Performed In-gel assays using nonde

Performed In-gel assays using nondenaturing SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) for visualizing pectinase and cellulase activities.
Diluted Enzyme extractwas in electrophoresis sample buffer containing 25% stacking buffer (0.5M Tris–HCl; pH6.8), 20% glycerol, 2% SDS, and 0.005% (w/v) bromophenol blue.
Denatured The cellulase sample partially at 70 °C for 20min to increase electrophoresis resolution.
Centrifuged following heating, the samples briefly (Oppert et al., 2009) and then loaded on a 5% stacking and 10% separating polyacrylamide gel.
Incorporated the substrate pectin and CMC into the separating gels at a final concentration of
1% and 0.1% for detecting pectinase and cellulase, respectively.
Washed after electrophoresis, the gels in citrate buffer (pH 6) containing 2.5% (v/v) Triton X-100 for 45min and then incubated in citrate buffer (pH 6) with gentle agitation for 60min for pectinase and 2 h for cellulase.
Stained the gels for visualizing pectinase with Ruthenium red (0.03%), and the bands of pectinase activity appeared as clear areas in a red gel background.
Stained In the case of cellulase, the gels with Congo red (0.1%) for 10–15min at room temperature.
Destained the gels by washing in 50mL 1 M NaCl until the cellulose bands became obvious as clear zones where the CMC had been degraded due to enzymatic activity.
Added after 20min of destaining, 100 μLofglacial acetic acid to the gel for better visualization (Waeonukul etal., 2007).
Estimated the kinetic parameters of themidgut pectinase at pH 6 and 45 °C. The KM and Vmax values for the enzyme were 2 mg•mL−1 and 0.017 mmol•min−1•mg−1 protein, respectively.
Showed Zymogram analyses at least one pectinase activity band (125 kDa) in the larval midgut by PAGE .

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ดำเนินการในเจล assays ใช้ electrophoresis nondenaturing SDS polyacrylamide เจล (SDS-หน้า) สำหรับแสดงผลกิจกรรม pectinase และ cellulaseExtractwas เอนไซม์แตกออกในบัฟเฟอร์อย่าง electrophoresis ประกอบด้วย 25% บัฟเฟอร์ซ้อน (0.5M ตรี – HCl; pH6.8), กลีเซอร 20%, 2% SDS และบลู bromophenol 0.005% (w/v) Denatured cellulase ตัวอย่างบางส่วนที่ 70 ° C สำหรับ 20 นาทีเพื่อเพิ่มความละเอียด electrophoresisCentrifuged ต่อความร้อน ตัวอย่าง briefly (Oppert et al., 2009) และโหลดแล้ว ซ้อน 5% และ 10% แยกเจ polyacrylamide รวมพื้นผิวเพกทินและ CMC เป็นเจแยกที่ความเข้มข้น final1% และ 0.1% สำหรับการตรวจสอบ pectinase และ cellulase ตามลำดับ ล้างหลังจาก electrophoresis เจซิเตรตบัฟเฟอร์ (pH 6) มี 2.5% (v/v) ไตรตั้น X-100 สำหรับ 45 นาทีแล้ว incubated ในซิเตรตบัฟเฟอร์ (pH 6) ด้วยอาการกังวลต่ออ่อนโยนสำหรับ 60 นาที สำหรับ pectinase และ h 2 สำหรับ cellulase สีเจสำหรับแสดงผล pectinase กับรูทีเนียมแดง (0.03%), และวงกิจกรรม pectinase ปรากฏเป็นพื้นที่ชัดเจนในพื้นหลังสีแดงเจ สีในกรณี cellulase เจ มีเรดคองโก (0.1%) สำหรับ 10-15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง Destained เจที่ โดยการซักผ้าใน 50mL 1 M NaCl จนวงเซลลูโลสเป็นชัดเจนเป็นโซนชัดเจนที่ CMC ที่มีการเสื่อมโทรมเนื่องจากกิจกรรมของเอนไซม์ในระบบ เพิ่มหลังจาก 20 นาทีของ destaining กรดอะซิติก μLofglacial 100 การเจลสำหรับแสดงภาพประกอบเพลงที่ดีกว่า (Waeonukul etal., 2007)ประมาณพารามิเตอร์เดิม ๆ ของ themidgut pectinase ที่ pH 6 และ 45 องศาเซลเซียส ค่า KM และ Vmax สำหรับเอนไซม์ถูก 2 mg•mL−1 และ 0.017 mmol•min−1•mg−1 โปรตีน ตามลำดับZymogram แสดงวิเคราะห์น้อย pectinase กิจกรรมวงใน (125 kDa) midgut larval ตามหน้า

