าน 250 และ 125 μ M ตะแกรง ( vansteelandt & delcour , 1999 ) เกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ( PBS ) เม็ดที่ซื้อมาจาก oxoid จำกัด Basingstoke Hampshire , สหราชอาณาจักร . เมื่อละลายตามคําแนะนําของผู้ผลิตโซลูชั่นของ pH 7.3 ±ที่ 25 ° C 0.2 )จากตับอ่อน แอลฟาอะไมเลส ( ประเภท 1A , dfp ถือว่า ) ซื้อจากซิกม่า – อัลดริช จำกัด บริษัท ( พูล , Dorset , สหราชอาณาจักร ) เป็นระงับใน 2.9 M NaCl สารละลายที่มี CaCl2 3 มิลลิเมตร กิจกรรมระบุไว้โดยซัพพลายเออร์ประมาณ 1060 หน่วย / มก. โปรตีน หน่วยสอดคล้องกับ 0.97 IU ที่ 25 ° C ( รุ่น เอลลิส & Butterworth , 2010 )ความบริสุทธิ์ของแอลฟาอะไมเลสถูกตรวจสอบความถูกต้องโดยเอนไซม์ที่ยังยืนยันที่น้ำหนักโมเลกุล 56 กิโลดาลตัน สารเคมีอื่น ๆทั้งหมด ซื้อมาจากดิช–ซิกม่าจำกัด

2.2 . ลักษณะของแป้ง
ความชื้นแป้งตั้งใจ gravimetrically โดยชั่งแป้งลงบนกระทะก่อนตัวอย่างอลูมิเนียมที่ถูกความร้อนแล้วค้างคืนที่ประมาณ 103 องศา เมื่อถอดแห้งโดยน้ำหนักแห้งและบันทึกความชื้นได้คำนวณความแตกต่างระหว่างน้ำหนักสดและน้ำหนักแห้ง ปริมาณอะไมโลส / อะไมโลเพคตินสำหรับแป้งวิเคราะห์โดยใช้ไอโอดีนย้อมผูกวิธีคนูตสัน , 1986 และ คนูตสัน , 2000 สั้น , ตัวอย่างแป้งรวมทั้งมาตรฐานอะไมโลส , ละลายในไดเมทิล sulphoxide ( DMSO ) ที่มีไอโอดีนและน้ำจำนวน แล้วเจือจาง และทิ้งไว้ 30 นาที เพื่อให้พัฒนาสี ก่อนจะดูดกลืนบันทึกนี้ที่ 600 nm ( CE 2041 Cecil เครื่องมือ , Cambridge , UK ) มีปริมาณอะไมโลสถูกคำนวณจากปริมาณมาตรฐานที่เหมาะสม โปรตีนถูกกำหนดโดยใช้ bicinchoninic ( BCA ) โดยซึ่งเกี่ยวข้องกับการละลาย 50 – 100 mg ของแป้งใน 2% โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต ( SDS ) เดือดก่อน 2 ชั่วโมง เพื่อสกัดโปรตีน ( Baldwin , 2001 ) แต่ละตัวอย่างมีแล้วที่ 13 , 000 รอบต่อนาทีระดับ 10 นาทีก่อน 50 μผมลบออกและการทดสอบโดย BCA ( . . .

