These results demonstrated that all

These results demonstrated that all six ฮิวเมไนซ์ IgG4ic แอนติ-ฮิวเมน
CD134 antibody clone 12H3 versions showed a higher CD134 antigen binding
10 affinity than parental mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 and ไคเมริก
ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3.

Example 12. แอนติ-CD134 antibodies suppress FOX3P expression in Treg cells
15
Treg isolation and expansion: Leukopacks were purchased from Biological
Specialties (Colamar, PA) and red blood cells lysed with ACK buffer (Stemcell
technologies, Vancouver, BC, Canada) on ice. Cells were washed and resuspended
in AutoMACS running buffer. Tregs were isolated with the CD4+ CD25+
20 CD127dim/- Treg kit on both an AutoMACS Pro and/or LD columns with a
QuadroMACS, all from Miltenyi Biotech (San Diego, CA) following manufacturer's
instructions. Tregs were counted and 1x106 Tregs/well were expanded in 24-well
plates in TexMACS medium with Treg expansion beads (MACSiBead particles pre-
loaded with CD3 and CD28 antibodies; Miltenyi Biotech) following manufacturer's 25 instructions. The cells were cultured at a ratio of 4 beads/cell in the presence of
—500 IU/mL of IL-2 and Rapamycin (100 nM). 5 days after the isolation, the cells
were transferred to a 6 welllplate and 40 p.1 of beads/well and media with IL-2 (500
IU/m1) and Rapamycin (100 nM) were added. Medium containing IL-2 was added
as needed and cells were transferred to 10 mm round dish plates and expanded
30 further. After 30 days, beads were removed with a MACSiMAG before downstream
applications.