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ดำเนินการในการตรวจเจลโดยใช้ nondenaturing SDS polyacrylamide เจลอิเล็ก (SDS-PAGE) สำหรับภาพกิจกรรมเพคติเนสและเซลลูเลส.
ปรับลดเอนไซม์ extractwas ใน electrophoresis บัฟเฟอร์ตัวอย่างที่มี 25% กันชนซ้อน (0.5M Tris-HCl; pH6.8), กลีเซอรีน 20% , 2% SDS และ 0.005% (w / v). สีฟ้า Bromophenol
เอทิลแอลกอฮอล์ตัวอย่างเซลลูเลสบางส่วนที่ 70 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 นาทีเพื่อเพิ่มความละเอียด electrophoresis.
ปั่นความร้อนต่อไปนี้ตัวอย่างเนยแข็งบรีฟลอริด้าและ (Oppert et al., 2009) และโหลดแล้ว บนซ้อน 5% และ 10% แยกเจล polyacrylamide.
Incorporated เพคตินสารตั้งต้นและ CMC เป็นเจลแยกที่มีความเข้มข้น NAL ในสายของ
1% และ 0.1% สำหรับการตรวจหาเพคติเนสและเซลลูเลสตามลำดับ.
ล้างหลังจาก electrophoresis เจลในบัฟเฟอร์ซิเตรต ( พีเอช 6) ที่มี 2.5% (v / v) Triton X-100 สำหรับ 45 นาทีแล้วนำไปบ่มในบัฟเฟอร์ซิเตรต (pH 6) ที่มีการกวนอ่อนโยนสำหรับ 60 นาทีสำหรับเพคติเนสและ 2 ชั่วโมงสำหรับเซลลูเลส.
สีเจลสำหรับการแสดงเพคติเนสด้วยสีแดงรูทีเนียม ( 0.03%) และวงดนตรีของกิจกรรมเพคติเนปรากฏชัดเจนเป็นพื้นที่ในพื้นหลังเจลสีแดง.
สีในกรณีที่มีเซลลูเลส, เจลที่มีสีแดงคองโก (0.1%) สำหรับ 10-15min ที่อุณหภูมิห้อง.
Destained เจลโดยการซักผ้าใน 50 มล 1 M NaCl จนกว่าวงเซลลูโลสก็เห็นได้ชัดว่าเป็นโซนชัดเจนที่ CMC ได้รับการสลายตัวเนื่องจากกิจกรรมของเอนไซม์.
ที่เพิ่มเข้ามาหลังจาก 20 นาทีของ destaining 100 กรดอะซิติกμLofglacialเจลสำหรับการแสดงที่ดีกว่า (Waeonukul อีตัล. 2007).
โดยประมาณ พารามิเตอร์การเคลื่อนไหวของเพคติเน themidgut ที่ pH 6 และ 45 องศาเซลเซียส KM และค่า Vmax เอนไซม์เป็น 2 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร•-1 และ 0.017 มิลลิโมล•นาที 1 •มิลลิกรัมโปรตีน-1 ตามลำดับ.
แสดงให้เห็นไซโมแกรมวิเคราะห์อย่างน้อยหนึ่งกิจกรรมเพคติเนสวง (125 กิโลดาลตัน) ในกระเพาะตัวอ่อนโดยหน้า

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

( ) ใช้เจลเมื่อ SDS polyacrylamide gel electrophoresis ( SDS-PAGE ) สำหรับแสดงผลกิจกรรมเอนไซม์เซลลูเลสและเอนไซม์อิเลค extractwas .
เจือจางตัวอย่างในบัฟเฟอร์ที่มี 25% ซ้อนบัฟเฟอร์ ( 0.5 นอกจากนี้ – HCl ; ph6.8 ) 20 % กลีเซอรอล 2% SDS และ 0.005 % ( w / v ) โบรโมฟีนอลสีฟ้า
การใช้เอนไซม์ตัวอย่างบางส่วนที่ 70 องศา C เป็นเวลา 20 นาทีเพื่อเพิ่มวิธีละเอียด ดังต่อไปนี้
ไฟฟ้าความร้อน , ตัวอย่างบรีfl Y ( oppert et al . , 2009 ) แล้วโหลดใน 5% และ 10% polyacrylamide gel ซ้อนแยก .
รวมฐานรองเพคตินและ CMC เข้าสู่แยกเจลที่เข้มข้นจึงนาล
1 % และ 0.1% สำหรับการตรวจหาเอนไซม์เพคติเนส และเซลลูเลสตามลำดับ
ล้างหลังจากอิเล็กเจลในซิเตรตบัฟเฟอร์ pH 6 ) ที่มี 2.5 % ( v / v ) Triton X-100 สำหรับ 45min แล้วบ่มในซิเตรตบัฟเฟอร์ pH 6 ) ด้วยการกวนอ่อนโยนสำหรับ 60min สำหรับ 2 ชั่วโมงเอนไซม์เซลลูเลส .
เปื้อนเจลใช้เอนไซม์กับรูทีเนียมสีแดง ( 0.03% ) และวงดนตรีของกิจกรรมเอนไซม์ที่ปรากฏเป็นที่ชัดเจน ในพื้นที่ หลัง เจลสีแดง
เปรอะเปื้อน ในกรณีของเซลลูเลส เจล กับ คองโกเรด ( 0.1% ) 10 – 15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง
destained เจล โดยล้าง 50ml 1 M NaCl จนเซลลูโลสวงกลายเป็นที่เห็นได้ชัดเป็นโซนชัดเจนที่ CMC ได้ลดลงเนื่องมาจากเอนไซม์ .
เพิ่มหลังจาก 20 นาทีของ destaining 100 μ lofglacial กรดอะซิติกกับเจลดีกว่าการแสดง ( waeonukul คณะ .
, 2007 )ประมาณค่าพารามิเตอร์จลน์ของ themidgut เอนไซม์ที่ pH 6 และ 45 ° C km และ Vmax สำหรับเอนไซม์ 2 มก. - มล − 1 และ 0.017 มิลลิโมล - มิน− 1 - − 1 มิลลิกรัมโปรตีนตามลำดับ การวิเคราะห์ไอโซไซม์
แสดงอย่างน้อยหนึ่งกิจกรรมวงดนตรี ( 125 กิโลดาลตัน เอนไซม์ ) ในประสิทธิภาพและเหมาะสม ดักแด้ โดยหน้า .