Treatment of AnimalsAll procedures

Treatment of Animals
All procedures were performed at the North Dakota
State University Animal Nutrition and Physiology Center
(ANPC) located in Fargo, ND (approximately 46.9°
latitude and −96.8° longitude) and were approved by
the Institutional Animal Care and Use Committee of
NDSU.
Eighteen (2- to 3-yr-old), western range (predominantly
Targhee and Rambouillet) ewes of similar BW
(47.0 ± 1.5 kg; mean ± SEM) and BCS (3.36 ± 0.04) were
used in the study. Body condition score was determined
using a 5-point scale (1 = extremely thin to 5 = extremely
fat). Ewes were housed and fed in individual
pens (0.86 × 1.47 m) at theANPCunder 14 h of darkness
and 10 h of light at 12°C with free access to water and
mineral supplements. Ewes were randomly divided into
2 groups (n = 9/each). Both groups were adapted during
the first 4-wk (acclimation) period to 2 planes of nutrition
(control and underfed). During the next 4 wk (second
period), control ewes (adequate) were fed to maintain
BW, whereas underfed ewes (restricted) received
60% of the daily dietary allocation for control ewes (see
nutritional management section). Once each week,
throughout the duration of the experiment, ewes were
weighed and BCS was determined.
To synchronize estrus, 30 d after initiation of the
nutritional treatment, chronogest (progestagen)
sponges (30 mg of flugestone acetate/sponge; Intervet,
UK) were inserted into the vagina for 14 d. Through
the use of vasectomized rams, estrus (d 0) was detected
40 to 48 h after sponge withdrawal. Ewes received twice
daily (morning and evening) injections with FSH-P
(Sioux Biochemical, Sioux Center, IA) on d 13 (5 units/
injection) and 14 (4 units/injection) after estrus, as described
previously (Stenbak et al., 2001). On d 15 of
the subsequent estrous cycle, ewes were ovariectomized
(Luther et al., 2005). The study was initiated during
the normal breeding season in September and finished
in December.
Nutritional Management
After arrival and a 3-d adaptation to individual pens
and pelleted diets, ewes were allocated randomly to 2
nutritional groups, as just described. The diet contained
(% of dietary DM): dehydrated beet pulp, 36.5%; dehydrated
alfalfa, 20.3%; corn, 24.2%; soy hulls, 16%; and
soybean meal, 3.0%. The pelleted (0.48-cm diameter)
diet, which was prepared and analyzed on site, supplied
2.4 Mcal of ME and 130 g (13%) of CP per kg of diet
(DM basis) and was offered in 1 equal portion daily.
During the first 4-wk (acclimation) period, control ewes
received 1,000 g/d and underfed ewes received 600 g/d
(DM basis). The acclimation period transitioned ewes
into the second 4-wk period, which again contained 2
different planes of nutrition. After the first 4-wk acclimation
period, dietary intake was reduced in control
ewes so that BW and condition were maintained (adequate;
fed 720 g/d of diet DM) and underfed ewes were
restricted to 60% of controls (restricted; fed 432 g/d of
diet DM). Ewes were then maintained on their respective
planes of nutrition for 4 wk, until oocyte collection.
Oocyte Collection
After ovariectomy, the ovaries were immersed in PBS
and transported to the laboratory in an incubator at
39°C. The number of visible small (≤3mm) and large
(>3mm) follicles on each ovary was determined, and
cumulus oocyte complexes were isolated by opening
each visible follicle with a scalpel blade and flushing it
2 to 3 times with oocyte collection medium (Grazul-
Bilska et al., 2003, 2005; Luther et al., 2005). Under a
stereomicroscope, cumulus oocyte complexes were recovered
from each dish and transferred to a petri dish
containing fresh collection medium without heparin.