Treg activation: Expanded Tregs were labeled with Celltrace Violet as per
manufacturer's instructions (Life Technologies, Grand Island, NY). 1.5x105
expanded Tregs and 3x105 Treg Expansion beads (1VIACSiBead particles pre-loaded
with CD3 and CD28 antibodies; Miltenyi Biotech) were plated in round-bottom 96-
5 well plates and incubated at 37°C in X-VIVO 15 medium supplemented with 5%
serum, 1% Pen-Strep and —500 IU/mL of IL-2 with หรือ without 12H3 (0.5 and 5
µg/ml) and/or ฮิวเมน OX4OL (1 µg/ml, R&D Systems) and แอนติ-His mAb (1 µg/ml,
R&D Systems). After 3 days, cells were restimulated with Leukocyte Activation
Cocktail, with BD GolgiPlug (2 dl/ml, BD Biosciences, San Jose, CA) for 5 hours, 10 washed and stained with LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit (Life
Technologies) following manufacturer's instructions. Cells were washed once and
intracellular staining was performed following fixation/permeabilization with
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience, San Diego, CA)
according to the manufacturer's protocol. The following antibodies were used: CD3 15 V500 (clone SP34-2, BD Biosciences); FOXP3 PE (clone 206D, Biolegend); CD4
PerCP (clone OKT4, Biolegend); และ OX40 (clone ACT35, eBioscience). Cells were
incubated for 30 minutes at 4°C and washed. Cells were run in a BD Canto flow
cytometer (BD Biosciences) and analyzed using FlowJo (Ashland, OR), gating on
live singlets CD3+ CD4+. Geometric Mean fluorescent intensity derived from แอนติ-
20 FOXP3 PE (R-Phycoerythrin) (geoMFI) was recorded.
รูป 40 shows that both the mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibodyl2H3
(IgG1) and ฮิวเมน OX4OL decreased FOXP3 expression in expanded Tregs (CD4+
CD25- CD127 dim/-). Whenl2H3 and OX4OL were used in combination, the effect
on FOXP3 expression suppression was additive. The results suggest that that the 25 mouse แอนติ-ฮิวเมน antibody 12H3 affects Treg function directly, and not only
through its role on เอฟเฟคเตอร์ T cells. The data represents a triplicate sample from
one donor.
Example 13. Plate bound ฮิวเมไนซ์ แอนติ-CD134 antibodies ameliorate 30 Treg suppression of Teff cells
Effect of ฮิวเมไนซ์ แอนติ-CD134 antibodies 12H3 VL1VH1 หรือ 12H3 VL1VH2 (both IgG4/1c) on Treg suppression of Teff function was evaluated.
Tregs were isolated, expanded and activated as described in Example 12. Where indicated, round bottom 96-wellplates were coated with 12H3 VL1VH1 หรือ 12H3 VL1VH2 antibodies หรือ ไอโซไทป์คอนโทรลs (10 µg/ml) diluted in PBS. Plates
were incubated for 2 hours at 37°C, then rinsed and used in the suppression assay. 5 CD4+ เอฟเฟคเตอร์ T cells (Teff) isolated from the same donor as the Tregs were purified
from frozen PBMCs using an AutoMACS Pro and CD4+ isolation kit from Miltenyi
Biotech according to manufacturer's specifications. The Teff cells were then
labeled with CelltraceTM Violet dye as per manufacturer's instructions (Life
Technologies, Grand Island, NY). Teff cells were resuspended in X-VIVO 15
10 medium supplemented with 5% serum, 1% Pen-Strep. 1x105 cells were added to
each well. Tregs were added at Treg:Teff ratio of 0:1 (Teffs alone), 1:2, 1:4 and 1:8. Treg Suppression Inspector beads (Miltenyi Biotech) were washed and added to the wells at a ratio of 1 bead per cell (Teff หรือ Treg). Final volume in each well was
adjusted to 200 pl. Plates were incubated at 37°C for 4 days. Cells were
15 restimulated with Leukocyte Activation Cocktail, with BD GolgiPlug (2 pl/ml, BD
Biosciences, San Jose, CA) for 5 hours, washed and stained with LIVE/DEAD®
Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit (Life Technologies) following manufacturer's
instructions. Cells were washed and surface stain was performed with APC-
coupled แอนติ-OX40 (allophycocyanin) (clone ACT35, eBioscience) followed by
20 intracellular staining. Fixation/permeabilization with Foxp3 / Transcription Factor
Staining Buffer Set (eBioscience, San Diego, CA) according to the manufacturer's
protocol. The following antibodies were used: CD3 V500 (clone SP34-2, BD
Biosciences); CD4 FITC (clone RPA-T4, BioLegend). Cells were incubated for 30
minutes at 4°C and washed. Cells were run in a BD Canto flow cytometer (BD
25 Biosciences) and analyzed using FlowJo (Ashland, OR), gating on live singlets
CD3+ CD4+ Celltrace+.
