3.7. Western blot analysisHEK293 ce

3.7. Western blot analysis

HEK293 cells were plated in 6-well plates at a density of 5 × 105 cells/well and grown at 37 °C. Cells were treated with compounds at a final concentration of 20 μM for 24 h. Then, cells were harvested, lysed, centrifuged. The supernatants were utilized for protein analysis and western blot analysis. The total protein concentration was determined using a Bradford Protein Assay Kit. Protein samples were denatured, and final stored at −80 °C for western blotting. Equal amounts of protein (30 mg) from cell lysates were loaded onto a 10% SDS-polyacrylamide gel and separated by electrophoresis. β-actin served as an internal control. Then, the separated proteins were electrophoretically transferred to a 0.45 μm PVDF membrane. The transferred PVDF membranes were incubated with anti-SIRT1 primary antibodies (1:1000) at 4 °C overnight. Bound antibodies were detected using a horseradish peroxidase-linked secondary antibody.

Statistical analysis: All results were confirmed from a minimum of three independent experiments on replicate samples. Data are represented as the mean ± standard deviation (SD). Statistical significances were evaluated by the t-test. Data were considered significant at P < 0.05.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3.7 วิเคราะห์น้าแบบตะวันตกเซลล์ HEK293 ชุบในดี 6 แผ่นที่ความหนาแน่นของ 5 × 105 เซลล์/ดี และเติบโตที่ 37 องศาเซลเซียส เซลล์ได้รับการรักษา ด้วยสารที่ความเข้มข้นสุดท้ายของ 20 ไมครอนใน 24 ชม แล้ว เซลล์เก็บเกี่ยว นาทีที่ 37uc ผลิตภัณฑ์ Supernatants ถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์โปรตีนและวิเคราะห์ตะวันตกน้า ความเข้มข้นของโปรตีนทั้งหมดที่ถูกกำหนดโดยใช้ชุดทดสอบโปรตีนแบรดฟอร์ด ตัวอย่างโปรตีนถูกลแปลง และสุดท้ายเก็บไว้ที่ −80 ° C สำหรับ blotting วิธีตะวันตก เท่ากับปริมาณของโปรตีน (30 mg) จากเซลล์ lysates ถูกโหลดลงใน 10% SDS-ตรวจสอบวิเคราะห์เจ และแยก โดยอิ Βแอกตินทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมภายใน แล้ว โปรตีนแยกถูก electrophoretically โอนย้ายไปเมมเบรน PVDF 0.45 ไมครอน เยื่อ PVDF โอนได้รับการกกกับ SIRT1 ต้านแอนติบอดีหลัก (1: 1000) ที่อุณหภูมิ 4 ° C ค้างคืน ตรวจพบแอนติบอดีที่ถูกผูกไว้ใช้แบบเด็ด ๆ ลิงค์ฮอสรองแอนติบอดีสถิติวิเคราะห์: ผลทั้งหมดได้ confirmed จากอย่างน้อย 3 การทดลองอิสระบน replicate ตัวอย่าง ข้อมูลจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) สถิติ significances ถูกประเมิน โดยการทดสอบ t ข้อมูลพิจารณาว่างมากที่ P < 0.05

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3.7 วิเคราะห์ดวงตะวัน

HEK293 เซลล์ถูกชุบแผ่น 6 ได้ดีที่ความหนาแน่นของ 5 × 105 เซลล์ / ดีและเติบโตในอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เซลล์ได้รับการรักษาด้วยสารที่มีความเข้มข้นสุดท้ายของ 20 ไมครอนเป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นเซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยว lysed, หมุนเหวี่ยง supernatants ถูกนำมาใช้สำหรับการวิเคราะห์โปรตีนและการวิเคราะห์ดวงตะวัน ความเข้มข้นของโปรตีนทั้งหมดถูกกำหนดโดยใช้ชุดแบรดฟอโปรตีน Assay ตัวอย่างโปรตีนถูกแปลงสภาพและครั้งสุดท้ายที่เก็บไว้ที่ -80 องศาเซลเซียสซับตะวันตก ปริมาณที่เท่ากันของโปรตีน (30 มก.) จาก lysates เซลล์ถูกโหลดไปยังเจล SDS-polyacrylamide 10% และแยกจากกันโดย electrophoresis β-โปรตีนทำหน้าที่เป็นผู้ควบคุมภายใน จากนั้นแยกโปรตีนถูกย้าย electrophoretically ไปยังเมมเบรน PVDF 0.45 ไมโครเมตร ที่โอนเยื่อ PVDF ถูกบ่มกับแอนติบอดีปฐมภูมิป้องกัน SIRT1 (1: 1000) ที่ 4 ° C ในชั่วข้ามคืน แอนติบอดีที่ถูกผูกไว้ถูกตรวจพบโดยใช้แอนติบอดีรองมะรุม peroxidase เชื่อมโยง.

การวิเคราะห์ทางสถิติผลทั้งหมดถูก Con Fi rmed จากต่ำทดลองสามอิสระตัวอย่างซ้ำ ข้อมูลจะถูกแสดงเป็นค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน±เฉลี่ย (SD) ความสำคัญทางสถิติได้รับการประเมินโดย t-test ข้อมูลที่ได้รับการพิจารณานัยสำคัญลาดเท Fi p <0.05

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

3.7 Western blot analysishek293 cells ใน 6-well แผ่นชุบที่ความหนาแน่น 5 × 105 เซลล์ / ดี และโตที่อุณหภูมิ 37 องศา เซลล์จะถูกกับสารที่ระดับความเข้มข้น 20 สุดท้ายμ M เป็นเวลา 24 ชั่วโมง แล้วเก็บ lysed เซลล์ , ไฟฟ้า , . การ supernatants วิเคราะห์โปรตีนและการวิเคราะห์ Western blot . ปริมาณโปรตีนทั้งหมดถูกกำหนดโดยใช้โปรตีนแบรดฟอร์ด ( ชุด ตัวอย่างโปรตีนถูกใช้ และสุดท้ายที่เก็บไว้ที่ 80 °− C สำหรับ Western blotting . จํานวนเงินที่เท่ากันของโปรตีน ( 30 มก. ) จากเซลล์ lysates ถูกโหลดลง 10% SDS polyacrylamide gel electrophoresis และแยกโดย . บีตา - actin ทำหน้าที่เป็นระบบควบคุมภายใน แล้วแยกโปรตีนเป็น electrophoretically ย้ายไป 0.45 μ M PVDF เมมเบรน โอน PVDF เยื่อแผ่นแบบแยกแอนติบอดีประถมศึกษา anti-sirt1 ( 000 ) 4 ° C ในชั่วข้ามคืน ถูกตรวจพบการใช้มะรุม peroxidase แอนติบอดีเชื่อมโยงระดับแอนติบอดีการวิเคราะห์สถิติ : ผลลัพธ์ทั้งหมดถูกหลอกจึง rmed จากอย่างน้อยสามการทดลองอิสระเลียนแบบตัวอย่าง ข้อมูลจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน ( SD ) ความสำคัญทางสถิติ ได้แก่ ค่าเฉลี่ย ข้อมูล ถือว่าเป็น signi จึงไม่สามารถที่ p < 0.05