Cumulus oocyte complexes were then evaluated and
categorized as healthy or atretic based on their morphology
(Thompson et al., 1995). All cumulus oocyte
complexes were then washed 3 times in maturation
medium [TCM-199 containing 10% fetal bovine serum,
ovine FSH (5
g/mL; oFSH-RP-1; NIAMDD-NIH,
Bethesda, MD), ovine LH (5
g/mL; oLH-26; NIADDKNIH),
estradiol-17β (1
g/mL; Sigma, St. Louis, MO),
glutamine (2 mM; Sigma), sodium pyruvate (0.25 mM;
Sigma), epidermal growth factor (10 ng/mL; Sigma),
and penicillin/streptomycin (100 units of penicillin/mL
and 100
g of streptomycin/mL; Gibco, Grand Island,
NY)].
In Vitro Maturation
Oocytes were matured in vitro in maturation medium
for 24 h at 39°C in 5% CO2 and 95% air, followed by
cumulus cell removal using 1% (wt/vol) hyaluronidase
(Type I, Sigma) in PBS. Oocytes were again evaluated
for health based on morphology. Oocytes classified as
healthy were used for IVF and were transferred to
equilibrated fertilization medium consisting of synthetic
oviductal fluid prepared in our laboratory (Stenbak
et al., 2001) and containing 2% heat-inactivated
serum collected from sheep on d 0 to 1 of the estrous
cycle (Grazul-Bilska et al., 2003, 2005; Luther et al.,
2005).
In Vitro Fertilization and Embryo Culture
Frozen capacitated semen pooled from 4 Hampshire
rams was thawed, and viable sperm were separated

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

รักษาสัตว์ดำเนินขั้นตอนทั้งหมดในนอร์ทดาโคตาอาหารสัตว์มหาวิทยาลัยและศูนย์สาขาสรีรวิทยา(ANPC) แห่งฟาร์โก ND (ประมาณ 46.9 องศาลองจิจูดองศาละติจูดและ −96.8) และได้รับการอนุมัติโดยสถาบันดูแลสัตว์และใช้คณะกรรมการNDSUสิบแปด (2 ไป 3-ปีอายุ), ตะวันตก (เป็นช่วงEwes Targhee และ Rambouillet) ของ BW ที่คล้ายกัน(47.0 ± 1.5 กก. เฉลี่ย± SEM) และการทำข้อมูล BCS (3.36 ± 0.04) ได้ใช้ในการศึกษา กำหนดคะแนนสภาพร่างกายใช้ขนาด 5 จุด (1 =บางมาก 5 =มากไขมัน) ห้องพัก และอาหารในแต่ละ ewesปากกา (0.86 × 1.47 เมตร) ที่ theANPCunder h 14 ของความมืดและ h 10 ไฟที่ 12° C ถึงน้ำฟรี และเสริมแร่ธาตุ Ewes ถูกสุ่มแบ่งออกเป็นกลุ่มที่ 2 (n = 9/แต่ ละคน) ทั้งสองถูกดัดแปลงในระหว่างการแรก 4 wk (acclimation) ระยะเวลาการบินที่ 2 ของโภชนาการ(ควบคุม และ underfed) ระหว่าง wk 4 ถัดไป (สองรอบระยะเวลา), ตัวควบคุม