2.6. Total RNA isolation and qRT-PC

2.6. Total RNA isolation and qRT-PCR analysis
The total RNA was extracted from 1 g of P. expansum spores with TRIzol Reagent (Invitrogen, USA) according to the protocol of producer, and 2 g of RNA was used to synthesize the firststrand cDNA by FastQuant RT Kit (with gDNase) (Tiangen Biotech,China). Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) was performed using2 × Ultra SYBR mixture (CW Bio, China) in a CFX96-real Time Sys-tem (Bio-Rad, USA). Primer pairs for quantitative RT-PCR of the selected genes 6-methylicylic acid synthase (msas), Cytochrome P450monooxygenase-1 (CYP-1), Cytochrome P450 monooxygenase-2 (CYP-2), Isoepoxydon dehydrogenase (IDH), and Beta-tublin were used asdescribed by Sanzani et al. (2009). The PCR conditions were as follows: 95◦C for 10 min, followed by 40 circles of 95◦C for 15 s,58◦C for 15 s and 72◦C for 20 s. The change in fluorescence of SYBR Green in every cycle was monitored by the system software, andthe threshold cycle (Ct) over the background was calculated for eachreaction. Samples were normalized using -tublin and the relativeexpression levels were measured using the 2(−Ct) analysis method

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.6 การรวมอาร์เอ็นเอ qRT PCR และแยกวิเคราะห์อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกแยกจาก g 1 ของ P. expansum เพาะเฟิร์นกับ TRIzol รีเอเจนต์ (Invitrogen สหรัฐอเมริกา) ตามโพรโทคอลผลิต และ g 2 ของอาร์เอ็นเอใช้ในการสังเคราะห์ firststrand cDNA โดยชุด RT FastQuant (มี gDNase) (Tiangen เทคโนโลยีชีวภาพ จีน) เชิงปริมาณแบบ real-time PCR (qRT-PCR) ถูกทำ using2 × Ultra SYBR ผสม (ตามน้ำหนักจริงไบ จีน) ในการ CFX96 จริงเวลา Sys-ยการ (Bio Rad สหรัฐอเมริกา) คู่รองพื้นสำหรับ RT-PCR เชิงปริมาณของยีนเลือก 6 methylicylic กรด synthase (msas), Cytochrome P450monooxygenase-1 (CYP-1), Cytochrome P450 monooxygenase-2 (CYP-2), Isoepoxydon dehydrogenase (IDH), และเบต้า-tublin ถูกใช้ asdescribed โดย Sanzani et al. (2009) เงื่อนไข PCR มีดังนี้: 95◦C สำหรับ 10 นาที ตาม ด้วยวงกลม 40 95◦C สำหรับ 15 s, 58◦C สำหรับ 15 s และ 72◦C สำหรับ 20 s การเปลี่ยนแปลงใน fluorescence ของ SYBR Green ในทุกวงจรถูกตรวจสอบซอฟต์แวร์ระบบ และคำนวณวงจรจำกัด (Ct) เหนือพื้นหลังสำหรับ eachreaction ตัวอย่างได้ตามปกติการใช้ - tublin และระดับ relativeexpression ถูกวัดโดยใช้วิธีการวิเคราะห์ 2(− Ct)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.6 แยก RNA รวมและการวิเคราะห์ qRT-PCR
RNA รวมถูกสกัดจาก 1 กรัมของสปอร์พี expansum กับ Trizol Reagent (Invitrogen สหรัฐอเมริกา) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิตและ 2 กรัมของอาร์เอ็นเอถูกใช้ในการสังเคราะห์ยีน firststrand โดย FastQuant RT ชุด (มี gDNase) (Tiangen ชีวภาพจีน) เชิงปริมาณแบบ real-time PCR (qRT-PCR) ได้ดำเนินการ using2 ×ส่วนผสม SYBR อัลตร้า (CW ไบโอ, จีน) ใน CFX96 จริงเวลา Sys-TEM (Bio-Rad สหรัฐอเมริกา) คู่ไพรเมอร์สำหรับปริมาณ RT-PCR ของยีนที่เลือก 6 methylicylic กรดเทส (MSAs) Cytochrome P450monooxygenase-1 (CYP-1), Cytochrome P450 monooxygenase-2 (CYP-2) dehydrogenase Isoepoxydon (IDH) และ Beta- Tublin ถูกนำมาใช้โดย Sanzani asdescribed et al, (2009) เงื่อนไข PCR มีดังนี้95◦Cเป็นเวลา 10 นาทีตามด้วย 40 วงกลม95◦C 15 วินาที, 15 58◦Cและ72◦C 20 s การเปลี่ยนแปลงในการเรืองแสงสีเขียว SYBR ในทุกวงจรที่ได้รับการตรวจสอบโดยซอฟแวร์ระบบ andthe วงจรเกณฑ์ (CT) มากกว่าพื้นหลังที่คำนวณได้สำหรับ eachreaction ตัวอย่างปกติใช้ -tublin และระดับ relativeexpression ถูกวัดโดยใช้ 2 (? - กะรัต) วิธีการวิเคราะห์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.6 การแยกและวิเคราะห์ดีเอ็นเอ อาร์เอ็นเอทั้งหมดข้าพเจ้าโดยอาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดจาก 1 กรัม หน้า expansum สปอร์ด้วย trizol Reagent ( Invitrogen , USA ) ตามขั้นตอนของผู้ผลิต และ 2 กรัม ซึ่งถูกใช้เพื่อสังเคราะห์ cDNA โดย firststrand fastquant RT ชุด ( มี gdnase ) ( tiangen Biotech , จีน ) เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์พีซีอาร์ ( PCR ข้าพเจ้า ) กำหนด using2 × Ultra SYBR ผสม ( CW ไบโอ , จีน ) ในเวลาจริง SYS TEM ( สหรัฐอเมริกา cfx96 ชีวภาพราด ) คู่ไพรเมอร์สำหรับวิธีเชิงปริมาณของยีนที่ 6-methylicylic acid synthase ( มซาส ) , ไซโตโครม p450monooxygenase-1 ( cyp-1 ) , ไซโตโครมพี monooxygenase-2 ( cyp-2 ) isoepoxydon dehydrogenase ( IDH ) และเบต้า tublin ใช้ asdescribed โดย sanzani et al . ( 2009 ) โดยมีเงื่อนไขดังนี้ ◦ 95 นาน 10 นาที ตามด้วย 40 วงกลม 95 ◦ C 15 , 58 ◦เป็นเวลา 15 วินาทีและ 72 ◦ C เป็นเวลา 20 วินาทีในการเปลี่ยนของ SYBR กรีนทุกวงจรที่ถูกตรวจสอบโดยระบบซอฟต์แวร์และวงจรเกณฑ์ ( CT ) มากกว่า พื้นหลังถูกคำนวณสำหรับ eachreaction . จำนวนคะแนนทีปกติโดยใช้ - tublin และระดับ relativeexpression ถูกวัดโดยใช้วิธีวิเคราะห์ 2 ( − CT )