Plate-bound ฮิวเมไนซ์ 12H3 antibodies dampened the inhibition by Tregs
on Teff การเพิ่มจำนวน. รูป 41 shows the histogram of FACS analyses comparing
the การเพิ่มจำนวน of Teff cells stimulated with Treg suppression inspector beads 30 (Miltenyi, San Diego, CA) and treated with plate bound 12H3 VL1VH1 หรือ ไอโซไทป์
control IgG4 in the presence of Tregs at Treg/Teff ratio 1:2. Compared to ไอโซไทป์
control (hIgG4), 12H3 VL1VH1 dampened the inhibitory effect of Tregs on Teff
การเพิ่มจำนวน, as indicated by the increase in cell numbers in the successive peaks
(lower fluorescent intensity) representing subsequent cell divisions detected with CelltraceTM Violet dye. CelltraceTM Violet dye ยึดเกาะ กับ activated amine groups
inside the cells.
รูป 42 shows the effect of ไคเมริก 12H3 (ฮิวเมน IgG4/x), ฮิวเมไนซ์
5 12H3 VL1VH1 หรือ 12H3 VL1VH2 (both IgG4/x) alone หรือ in combination with OX4OL
(5 i_tg/mL)/แอนติ-His mAb (5 iig/mL) on the replication of Teff cells at Treg:Teff ratio
of 0:1 (รูป 42A) หรือ 1:4 (รูป 42B) on cells isolated from one donor. In the
absence of Tregs (รูป 42A), CD2/CD3/CD28 stimulator beads alone induced
การเพิ่มจำนวน in ฮิวเมน CD134 expressing Teffs (i.e. ไอโซไทป์คอนโทรล). The ไคเมริก 10 and ฮิวเมไนซ์ แอนติ-CD134 antibodies as well as OX4OL stimulated the
การเพิ่มจำนวน of CD4+ T cells when compared to the ไอโซไทป์คอนโทรล. การเพิ่มจำนวน
was slightly increased with a combination of 2113 VL1VH2 (SF2) with OX4OL. In
the presence of Tregs (รูป 42B), CD2/CD3/CD28 stimulator beads alone induced
less CD4 T cells การเพิ่มจำนวน when compared to การเพิ่มจำนวน of CD4 T cells
15 without Treg suppression (replication index about 3 vs about 5). Treg suppression
was dampened in the presence of ไคเมริก 12H3, ฮิวเมไนซ์ 12H3 VL1VH1 and
12H3 VL1VH2 as well as OX4OL. Presence of the combination of 12H3 VL1VH1 หรือ
12H3 VL1VH2 and OX4OL demonstrated a slightly synergistic effect. In the
รูป, Teff cell การเพิ่มจำนวน คือ expressed as a replication index, which คือ a
20 measure of fold-expansion of the Teff cells that have divided at least once in
response to a stimulus (e.g., number of cells in millions at the end of the culture
that have undergone at least one division).
Table 3 summarizes the effect of 12H3 VH1VH2 IgG4/x.) on effect on Teff
การเพิ่มจำนวน in the presence of Tregs at Treg/Teff ratio 0:1, 1:2 and 1:4 for 12H3 25 VL1VH2 (IgG4k) in cells obtained from 5 donors. Degree of การเพิ่มจำนวน was
expressed as Replicaton Index. In the absence of Tregs, 12H3 VL1VH2 stimulated
Teff cell การเพิ่มจำนวน in all donor-derived cells when compared to the ไอโซไทป์
control (with Teff activated using CD2/CD3/CD28 beads). In the presence of Tregs
either at 1:2 หรือ 1:4 Treg/Teff ratio, presence of 12H3 VL1VH2 dampened the Treg 30 suppression in all donor-derived cells.
The results indicate that 12H3 VL1VH1 and 12H3 VL1VH2 have an effect on CD4 เอฟเฟคเตอร์ T cells inducing their การเพิ่มจำนวน, and that the antibodies renders
Teffs somewhat resistant to Tregs หรือ that Tregs themselves are less suppressive in the presence of the antibodies.

Table 3.

Example 12. แอนติ-CD134 antibodies suppress FOX3P expression in Treg cells
15
Treg isolation and expansion: Leukopacks were purchased from Biological
Specialties (Colamar, PA) and red blood cells lysed with ACK buffer (Stemcell
technologies, Vancouver, BC, Canada) on ice. Cells were washed and resuspended 
 in AutoMACS running buffer. Tregs were isolated with the CD4+ CD25+ 
20 CD127dim/- Treg kit on both an AutoMACS Pro and/or LD columns with a 
 QuadroMACS, all from Miltenyi Biotech (San Diego, CA) following manufacturer's 
 instructions. Tregs were counted and 1x106 Tregs/well were expanded in 24-well 
 plates in TexMACS medium with Treg expansion beads (MACSiBead particles pre-
 loaded with CD3 and CD28 antibodies; Miltenyi Biotech) following manufacturer's 25 instructions. The cells were cultured at a ratio of 4 beads/cell in the presence of 
 —500 IU/mL of IL-2 and Rapamycin (100 nM). 5 days after the isolation, the cells 
 were transferred to a 6 welllplate and 40 p.1 of beads/well and media with IL-2 (500 
 IU/m1) and Rapamycin (100 nM) were added. Medium containing IL-2 was added 
 as needed and cells were transferred to 10 mm round dish plates and expanded 
30 further. After 30 days, beads were removed with a MACSiMAG before downstream 
 applications.

Treg activation: Expanded Tregs were labeled with Celltrace Violet as per
manufacturer's instructions (Life Technologies, Grand Island, NY).  1.5x105
expanded Tregs and 3x105 Treg Expansion beads (1VIACSiBead particles pre-loaded 
 with CD3 and CD28 antibodies; Miltenyi Biotech) were plated in round-bottom 96-
5 well plates and incubated at 37°C in X-VIVO 15 medium supplemented with 5% 
 serum, 1% Pen-Strep and —500 IU/mL of IL-2 with หรือ without 12H3 (0.5 and 5 
 µg/ml) and/or ฮิวเมน OX4OL (1 µg/ml, R&D Systems) and แอนติ-His mAb (1 µg/ml, 
 R&D Systems). After 3 days, cells were restimulated with Leukocyte Activation 
 Cocktail, with BD GolgiPlug (2 dl/ml, BD Biosciences, San Jose, CA) for 5 hours, 10 washed and stained with LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit (Life
Technologies) following manufacturer's instructions. Cells were washed once and 
 intracellular staining was performed following fixation/permeabilization with 
 Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience, San Diego, CA) 
 according to the manufacturer's protocol. The following antibodies were used: CD3 15 V500 (clone SP34-2, BD Biosciences); FOXP3 PE (clone 206D, Biolegend); CD4 
 PerCP (clone OKT4, Biolegend); และ OX40 (clone ACT35, eBioscience). Cells were 
 incubated for 30 minutes at 4°C and washed. Cells were run in a BD Canto flow 
 cytometer (BD Biosciences) and analyzed using FlowJo (Ashland, OR), gating on 
 live singlets CD3+ CD4+. Geometric Mean fluorescent intensity derived from แอนติ-
20 FOXP3 PE (R-Phycoerythrin) (geoMFI) was recorded.
รูป 40 shows that both the mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibodyl2H3
(IgG1) and ฮิวเมน OX4OL decreased FOXP3 expression in expanded Tregs (CD4+ 
 CD25- CD127 dim/-). Whenl2H3 and OX4OL were used in combination, the effect 
 on FOXP3 expression suppression was additive. The results suggest that that the 25 mouse แอนติ-ฮิวเมน antibody 12H3 affects Treg function directly, and not only 
 through its role on เอฟเฟคเตอร์ T cells. The data represents a triplicate sample from 
 one donor.
Example 13. Plate bound ฮิวเมไนซ์ แอนติ-CD134 antibodies ameliorate 30 Treg suppression of Teff cells
Effect of ฮิวเมไนซ์ แอนติ-CD134 antibodies 12H3 VL1VH1 หรือ 12H3 VL1VH2 (both IgG4/1c) on Treg suppression of Teff function was evaluated.
Tregs were isolated, expanded and activated as described in Example 12. Where indicated, round bottom 96-wellplates were coated with 12H3 VL1VH1 หรือ 12H3 VL1VH2 antibodies หรือ ไอโซไทป์คอนโทรลs (10 µg/ml) diluted in PBS. Plates
were incubated for 2 hours at 37°C, then rinsed and used in the suppression assay. 5 CD4+ เอฟเฟคเตอร์ T cells (Teff) isolated from the same donor as the Tregs were purified 
 from frozen PBMCs using an AutoMACS Pro and CD4+ isolation kit from Miltenyi 
 Biotech according to manufacturer's specifications. The Teff cells were then 
 labeled with CelltraceTM Violet dye as per manufacturer's instructions (Life 
 Technologies, Grand Island, NY). Teff cells were resuspended in X-VIVO 15 
10 medium supplemented with 5% serum, 1% Pen-Strep. 1x105 cells were added to
each well. Tregs were added at Treg:Teff ratio of 0:1 (Teffs alone), 1:2, 1:4 and 1:8. Treg Suppression Inspector beads (Miltenyi Biotech) were washed and added to the wells at a ratio of 1 bead per cell (Teff หรือ Treg). Final volume in each well was
adjusted to 200 pl. Plates were incubated at 37°C for 4 days. Cells were
15  restimulated with Leukocyte Activation Cocktail, with BD GolgiPlug (2 pl/ml, BD
Biosciences, San Jose, CA) for 5 hours, washed and stained with LIVE/DEAD®
Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit (Life Technologies) following manufacturer's 
 instructions. Cells were washed and surface stain was performed with APC-
 coupled แอนติ-OX40 (allophycocyanin) (clone ACT35, eBioscience) followed by 
20 intracellular staining. Fixation/permeabilization with Foxp3 / Transcription Factor 
 Staining Buffer Set (eBioscience, San Diego, CA) according to the manufacturer's 
 protocol. The following antibodies were used: CD3 V500 (clone SP34-2, BD 
 Biosciences); CD4 FITC (clone RPA-T4, BioLegend). Cells were incubated for 30 
 minutes at 4°C and washed. Cells were run in a BD Canto flow cytometer (BD 
25 Biosciences) and analyzed using FlowJo (Ashland, OR), gating on live singlets 
 CD3+ CD4+ Celltrace+.
Plate-bound ฮิวเมไนซ์ 12H3 antibodies dampened the inhibition by Tregs 
 on Teff การเพิ่มจำนวน. รูป 41 shows the histogram of FACS analyses comparing 
 the การเพิ่มจำนวน of Teff cells stimulated with Treg suppression inspector beads 30 (Miltenyi, San Diego, CA) and treated with plate bound 12H3 VL1VH1 หรือ ไอโซไทป์ 
 control IgG4 in the presence of Tregs at Treg/Teff ratio 1:2. Compared to ไอโซไทป์ 
 control (hIgG4), 12H3 VL1VH1 dampened the inhibitory effect of Tregs on Teff 
 การเพิ่มจำนวน, as indicated by the increase in cell numbers in the successive peaks
 (lower fluorescent intensity) representing subsequent cell divisions detected with CelltraceTM Violet dye. CelltraceTM Violet dye ยึดเกาะ กับ activated amine groups 
inside the cells.
รูป 42 shows the effect of ไคเมริก 12H3 (ฮิวเมน IgG4/x), ฮิวเมไนซ์
5  12H3 VL1VH1 หรือ 12H3 VL1VH2 (both IgG4/x) alone หรือ in combination with OX4OL
(5 i_tg/mL)/แอนติ-His mAb (5 iig/mL) on the replication of Teff cells at Treg:Teff ratio 
 of 0:1 (รูป 42A) หรือ 1:4 (รูป 42B) on cells isolated from one donor. In the 
 absence of Tregs (รูป 42A), CD2/CD3/CD28 stimulator beads alone induced 
 การเพิ่มจำนวน in ฮิวเมน CD134 expressing Teffs (i.e. ไอโซไทป์คอนโทรล). The ไคเมริก 10 and ฮิวเมไนซ์ แอนติ-CD134 antibodies as well as OX4OL stimulated the 
 การเพิ่มจำนวน of CD4+ T cells when compared to the ไอโซไทป์คอนโทรล. การเพิ่มจำนวน 
 was slightly increased with a combination of 2113 VL1VH2 (SF2) with OX4OL. In 
 the presence of Tregs (รูป 42B), CD2/CD3/CD28 stimulator beads alone induced 
 less CD4 T cells การเพิ่มจำนวน when compared to การเพิ่มจำนวน of CD4 T cells 
15 without Treg suppression (replication index about 3 vs about 5). Treg suppression 
 was dampened in the presence of ไคเมริก 12H3, ฮิวเมไนซ์ 12H3 VL1VH1 and 
 12H3 VL1VH2 as well as OX4OL. Presence of the combination of 12H3 VL1VH1 หรือ 
 12H3 VL1VH2 and OX4OL demonstrated a slightly synergistic effect. In the 
 รูป, Teff cell การเพิ่มจำนวน คือ expressed as a replication index, which คือ a 
20 measure of fold-expansion of the Teff cells that have divided at least once in 
 response to a stimulus (e.g., number of cells in millions at the end of the culture 
 that have undergone at least one division).
Table 3 summarizes the effect of 12H3 VH1VH2 IgG4/x.) on effect on Teff 
 การเพิ่มจำนวน in the presence of Tregs at Treg/Teff ratio 0:1, 1:2 and 1:4 for 12H3 25 VL1VH2 (IgG4k) in cells obtained from 5 donors. Degree of การเพิ่มจำนวน was 
 expressed as Replicaton Index. In the absence of Tregs, 12H3 VL1VH2 stimulated 
 Teff cell การเพิ่มจำนวน in all donor-derived cells when compared to the ไอโซไทป์ 
 control (with Teff activated using CD2/CD3/CD28 beads). In the presence of Tregs 
 either at 1:2 หรือ 1:4 Treg/Teff ratio, presence of 12H3 VL1VH2 dampened the Treg 30 suppression in all donor-derived cells.
The results indicate that 12H3 VL1VH1 and 12H3 VL1VH2 have an effect on CD4 เอฟเฟคเตอร์ T cells inducing their การเพิ่มจำนวน, and that the antibodies renders
Teffs somewhat resistant to Tregs หรือ that Tregs themselves are less suppressive in the presence of the antibodies.