ewes (พอ) ได้ติดตามรักษาBW ในขณะที่ underfed ewes (จำกัด) ได้รับ60% ของการปันส่วนอาหารประจำวันสำหรับตัวควบคุม ewes (ดูจัดการโภชนาการส่วน) เมื่อแต่ละสัปดาห์ตลอดระยะเวลาการทดลอง ewes ได้ชั่งน้ำหนัก และกำหนด BCSการซิงโครไนส์ estrus, d 30 หลังจากการเริ่มต้นของการโภชนาการบำบัด chronogest (progestagen)ฟองน้ำ (30 มิลลิกรัม flugestone acetate/ฟองน้ำ Intervetสหราชอาณาจักร) ถูกใส่เข้าไปในช่องคลอดสำหรับ 14 d. ผ่านการใช้ vasectomized rams, estrus (d 0) พบh 40-48 หลังจากถอนฟองน้ำ Ewes รับสองฉีดทุกวัน (เช้าและเย็น) กับ FSH-P(ชีวเคมีได้แก่ ได้แก่ศูนย์ IA) บน d 13 (หน่วยที่ 5 /ฉีด) และ 14 (4 หน่วย/ฉีด) หลัง estrus ดังที่ก่อนหน้านี้ (Stenbak และ al., 2001) บน d 15 ของต่อวงจร estrous, ewes ได้ ovariectomized(ลูเธอร์ et al., 2005) การศึกษาเป็นจุดเริ่มต้นในระหว่างการฤดูผสมพันธุ์ปกติ ในเดือนกันยายน และสำเร็จรูปในเดือนธันวาคมนี้จัดการโภชนาการหลังจากมาถึงและการปรับตัว 3 d ปากกาแต่ละและอาหาร pelleted, ewes ถูกจัดสรรแบบสุ่ม 2ทางโภชนาการกลุ่ม เป็นเพียงอธิบาย อาหารที่มีอยู่(%ของอาหาร DM): อบแห้งเยื่อผักชนิดหนึ่ง 36.5% อบแห้งalfalfa, 20.3% ข้าวโพด 24.2% hulls ถั่วเหลือง 16% และกากถั่วเหลือง 3.0% การ pelleted (0.48 ซม.เส้นผ่าศูนย์กลาง)อาหาร การเตรียม และวิเคราะห์บนเว็บไซต์ จัด2.4 Mcal ของฉันและ 130 g (13%) ของ CP ต่อกิโลกรัมของอาหาร(DM พื้นฐาน) และคำแนะนำในส่วน 1 เท่าทุกวันช่วงแรก 4-wk (acclimation) ควบคุม ewesรับ 1000 g/d และ underfed ewes ได้รับ 600 g/d(DM พื้นฐาน) ระยะ acclimation transitioned ewesในระยะที่สองของ 4 wk ซึ่งอีกครั้งอยู่ 2เครื่องบินที่แตกต่างกันของสารอาหาร หลังจาก acclimation 4 wk แรกระยะเวลา บริโภคอาหารลดลงในการควบคุมewes นั้นถูกรักษา (เพียงพอ BW และเงื่อนไขรับ 720 g/d ของอาหาร DM) และ underfed ewesจำกัด 60% ของตัวควบคุม (จำกัด ติดตาม 432 g/d ของอาหาร DM) Ewes ได้แล้วอยู่ในแต่ละของพวกเขาเครื่องบินของโภชนาการสำหรับ 4 wk จนถึงคอลเลกชัน oocyteคอลเลกชัน oocyteหลังจาก ovariectomy รังไข่ถูกแช่อยู่ใน PBSและขนย้ายไปปฏิบัติในการบ่มเพาะวิสาหกิจที่39 องศาเซลเซียส จำนวนขนาดเล็กมองเห็นได้ (≤3mm) และขนาดใหญ่(> 3mm) กำหนดรูขุมขนในแต่ละรังไข่ และคอมเพล็กซ์ลัส oocyte ถูกแยกต่างหาก โดยการเปิดแต่ละ follicle เห็นเบลด scalpel และลบรายการนั้น2-3 ครั้งกับ oocyte คอลเลกชันปานกลาง (Grazul-Bilska และ al., 2003, 2005 ลูเธอร์ et al., 2005) ภายใต้การstereomicroscope, oocyte