2.3 การเตรียมและการย่อยแป้ง
5 / ml สารละลายแป้งที่เตรียมไว้ใน PBS บ่มที่ 37 ° C ที่มี 4 มิลลิกรัม5 nm ( ประมาณ 0.33 IU ) อะไมเลสจากตับอ่อนแอลฟาบนเอียงหมุนโต๊ะเพื่อให้คงที่สุดเหนือสุดกวน ตัวอย่างที่ถูกถอนในเวลาที่กําหนดถึง 120 นาทีและโอนให้เย็น 0.3 M Na2CO3 หยุดโซลูชันในเพนดอร์ฟหลอด น้ำแข็งหยุดเย็นโซลูชั่นอย่างรวดเร็ว เมื่อปฏิกิริยาตัวอย่างและเพิ่ม pH ให้อยู่ในระดับที่เลส ไม่ใช้งานการ eppendorfs แล้วไฟฟ้าและนำมันเก็บรวบรวมและใช้สำหรับการหาความเข้มข้นของน้ำตาลรีดิวซ์จากปรัสเซียฟ้า assay ( ฆ่า เอลลิส & Butterworth , 2001 ) แต่ละตัวอย่างที่เจือจางในน้ำก่อน 150 μผมเฉยๆของสารละลาย ( 16 มม. kcn 0.19 ม. , Na2CO3 ในกลั่น H2O ) และโซลูชั่น B ( 1.18 มิลลิเมตร k3fe ( CN ) 6 กลั่น H2O ) มีการเพิ่มจำนวนก็ต้มประมาณ 15 นาที และได้รับอนุญาตให้เย็นที่อุณหภูมิห้องก่อนที่จะμ 750 ลิตรโซลูชั่น C ( 3.11 มม. nh4fe ( ปา ) 2 , 0.1% ( w / w ) 0.1 , 0.2 เปอร์เซ็นต์ ( v / v ) กรดซัลฟิวริกในกลั่น H2O ) ถูกเพิ่มเข้ามา หลอดได้รับอนุญาตให้ยืนที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2.5 H ก่อนการดูดกลืนแสงเท่ากับ 695 nm .มอลโตสมาตรฐานตั้งแต่ 0 ถึง 100 μ M ได้รับการรักษาเดียวกันและใช้ปริมาณของปริมาณของน้ำตาลรีดิวซ์ แสดงเป็น มอลโตสเทียบเท่า . การศึกษาวัสดุ gelatinised แป้งก็ร้อนสำหรับ 20 นาทีที่ 90 ° C และเย็นแล้วถึง 37 องศา C ก่อนแอลฟาอะไมเลส ได้เพิ่มการผลิตความเข้มข้นสุดท้าย 25 นาโนเมตรแป้งผสม retrograded วัสดุที่เตรียมไว้ โดยการรักษาความร้อนที่คล้ายกันตามระยะเวลาการเก็บรักษา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องก่อนที่แอลฟาอะไมเลสถูกเพิ่มเพื่อให้ความเข้มข้นของเอนไซม์ของ 2.25 nm สำหรับการวัดค่าการย่อยได้

ความชันของเส้นโค้งที่ได้ทำการวัดคะแนนเวลาต่างๆ ตลอดระยะเวลาที่แปลงเป็นรูปแบบลอการิทึมและพอดีกับปฏิกิริยาแบบแรก ( ดู Butterworth et al . ( 2012 ) รายละเอียดของการคำนวณที่ค่อนข้างตรงไปตรง ) การประเมินความถูกต้องของค่าคงที่ K เทียมและรวมที่ย่อยแป้ง , C ∞ , ได้มาจากแปลงของลอสกับเวลา

2.4 .
ftir-atr สเปกโทรสโกปีการดูดกลืนสเปกตรัมที่ถูกบันทึกไว้โดยใช้เพอร์กินเอลเมอร์สเปกตรัม 2 ® FTIR สเปคโตรสโคป เพียบพร้อมด้วยเทคโนโลยี sensir IR 2 durascope ®เพชรเซลล์ชนิดอุปกรณ์ สเปกโตรสโคปติดตั้ง Perkinelmer สเปกตรัม 10 สงวนลิขสิทธิ์ซอฟต์แวร์สำหรับตรวจจับสูงสุด นี้มาพร้อมกับเพชรคริสตัลด้วยมุมตกกระทบ 45 องศา .10 μ L ส่วนลงตัวของ 10 mg / ml แป้งในกลั่น H2O ถูกวางไว้บนพื้นผิวผลึกของชนิดอุปกรณ์ แป้งตัวอย่างแล้วสแกนกว่าช่วงความยาวคลื่น 4000 cm − 1 550 cm − 1 และเฉลี่ยจากทั้งหมด 24 สแกนด้วยความละเอียด 4 cm − 1 สำหรับวัสดุ gelatinised , 10 / ml ส่วนผสมอุ่นในกลั่น H2O ที่ 90 °องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 นาทีมิลลิกรัมกลับไปที่อุณหภูมิห้อง ( 25 องศา C ) และอนุญาตให้เย็น 37 ° C , FTIR spectra ก่อนถูกจับไป retrograded แป้งที่เตรียมไว้ โดยมีขั้นตอนการรักษาความร้อนที่คล้ายกัน แต่เก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 24 ชั่วโมงก่อนสเปกตรัมถูกจับตัวไป สเปกตรัมสำหรับกลั่น H2O ยังวัดและหักออกจากสเปกตรัมตัวอย่างสุดท้ายก่อนทำการบันทึกและเปรียบเทียบ ( วอร์เรน et al . , 2011 )