Table 3.

0/5000

จาก: -

เป็น: -

ผลลัพธ์ (ไทย) 1: [สำเนา]

คัดลอก!

ผลเหล่านี้แสดงที่ทั้งหมดหกฮิวเมไนซ์ IgG4ic แอนติ-ฮิวเมนCD134 แอนติบอดีโคลน 12H 3 รุ่นแสดงให้เห็นว่าการผูกข้อมูลตรวจหา CD134 สูงความสัมพันธ์ 10 กว่าเมาส์ปกครองแอนติ-ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H 3 และไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H 3ตัวอย่างที่ 12 แอนตี้แอนติ CD134 ระงับ FOX3P นิพจน์ในเซลล์ Treg15Treg แยกและขยาย: Leukopacks ซื้อจากชีวภาพอาหาร (Colamar, PA) และเซลล์เม็ดเลือดแดง lysed กับบัฟเฟอร์ ACK (Stemcellเทคโนโลยี BC แวนคูเวอร์ แคนาดา) บนน้ำแข็ง เซลล์ถูกล้าง และ resuspended ใน AutoMACS เรียกใช้บัฟเฟอร์ Tregs ได้แยกกับ CD4 + CD25 + ชุด 20 CD127dim / -Treg เป็น AutoMACS Pro หรือ LD ทั้งคอลัมน์ด้วยการ QuadroMACS ทั้งหมดจาก Miltenyi เทคโนโลยีชีวภาพ (San Diego, CA) ต่อไปนี้ของผู้ผลิต คำแนะนำ Tregs นับได้ และ 1 x 106 Tregs/ดี ถูกขยายในดี 24 แผ่นใน TexMACS กับลูกปัดขยาย Treg (อนุภาค MACSiBead ก่อน มีแอนตี้ CD3 และ CD28 เทคโนโลยีชีวภาพ Miltenyi) ตามคำแนะนำ 25 ของผู้ผลิต เซลล์มีอ่างที่อัตราส่วนของลูกปัด 4 เซลล์หน้า -500 IU/mL ของ IL-2 และ Rapamycin (100 นาโนเมตร) 5 วันหลังจากแยก เซลล์ มีการถ่ายโอนการ 6 welllplate p.1 40 เม็ด/ดีและสื่อ ด้วย IL-2 (500 IU/m1) และ Rapamycin (100 นาโนเมตร) เพิ่มขึ้น เพิ่มสื่อประกอบด้วย IL-2 ตามความจำเป็น และเซลล์ถูกโอนย้ายไป 10 มม.รอบแผ่นจาน และขยาย 30 เพิ่มเติม หลังจาก 30 วัน ออกลูกปัดกับ MACSiMAG ก่อนปลายน้ำ ใช้งานเปิดใช้งาน Treg: Tregs ขยายถูกติดป้ายม่วง Celltrace ตามแนะนำของผู้ผลิต (เทคโนโลยีชีวิต เกาะแกรนด์ NY) 1.5x105ขยาย Tregs และลูกปัดขยาย Treg 3 x 105 (อนุภาค 1VIACSiBead ก่อนโหลด มีแอนตี้ CD3 และ CD28 เทคโนโลยีชีวภาพ Miltenyi) ถูกชุบรอบล่าง 96 -5 แผ่นดี และ incubated ที่ 37° C ใน X VIVO 15 เสริม ด้วย 5% เซรั่ม 1% ปากกา-Strep และ — 500 IU/mL ของ IL-2 มีหรือไม่มี 12H 3 (0.5 ถึง 5 ไมโครกรัมเป็นเครื่อง/มล) ฮิวเมน/ OX4OL (1 ไมโครกรัมเป็น เครื่อง/ml, R & D ระบบ) และแอนติพระมาบ (1 ไมโครกรัมเป็น เครื่อง/ml R & D ระบบ) หลังจาก 3 วัน เซลล์ถูก restimulated กับเรียกใช้ Leukocyte ค็อกเทล กับ BD GolgiPlug (2 dl/ml เวลาออก BD, San Jose, CA) 5 ชั่วโมง 10 ล้าง และสีกับ LIVE/ตาย ®แน่นอนใกล้อินฟราเรดตายเซลล์ติดชุด (ชีวิตเทคโนโลยี) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต เซลล์ถูกล้างครั้งเดียว และ ย้อมสี intracellular ดำเนินต่อ เบี/permeabilization ด้วย Foxp3 / Transcription ปัจจัยย้อมสีบัฟเฟอร์ตั้ง (eBioscience, San Diego, CA) ตามโพรโทคอลของผู้ผลิต ใช้แอนตี้ต่อไปนี้: CD3 15 V500 (โคลน SP34-2 เวลาออก BD); PE FOXP3 (โคลน 206D, Biolegend); CD4 PerCP (โคลน OKT4, Biolegend); และ OX40 (โคลน ACT35, eBioscience) เซลล์ได้ incubated 30 นาทีที่ 4° C และล้าง เซลล์ที่ถูกเรียกใช้ในขั้นตอนการ BD Canto cytometer (เวลาออก BD) และวิเคราะห์โดยใช้ FlowJo (Ashland, OR), gating บน สด singlets CD3 + CD4 + ความเข้มฟลูออเรสเรขาคณิตมาจากแอนติ-20 FOXP3 PE (R-Phycoerythrin) (geoMFI) ถูกบันทึกไว้รูปที่ 40 แสดงให้เห็นว่าทั้งสองเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 antibodyl2H3(IgG1) และฮิวเมน OX4OL FOXP3 Tregs ขยาย (CD4 + นิพจน์ที่ลดลง CD25-CD127 ติ่มซำ / -) ใช้ Whenl2H3 และ OX4OL รวม ผล ในนิพจน์ FOXP3 ถูกปราบปรามสามารถ ผลการแนะนำที่ที่ 25 การเมาส์แอนติ-ฮิวเมนแอนติบอดี 12H ผลกระทบ 3 Treg ฟังก์ชันโดยตรง และไม่เพียงแต่ ผ่านบทบาทของมันในเซลล์เอฟเฟคเตอร์ T ข้อมูลแสดงถึงตัวอย่าง triplicate บริจาคหนึ่งตัวอย่างที่ 13 แผ่นผูกฮิวเมไนซ์แอนติ-CD134 แอนตี้ ameliorate 30 Treg ปราบปรามเซลล์ Teffผลของฮิวเมไนซ์แอนติ CD134 แอนตี้ 12H 3 VL1VH1 หรือ 12H 3 VL1VH2 (ทั้ง IgG4 / 1c) ถูกประเมินฟังก์ชัน Treg Teff ปราบปรามTregs ถูกแยกต่างหาก ขยาย และเรียกใช้ในตัวอย่างที่ 12 ที่ระบุ รอบล่าง 96-wellplates ถูกเคลือบ ด้วย 12H 3 VL1VH1 หรือ 12H 3 VL1VH2 แอนตี้หรือ ไอโซไทป์คอนโทรลs (10 ไมโครกรัมเป็น เครื่อง/ml) ผสมใน PBS แผ่นมี incubated 2 ชั่วโมงที่ 37° C, rinsed แล้วใช้ในการวิเคราะห์การปราบปราม 5 CD4 + เอฟเฟคเตอร์ T เซลล์ (Teff) แยกต่างหากจากผู้บริจาคที่เดียวกันเป็น Tregs ไม่บริสุทธิ์ จากแช่ PBMCs ที่ใช้ชุดการแยก AutoMACS Pro และ CD4 + จาก Miltenyi เทคโนโลยีชีวภาพตามข้อกำหนดของผู้ผลิต