ลัสคอมเพล็กซ์ได้รับการกู้คืนจากอาหารแต่ละจานให้จานเพาะเชื้อและประกอบด้วยการเรียกเก็บเงินสดปานกลางไม่ มีเฮพารินคอมเพล็กซ์ oocyte ลัสได้ประเมินแล้ว และแบ่งเป็นสุขภาพ หรือ atretic ตามสัณฐานวิทยาของพวกเขา(ทอมป์สันและ al., 1995) Oocyte ลัสทั้งหมดสิ่งอำนวยความสะดวกที่ถูกล้างแล้ว 3 ครั้งในพ่อแม่ปานกลาง [TCM 199 มี 10% ครรภ์วัวซีรั่มFSH แพะ (5 g/mL; oFSH-RP-1 NIAMDD-NIHเบเทสดา MD), แพะ LH (5 g/mL; oLH-26 NIADDKNIH),estradiol-17β (1 g/mL ซิกมา St. Louis, MO),glutamine (2 mM ซิกมา), โซเดียม pyruvate (0.25 mMซิกมา), epidermal ปัจจัยการเจริญเติบโต (10 ng/mL ซิกมา),และ streptomycin ยาเพนนิซิลลิน (100 หน่วย/มลยาเพนนิซิลลินและ 100 กรัมของ streptomycin/mL Gibco แกรนด์เกาะNY)]ในพ่อแม่หลอดแช่สารละลายมี matured ในหลอดในพ่อแม่ใน 24 ชมที่ 39° C อากาศ 95% และ 5% CO2 ตามด้วยเอาเซลล์ลัสใช้ hyaluronidase 1% (wt/vol)(พิมพ์ I ซิก) ใน PBS แช่สารละลายถูกประเมินอีกครั้งสุขภาพตามสัณฐานวิทยา แช่สารละลายจัดเป็นสุขภาพใช้สำหรับ IVF และถูกโอนย้ายไปกลาง equilibrated การปฏิสนธิประกอบด้วยหนังสังเคราะห์น้ำมันที่เตรียมไว้ในห้องปฏิบัติการของเรา (Stenbak oviductalและ al., 2001) และประกอบด้วย 2% ความร้อนยกเลิกเซรั่มที่รวบรวมจากแกะบน d 0 ถึง 1 จากที่ estrousวงจร (Grazul Bilska et al., 2003, 2005 ลูเธอร์ et al.,2005)หลอดในปัจจุบันและวัฒนธรรมอ่อนน้ำเชื้อแช่แข็งที่ทางถูกพูจากแฮมเชียร์ 4 capacitatedเป็น thawed rams และสเปิร์มได้ถูกแยกออกจากกัน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

รักษาสัตว์ขั้นตอนทั้งหมดถูกดำเนินการที่ North Dakota State University อาหารสัตว์และสรีรวิทยาศูนย์(ANPC) ตั้งอยู่ในฟาร์โก (ประมาณ 46.9 องศาละติจูดและลองจิจูด-96.8 องศา) และได้รับการอนุมัติโดยดูแลสัตว์สถาบันและการใช้คณะกรรมการNDSU . สิบแปด (2- 3-ปีเก่า) ช่วงตะวันตก (ส่วนใหญ่Targhee และ Rambouillet) ตกลูกของที่คล้ายกัน BW (47.0 ± 1.5 กิโลกรัมหมายถึง± SEM) และ BCS (3.36 ± 0.04) ถูกนำมาใช้ในการศึกษา คะแนนสภาพร่างกายถูกกำหนดโดยใช้ขนาด 5 จุด (1 = บางมากถึง 5 = มากไขมัน) ตกลูกได้ตั้งอยู่และเลี้ยงในแต่ละปากกา (0.86 × 1.47 เมตร) ที่ theANPCunder 14 ชั่วโมงแห่งความมืดและ10 ชั่วโมงของแสงที่ 12 ° C ที่มีอิสระที่จะเข้าถึงน้ำและแร่ธาตุเสริม แกะที่ถูกแบ่งเป็น2 กลุ่ม (n = 9 / แต่ละคน) ทั้งสองกลุ่มถูกดัดแปลงในช่วงแรก 4 สัปดาห์ (acclimation) ระยะเวลา 2 เครื่องบินของโภชนาการ (การควบคุมและการ underfed) ต่อมาในช่วง 4 สัปดาห์ (ที่สองระยะเวลา) ตกลูกควบคุม (เพียงพอ) ได้รับการเลี้ยงดูที่จะรักษาBW ขณะตกลูก underfed (จำกัด ) ได้รับ60% ของการจัดสรรการบริโภคอาหารประจำวันสำหรับแกะควบคุม (ดูส่วนการจัดการทางโภชนาการ) เมื่อแต่ละสัปดาห์ตลอดระยะเวลาของการทดลองแกะถูกชั่งน้ำหนักและBCS ถูกกำหนด. เพื่อประสานตกมัน 30 d หลังจากการเริ่มต้นของการรักษาทางโภชนาการchronogest (progestagen) ฟองน้ำ (30 mg ของอะซิเตท flugestone / ฟองน้ำ; Intervet, สหราชอาณาจักร) ถูกแทรกเข้าไปในช่องคลอดเป็นเวลา 14 วัน ผ่านการใช้งานของแกะ vasectomized การเป็นสัด (ง 0) พบ 40-48 ชั่วโมงหลังจากที่ถอนฟองน้ำ ตกลูกได้รับเป็นครั้งที่สองในชีวิตประจำวัน (เช้าและเย็น) ฉีดกับ FSH-P (ซูชีวเคมีซูศูนย์ IA) ในวันที่ 13 (5 ยูนิต / ฉีด) และ 14 (4 หน่วย / ฉีด) หลังจากเป็นสัดตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้(Stenbak et al, ., 2001) เมื่อวันที่ 15 งของวงจรการเป็นสัดตามมาแกะเป็นตัดรังไข่(ลูเทอร์ et al., 2005) การศึกษาได้ริเริ่มขึ้นในช่วงฤดูผสมพันธุ์ตามปกติในเดือนกันยายนและเสร็จสิ้นในเดือนธันวาคม. การบริหารจัดการทางโภชนาการหลังจากการมาถึงและการปรับตัว 3 d เพื่อปากกาของแต่ละบุคคลและอาหารเม็ด, แกะถูกจัดสรรโดยการสุ่ม 2 กลุ่มทางโภชนาการตามที่อธิบายไว้เพียง การรับประทานอาหารที่มีอยู่(% ของอาหาร DM) เยื่อกระดาษหัวผักกาดแห้ง 36.5%; แห้งหญ้าชนิต, 20.3%; ข้าวโพด 24.2%; เปลือกถั่วเหลือง 16%; และกากถั่วเหลือง 3.0% เม็ด (0.48 เซนติเมตรเส้นผ่าศูนย์กลาง) อาหารซึ่งได้รับการเตรียมความพร้อมและการวิเคราะห์ในเว็บไซต์จัดหา2.4 เมกกะของ ME และ 130 กรัม (13%) ของซีพีต่อกิโลกรัมของอาหาร(พื้นฐาน DM) และถูกนำเสนอใน 1 ส่วนเท่า ๆ กันทุกวัน. ในช่วง ครั้งแรก 4 สัปดาห์ (acclimation) ระยะเวลาตกลูกควบคุมได้รับ1,000 กรัม / วันและตกลูก underfed รับ 600 กรัม / d (พื้นฐาน DM) ระยะเวลาการปรับตัวเปลี่ยนตกลูกออกเป็นระยะเวลา 4 สัปดาห์ที่สองอีกครั้งซึ่งมี 2 เครื่องบินที่แตกต่างกันของสารอาหาร หลังจากครั้งแรก 4 สัปดาห์ปรับตัวระยะเวลาการบริโภคสารอาหารลดลงในการควบคุมแกะเพื่อให้BW และเงื่อนไขการได้รับการเก็บรักษาไว้ (เพียงพออาหาร720 กรัม / d ของอาหาร DM) และตกลูก underfed ถูกจำกัด ให้ 60% ของการควบคุม (จำกัด ; เลี้ยง 432 g / d ของอาหารDM) ตกลูกได้รับการดูแลจากนั้นในตนเครื่องบินของโภชนาการเป็นเวลา 4 สัปดาห์จนถึงคอลเลกชันไข่. ไข่เก็บหลังจาก ovariectomy ที่รังไข่ถูกแช่อยู่ในพีบีเอสและส่งไปยังห้องปฏิบัติการในศูนย์บ่มเพาะที่39 ° C จำนวนที่มองเห็นขนาดเล็ก (≤3mm) และขนาดใหญ่(> 3mm) ในรูขุมรังไข่แต่ละคนถูกกำหนดและคิวมูลัสคอมเพล็กซ์เซลล์ที่แยกได้โดยการเปิดแต่ละรูขุมขนที่มองเห็นได้ด้วยใบมีดผ่าตัดและล้างมัน2 ถึง 3 ครั้งมีขนาดกลางเซลล์คอลเลกชัน (Grazul -.. Bilska et al, 2003, 2005; ลูเทอร์, et al, 2005) ภายใต้สเตอริโอ, คิวมูลัสคอมเพล็กซ์ไข่หายจากแต่ละจานและโอนไปยังจานเพาะเชื้อที่มีคอลเลกชันขนาดกลางสดโดยไม่ต้องเฮ. Cumulus คอมเพล็กซ์ไข่ได้รับการประเมินแล้วและแบ่งออกเป็นสุขภาพหรือatretic ขึ้นอยู่กับลักษณะทางสัณฐานวิทยาของพวกเขา(ทอมป์สัน et al., 1995) เซลล์คิวมูลัสทั้งหมดคอมเพล็กซ์ถูกล้างแล้ว 3 ครั้งในการเจริญเติบโตปานกลาง[TCM-199 ที่มีซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ 10% FSH แกะ (5 กรัม / มิลลิลิตร; oFSH-RP-1; NIAMDD-NIH, Bethesda, MD) แกะ LH ( 5 กรัม / มิลลิลิตร; oLH-26; NIADDKNIH) estradiol-17β (1 กรัม / มิลลิลิตร; ซิกเซนต์หลุยส์), glutamine (2 มิลลิ; ซิกม่า) ไพรูโซเดียม (0.25 มิลลิ; ซิกม่า) ผิวหนัง ปัจจัยการเจริญเติบโต (10 นาโนกรัม / มิลลิลิตร; ซิก) และยาปฏิชีวนะ / streptomycin (100 หน่วยของยาปฏิชีวนะ / มิลลิลิตรและ100 กรัม streptomycin / mL? Gibco แกรนด์ไอส์แลนด์นิวยอร์ก).] ในหลอดทดลองสุกไข่ถูกครบกำหนดในหลอดทดลองในการเจริญเติบโตกลางเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 39 ° C ใน CO2 5% และอากาศ 95% ตามมาด้วยการกำจัดเซลล์คิวมูลัสโดยใช้1% (น้ำหนัก / ปริมาตร) hyaluronidase (Type I, Sigma) ในพีบีเอส เซลล์ไข่ได้รับการประเมินอีกครั้งเพื่อสุขภาพขึ้นอยู่กับลักษณะทางสัณฐานวิทยา ไข่จัดเป็นมีสุขภาพดีถูกนำมาใช้สำหรับการผสมเทียมและถูกย้ายไปปฏิสนธิกลางประกอบด้วยสังเคราะห์equilibrated ของเหลวท่อนำไข่ที่เตรียมไว้ในห้องปฏิบัติการของเรา (Stenbak et al., 2001) และมีความร้อนที่ใช้งาน 2% ซีรั่มที่เก็บได้จากแกะ d 0-1 ของ การเป็นสัดวงจร(Grazul-Bilska et al, 2003, 2005;.. ลูเทอร์, et al, 2005). ปฏิสนธิในหลอดทดลองและวัฒนธรรมตัวอ่อนแช่แข็งน้ำเชื้อ capacitated รวบรวมจาก 4 นิวแฮมป์เชียร์แกะถูกละลายและสเปิร์มที่ทำงานได้ถูกแยกออก

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

รักษาสัตว์
ขั้นตอนทั้งหมดมีการปฏิบัติในมลรัฐนอร์ทดาโคตามหาวิทยาลัยรัฐโภชนศาสตร์สัตว์และสรีรวิทยา

( ศูนย์ anpc ) ตั้งอยู่ใน Fargo , ND ( ประมาณ 46.9 องศาละติจูดและลองจิจูด 96.8 °−

) และได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการของสถาบัน และดูแลสัตว์ใช้ ndsu
.