เซลล์ Teff ได้แล้ว ติดป้ายสีม่วง CelltraceTM ตามคำแนะนำของผู้ผลิต (ชีวิต เทคโนโลยี เกาะแกรนด์ NY) มี resuspended เซลล์ Teff ใน X VIVO 15 กลาง 10 เสริม ด้วยเซรั่ม 5%, 1% ปากกา-Strep มีเพิ่มเซลล์ 1 x 105แต่ละบ่อ เพิ่ม Tregs ที่ Treg:Teff อัตราส่วน 0:1 (Teffs คนเดียว), 1:2, 1:4 และ 1:8 ตรวจสอบปราบปราม Treg ประคำ (Miltenyi ชีวภาพ) ถูกล้าง และเพิ่มลงในบ่อที่อัตราส่วนของลูกปัด 1 ต่อเซลล์ (Teff หรือ Treg) เล่มสุดท้ายในแต่ละบ่อได้ปรับ 200 แผ่น pl. ได้ incubated ที่ 37° C สำหรับ 4 วัน เซลล์ได้restimulated กับ Leukocyte เปิดใช้งานค็อกเทล กับ BD GolgiPlug 15 (2 pl/ml, BDเวลาออก San Jose, CA) 5 ชั่วโมง เครื่องซักผ้า และสีกับ® LIVE/ตายแน่นอนใกล้อินฟราเรดตายเซลล์ติดชุด (ชีวิตเทคโนโลยี) ของผู้ผลิตต่อไปนี้ คำแนะนำ เซลล์ถูกล้าง และคราบผิวทำกับเอพีซี- ควบคู่แอนติ-OX40 (allophycocyanin) (ACT35 โคลน eBioscience) ตามด้วย 20 intracellular ย้อมสี เบี/permeabilization กับ Foxp3 / ปัจจัย Transcription ย้อมสี (eBioscience, San Diego, CA) ตั้งค่าบัฟเฟอร์ตามของผู้ผลิต โพรโทคอลการ ใช้แอนตี้ต่อไปนี้: CD3 V500 (โคลน SP34-2, BD เวลาออก); CD4 FITC (โคลน RPA-T4, BioLegend) เซลล์ถูก incubated สำหรับ 30 นาทีที่ 4° C และล้าง เซลล์ถูกเรียกใช้ใน cytometer กระแสเป็น BD Canto (BD เวลาออก 25) และวิเคราะห์โดยใช้ FlowJo (Ashland, OR), gating บน singlets สด CD3 + CD4 + Celltrace +ฮิวเมไนซ์ผูกกับแผ่น 12H 3 แอนตี้ชุบยับยั้ง โดย Tregs บน Teff การเพิ่มจำนวน รูปที่ 41 แสดงฮิสโตแกรมของ FACS วิเคราะห์เปรียบเทียบ การเพิ่มจำนวน Teff เซลล์ถูกกระตุ้น ด้วยลูกปัดตรวจสอบปราบปราม Treg 30 (Miltenyi, San Diego, CA) และรับแผ่นผูก 12H 3 VL1VH1 หรือไอโซไทป์ ควบคุม IgG4 ในต่อหน้าของ Tregs ที่ Treg/Teff อัตราส่วน 1:2 เมื่อเทียบกับไอโซไทป์ ควบคุม (hIgG4), 12H 3 VL1VH1 ชุบผลลิปกลอสไขของ Tregs Teff การเพิ่มจำนวน ตามที่ระบุ โดยการเพิ่มขึ้นของจำนวนเซลล์ในยอดต่อเนื่อง (ต่ำกว่าความเข้มที่เรืองแสง) แทนส่วนเซลล์ต่อมาตรวจพบ CelltraceTM ม่วงย้อมสี ดื่มด่ำยึดเกาะสีม่วง CelltraceTM เรียกใช้กลุ่ม amine ภายในเซลล์รูปที่ 42 แสดงผลของไคเมริก 12H 3 (ฮิวเมน IgG4 / x), ฮิวเมไนซ์5 12H 3 VL1VH1 หรือ 12H 3 VL1VH2 (IgG4 ทั้ง / x) เพียงอย่างเดียวหรือร่วมกับ OX4OL(5 i_tg/mL) / แอนติพระมาบ (5 iig/mL) ในการจำลองแบบของ Teff เซลล์ในอัตราส่วน Treg:Teff 0:1 (รูป 42A) หรือ 1:4 (รูป 42B) บนเซลล์ที่แยกต่างหากจากผู้บริจาคที่หนึ่ง ใน เกิดจากการขาดงานของ Tregs (รูป 42A), CD2 CD3/CD28 เครื่องกระตุ้นเม็ดเพียงอย่างเดียว การเพิ่มจำนวนในฮิวเมน CD134 แสดง Teffs (เช่นไอโซไทป์คอนโทรล) ไคเมริก 10 และแอนตี้แอนติ CD134 ฮิวเมไนซ์ เป็น OX4OL ขาวกระตุ้นการ การเพิ่มจำนวนของเซลล์ CD4 + T เมื่อเทียบกับไอโซไทป์คอนโทรล การเพิ่มจำนวน เล็กน้อยขึ้นกับ 2113 VL1VH2 (SF2) กับ OX4OL ใน ทำให้เกิดสถานะของ Tregs (รูป 42B), CD2 CD3/CD28 เครื่องกระตุ้นเม็ดเพียงอย่างเดียว น้อยกว่า CD4 T เซลล์การเพิ่มจำนวนเมื่อเทียบกับการเพิ่มจำนวนของเซลล์ CD4 T 15 ไม่ปราบปราม Treg (จำลองแบบดัชนีเกี่ยวกับ vs 3 ประมาณ 5) Treg ปราบปราม ถูกชุบในต่อหน้าของไคเมริก 12 H 3 ฮิวเมไนซ์ 3 VL1VH1 12 H และ 12H 3 VL1VH2 และ OX4OL ของทั้ง 12H 3 VL1VH1 หรือ 12H 3 VL1VH2 และ OX4OL แสดงผลพลังเล็กน้อย ใน รูป Teff เซลล์การเพิ่มจำนวนคือแสดงเป็นดัชนีจำลอง คือการ วัดพับขยายเซลล์ Teff ที่ได้แบ่งออกเป็นน้อยครั้งที่ 20 ตอบสนองต่อการกระตุ้นเศรษฐกิจ (เช่น จำนวนของเซลล์ในล้านที่จุดสิ้นสุดของวัฒนธรรม ที่มีระดับส่วนน้อย)ตารางที่ 3 สรุปผล ของ VH1VH2 IgG4 3 12 H / x) บนผล Teff การเพิ่มจำนวนในต่อหน้าของ Tregs ที่ Treg/Teff อัตราส่วน 0:1, 1:2 และ 1:4 สำหรับ 12 H 3 25 VL1VH2 (IgG4k) ในเซลล์ที่ได้รับจากผู้บริจาค 5 ระดับของการเพิ่มจำนวนได้ แสดงเป็นดัชนี Replicaton ในกรณี Tregs, 12H 3 VL1VH2 ถูกกระตุ้น การเพิ่มจำนวนเซลล์ Teff ในเซลล์ทั้งหมดที่ได้รับบริจาคเมื่อเปรียบเทียบกับไอโซไทป์ ควบคุม (ด้วยการเรียกใช้โดยใช้ลูกปัด CD2 CD3/CD28 Teff) ในต่อหน้าของ Tregs แบบที่ 1:2 หรือ Treg/Teff ในอัตรา 1:4 ของ 12H 3 VL1VH2 ชุบปราบปราม Treg 30 ในเซลล์ทั้งหมดที่ได้รับบริจาคผลลัพธ์บ่งชี้ที่ 12H 3 VL1VH1 และ 12 H 3 VL1VH2 มีลักษณะพิเศษบนเซลล์เอฟเฟคเตอร์ T CD4 inducing การเพิ่มจำนวนของพวกเขา และแอนตี้ที่ทำค่อนข้างทนต่อ Tregs Teffs หรือ Tregs ตัวเองน้อย suppressive ในต่อหน้าของแอนตี้ที่ตาราง 3