18 ( 2 - 3-yr-old ) , ตะวันตก ( และช่วงเด่น
targhee Rambouillet ) แกะคล้าย BW
( 47.0 ± 15 กิโลกรัม หมายถึง± SEM ) และ BCS ( 3.36 ± 0.04 )
ที่ใช้ในการศึกษา ร่างเงื่อนไขคะแนนตั้งใจ
ใช้ระดับ 5 ( 1 = มากบาง 5 = มาก
อ้วน ) แกะจะถูกเลี้ยงในคอกและบุคคล
( 0.86 × 1.47 เมตร ) theanpcunder 14 ชั่วโมงแห่งความมืด
10 H ของแสงที่ 12 ° C ฟรีเข้าถึงน้ำและ
อาหารเสริมแร่ธาตุ แกะ แบ่งเป็นกลุ่ม
2 กลุ่ม ( N = 9 / แต่ละครั้ง )ทั้งสองกลุ่มจะปรับในช่วงแรก (
4-wk acclimation ) ระยะเวลา 2 เครื่องบินของโภชนาการ
( ควบคุมและซึ่งได้อาหารไม่พอ ) ในอีก 4 สัปดาห์ ( ช่วงที่สอง
) แกะควบคุม ( เพียงพอ ) ได้รับการรักษา
ซึ่งได้อาหารไม่พอ น้ำหนักตัว และแกะ ( ห้าม ) ได้รับ
60% ของจัดสรรอาหารทุกวันสำหรับแกะควบคุม ( ดู
ส่วนการจัดการด้านโภชนาการ ) เมื่อแต่ละสัปดาห์
ตลอดระยะเวลาของการทดลองแกะได้
ชั่งน้ําหนักและ BCS ตั้งใจ .
ประสานกลุ่ม 30 D หลังจากที่เริ่มต้นของการรักษาภาวะ chronogest
,
( โปรเจสตาเจน ) ฟองน้ำ ( 30 มิลลิกรัม / ฟอง flugestone อะซิเตท ; intervet
, UK ) ถูกแทรกเข้าไปในช่องคลอด 14 วันผ่าน
ใช้ vasectomized เป็นสัด ( D 0 แกะผู้ ) ถูกตรวจพบ
40 ถึง 48 ชั่วโมงหลังจากฟองน้ำการถอน แกะได้รับสองครั้ง
ทุกวัน ( เช้า - เย็น ) ฉีดกับ fsh-p
( ซู ซู ชีวเคมี ศูนย์ , IA ) D 13 ( 5 หน่วย /
ฉีด ) และ 14 ( 4 หน่วย / ฉีด ) หลังจากกลุ่มตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (
stenbak et al . , 2001 ) ใน D 15
วงจรการเป็นสัดตามมาแกะถูกตัดรังไข่
( ลูเธอร์ et al . , 2005 ) การศึกษาเริ่มต้นในระหว่าง
ฤดูผสมพันธุ์ปกติในเดือนกันยายนและเสร็จ

ในเดือนธันวาคมโภชนาการการจัดการ
หลังจากมาถึงและการปรับตัว 3 มิติ แต่ละ และ ปากกา
เม็ดอาหารแกะที่ถูกจัดสรรแบบสุ่ม 2
กลุ่มโภชนาการที่ระบุไว้ อาหารที่มีอยู่
( % ของอาหาร DM ) : beet pulp 36.5 % dehydrated อบแห้ง
alfalfa 20.3 % 40 % ; ถั่วเหลือง ; ข้าวโพด , เปลือก , 16% และ
กาก 3.0% ถั่วเหลือง การอัดเม็ด ( เส้นผ่าศูนย์กลาง 0.48-cm )
อาหารที่เตรียมและวิเคราะห์ข้อมูลบนเว็บไซต์2.4 จัด
พบความแตกต่างกัน อย่างผม และ 130 กรัม ( 13 % ) ของบริษัท ซีพี ออลล์ ต่อกิโลกรัมของอาหาร
( วัตถุแห้ง ) และถูกเสนอในทุกวัน ส่วนที่ 1 เท่ากับ .