การแปล กรุณารอสักครู่..

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:[สำเนา]

คัดลอก!

ผลการศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าทั้งหกฮิวเมไนซ์ IgG4ic แอนติ -
ฮิวเมนแอนติบอดีโคลนCD134 12H3 รุ่นแสดงให้เห็นว่าแอนติเจนสูง CD134 ผูกพัน
10 สัมพันธ์ที่ใกล้ชิดกว่าเมาส์ของผู้ปกครองแอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 และไคเมริก
ฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3. ตัวอย่างที่ 12 แอนติ -CD134 แอนติบอดีปราบปรามการแสดงออกในเซลล์ FOX3P Treg 15 แยก Treg และการขยายตัว: leukopacks ที่ซื้อมาจากทางชีวภาพพิเศษ(Colamar, PA) และสีแดง เซลล์เม็ดเลือด lysed กับบัฟเฟอร์ ACK (อัเทคโนโลยีแวนคูเวอร์, แคนาดา) บนน้ำแข็ง เซลล์ที่ถูกล้างและ resuspended ใน AutoMACS ทำงานบัฟเฟอร์ Tregs ถูกแยกกับ CD4 + CD25 + 20 CD127dim / - ชุด Treg ทั้งบน AutoMACS Pro และ / หรือคอลัมน์ LD กับQuadroMACS ทั้งหมดจาก Miltenyi ไบโอเทค (ซานดิเอโก) ของผู้ผลิตต่อไปนี้คำแนะนำ Tregs นับและ 1x106 Tregs / ดีได้รับการขยายตัวใน 24 หลุมจานในขนาดกลางที่มีการขยายตัวTexMACS ลูกปัด Treg (อนุภาค MACSiBead ล่วงหน้าเต็มไปด้วยCD3 และแอนติบอดี CD28; Miltenyi ไบโอเทค) ผู้ผลิตต่อไปนี้ 25 คำแนะนำ เซลล์ที่ถูกเพาะเลี้ยงในอัตราส่วน 4 เม็ด / เซลล์ในการปรากฏตัวของ-500 IU / mL ของ IL-2 และ Rapamycin (100 นาโนเมตร) 5 วันหลังจากการแยกเซลล์ถูกย้ายไป6 welllplate และ 40 p.1 ลูกปัด / ดีและสื่อที่มี IL-2 (500 IU / m1) และ Rapamycin (100 นาโนเมตร) มีการเพิ่ม ขนาดกลางบรรจุ IL-2 ถูกเพิ่มเข้ามาตามความจำเป็นและเซลล์ถูกย้ายไป10 มมแผ่นจานกลมและขยายตัว30 ต่อไป หลังจาก 30 วัน, ลูกปัดถูกลบออกด้วย MACSiMAG ปลายน้ำก่อนการใช้งาน. ยืนยันการใช้งาน Treg: Tregs ขยายถูกกำกับด้วย Celltrace ม่วงตามคำแนะนำของผู้ผลิต(ไลฟ์เทคโนโลยีส์แกรนด์ไอส์แลนด์นิวยอร์ก) 1.5x105 ขยาย Tregs และ 3x105 Treg ลูกปัดขยาย (อนุภาค 1VIACSiBead ก่อนโหลดกับCD3 และแอนติบอดี CD28; Miltenyi ไบโอเทค) ได้รับการชุบในรอบล่าง 96 5 แผ่นดีและบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสใน X-15 VIVO เสริมขนาดกลางที่มี 5 % ซีรั่ม, 1% ปากกา Strep และ -500 IU / mL ของ IL-2 หรือโดยไม่ต้อง 12H3 (0.5 และ 5 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร) และ / หรือฮิวเมน OX4OL (1 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรวิจัยและพัฒนาระบบ) และแอนติ -His mAb (1 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรR & D ของระบบ) 3 วันหลังจากที่เซลล์ถูก restimulated เป็นเวลาที่มีการเปิดใช้งานเม็ดเลือดขาวค๊อกเทลที่มีBD GolgiPlug (2 ดล / ml BD ชีววิทยาศาสตร์, San Jose, CA) 5 ชั่วโมง 10 ล้างและย้อมด้วยสีสด / DEAD®แน่นอนใกล้-IR ตายของเซลล์คราบชุด (ชีวิตเทคโนโลยี) คำแนะนำของผู้ผลิตต่อไปนี้ เซลล์ที่ถูกล้างครั้งเดียวและการย้อมสีเซลล์ได้ดำเนินการดังต่อไปนี้การตรึง / permeabilization กับ Foxp3 / ถอดความปัจจัยการย้อมสีชุดบัฟเฟอร์ (eBioscience, ซานดิเอโก) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต แอนติบอดีต่อไปนี้ถูกนำมาใช้: CD3 15 V500 (โคลน SP34-2, BD ชีววิทยาศาสตร์); FOXP3 PE (โคลน 206D, Biolegend); CD4 PerCP (โคลน OKT4, Biolegend); และ OX40 (โคลน ACT35, eBioscience) เซลล์ที่ถูกบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่ 4 ° C และล้าง เซลล์ที่ถูกเรียกใช้ในการไหล Canto BD cytometer (BD ชีววิทยาศาสตร์) และวิเคราะห์โดยใช้ FlowJo (แอช OR) gating ในsinglets สด CD3 + CD4 + เรขาคณิตเข้มเรืองแสงเฉลี่ยที่ได้มาจากแอนติ -. 