ในระหว่าง 4-wk แรก ( acclimation ) เวลาแกะควบคุม
ได้รับ 1000 g / D และซึ่งได้อาหารไม่พอแกะได้รับ 600 g / D
( วัตถุแห้ง ) . ระยะเวลาในช่วงเปลี่ยน acclimation แกะ
4-wk ที่สองอีกครั้งซึ่งมีอยู่ 2
เครื่องบินที่แตกต่างกันของโภชนาการ หลังแรก 4-wk acclimation
ระยะเวลาการบริโภคอาหารลดลงในแกะควบคุม
ดังนั้น BW และเงื่อนไขยังคง ( เพียงพอ ;
เลี้ยง 720 g / d อาหาร DM ) และซึ่งได้อาหารไม่พอแกะถูก
จำกัด 60% ของการควบคุม ( จำกัด ; เฟด 432 กรัม / D
อาหาร DM ) แกะแล้วไว้บนเครื่องบินของตน
โภชนาการเป็นเวลา 4 สัปดาห์ จนโอไซต์คอลเลกชัน โอโอไซต์คอลเลกชัน

หลังตัดรังไข่ รังไข่ถูกแช่ใน PBS
และส่งตัวไปปฏิบัติการในตู้อบที่
39 องศา ตัวเลขที่มองเห็น ขนาดเล็ก ( ≤ 3mm ) และขนาดใหญ่ ( > 3
) รูขุมขนแต่ละรังไข่ถูกกำหนดและแยกไข่
Cumulus เชิงซ้อนโดยการเปิดรูขุมขนที่มองเห็น
แต่ละที่มีใบมีดมีดและล้าง
2 ถึง 3 ครั้ง กับ กลาง คอลเลกชัน ไข่ ( grazul -
bilska et al . , 2003 , 2005 ; ลูเธอร์ et al . , 2005 ) ภายใต้ stereomicroscope
,Cumulus โอพีเชิงซ้อนหาย
จากแต่ละจานและโอนไปยังจานเพาะเชื้อ
ที่มีขนาดกลาง คอลเลกชันสดโดยไม่ต้องผ่าน heparin .
Cumulus เชิงซ้อนนำมาประเมินและ
ประเภทสุขภาพ หรือ atretic ตามสัณฐาน
( Thompson et al . , 1995 ) ทั้งหมดไข่
สำลีแล้วล้างขึ้น 3 ครั้งในการขนาดกลาง [
tcm-199 ที่มีซีรั่มวัว 10% fetal
ovine FSH ( 5
g / ml ; ofsh-rp-1 ; niamdd-nih
, Bethesda , MD ) ovine LH ( 5
g / ml ; olh-26 ; niaddknih )
estradiol-17 บีตา ( 1
g / ml ; Sigma , St . Louis , MO )
กลูตามีน ( 2 มม. ; Sigma โซเดียมไพรูเวท ( 0.25 ) มิลลิเมตร ;
Sigma ) , epidermal growth factor ( 10 ng / ml ; Sigma ) และสเตร็ปโตมัยซิน
เพนนิซิลลิน / ( 100 หน่วย / มล.
เพนนิซิลลินและ streptomycin 100
กรัม / มิลลิลิตร ; gibco
เกาะแกรนด์ , นิวยอร์ก , ) ] .

เลี้ยงในหลอดทดลองoocyte ครบในหลอดทดลองขนาดกลางการเจริญเติบโตใน
เป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 39 ° C ใน CO2 ร้อยละ 5 และร้อยละ 95 อากาศ ตามด้วยการใช้เซลล์คิวมูลัส
1 เปอร์เซ็นต์ ( น้ำหนัก / ปริมาตร ) ไฮอะลูโรนิเดส
( ประเภทผม , Sigma ) ใน PBS ไข่อีกครั้งประเมิน
เพื่อสุขภาพขึ้นอยู่กับน้ำหนัก ไข่จัดเป็น
สุขภาพถูกใช้ IVF และถูกย้ายไป
equilibrated ปฏิสนธิประกอบด้วยสังเคราะห์
ขนาดกลางoviductal ของเหลวที่เตรียมในห้องปฏิบัติการของเรา ( stenbak
et al . , 2001 ) และมี 2 % ซึ่งรวบรวมจากความร้อน
เซรั่มแกะบน d 0 1 ของรอบการเป็นสัด
( grazul bilska et al . , 2003 , 2005 ; ลูเธอร์ et al . , 2005

) การปฏิสนธิในหลอดทดลองและการเพาะเลี้ยงคัพภะ
รวม capacitated น้ำเชื้อแช่แข็งจาก 4 ทวีป
แกะถูกละลายและได้สเปิร์มได้แยกทางกัน