20 FOXP3 PE (R-Phycoerythrin) (geoMFI) จะถูกบันทึกรูป40 แสดงให้เห็นว่าทั้งเมาส์แอนติ - การฮิวเมน CD134 antibodyl2H3 (IgG1) และฮิวเมน OX4OL ลดลง FOXP3 การแสดงออกในการขยาย Tregs (CD4 + CD25- CD127 สลัว / -) Whenl2H3 OX4OL และถูกนำมาใช้ในการรวมกันที่มีผลในการปราบปรามFOXP3 แสดงออกเป็นสารเติมแต่ง ผลการวิจัยแนะนำว่าเมาส์ 25 แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี 12H3 ส่งผลกระทบต่อการทำงานของ Treg โดยตรงและไม่เพียง แต่ผ่านบทบาทของตัวเองในเอฟเฟคเตอร์T เซลล์ ข้อมูลแสดงให้เห็นถึงตัวอย่างเพิ่มขึ้นสามเท่าจากหนึ่งในผู้บริจาค. ตัวอย่าง 13. จานผูกพันฮิวเมไนซ์แอนติ -CD134 แอนติบอดีเยียวยา 30 ปราบปราม Treg ของเซลล์ Teff ผลของฮิวเมไนซ์แอนติ -CD134 แอนติบอดี 12H3 VL1VH1 หรือ 12H3 VL1VH2 (ทั้ง IgG4 / 1c) ในการปราบปราม Treg ของฟังก์ชั่นการประเมิน Teff. Tregs ถูกแยกขยายและเปิดใช้งานตามที่อธิบายไว้ในตัวอย่างที่ 12. ระบุรอบ 96 wellplates ล่างถูกเคลือบด้วยแอนติบอดี 12H3 VL1VH1 หรือ 12H3 VL1VH2 หรือไอโซไท ป์คอนโทรล s (10 ไมโครกรัม / มล.) เจือจางในพีบีเอส แผ่นถูกบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสจากนั้นล้างและนำมาใช้ในการทดสอบการปราบปราม 5 CD4 + เอฟเฟคเตอร์ทีเซลล์ (Teff) ที่แยกได้จากผู้บริจาคเช่นเดียวกับ Tregs บริสุทธิ์จากPBMCs แช่แข็งใช้ AutoMACS Pro และชุดแยก CD4 + จาก Miltenyi ไบโอเทคตามข้อกำหนดของผู้ผลิต เซลล์ Teff แล้วถูกกำกับด้วยCelltraceTM ย้อมสีม่วงตามคำแนะนำของผู้ผลิต (ชีวิตTechnologies, แกรนด์ไอส์แลนด์นิวยอร์ก) เซลล์ teff ถูก resuspended ใน X-VIVO 15 10 กลางเสริมด้วยเซรั่ม 5%, 1% ปากกา Strep 1x105 เซลล์ถูกเพิ่มเข้าไปในแต่ละดี Tregs ถูกเพิ่ม Treg ที่อัตราส่วนของ Teff 0: 1 (Teffs คนเดียว) 1: 2, 1: 4 และ 1: 8 Treg ปราบปรามลูกปัดสารวัตร (Miltenyi ไบโอเทค) ได้รับการล้างและเพิ่มเข้าไปในบ่อในอัตราส่วน 1 ต่อลูกปัดมือถือ (Teff หรือ Treg) ปริมาณรอบชิงชนะเลิศในแต่ละดีถูกปรับถึง 200 พี แผ่นถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 4 วัน เซลล์ที่ถูก15 restimulated เป็นเวลาที่มีการเปิดใช้งานเม็ดเลือดขาวค๊อกเทลที่มี BD GolgiPlug (2 พี / ml BD ชีววิทยาศาสตร์, San Jose, CA) 5 ชั่วโมงล้างและย้อมด้วยสีสด / DEAD®แน่นอนใกล้-IR ตายของเซลล์คราบ Kit (เทคโนโลยีชีวิต) ต่อไปนี้ของผู้ผลิตคำแนะนำ เซลล์ที่ถูกล้างและคราบผิวได้ดำเนินการกับ APC- คู่แอนติ -OX40 (allophycocyanin) (โคลน ACT35, eBioscience) ตามด้วย20 การย้อมสีเซลล์ ตรึง / permeabilization กับ Foxp3 / ถอดความปัจจัยการย้อมสีชุดบัฟเฟอร์(eBioscience, ซานดิเอโก) ตามที่ผู้ผลิตของโปรโตคอล แอนติบอดีต่อไปนี้ถูกนำมาใช้: CD3 V500 (โคลน SP34-2, BD ชีววิทยาศาสตร์); CD4 FITC (โคลน RPA-T4, BioLegend) เซลล์ที่ถูกบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสและล้าง เซลล์ที่ถูกเรียกใช้ในการไหล Canto BD cytometer (BD 25 ชีววิทยาศาสตร์) และวิเคราะห์โดยใช้ FlowJo (แอช OR) gating ใน singlets สดCD3 + CD4 + Celltrace +. จานที่ถูกผูกไว้ฮิวเมไนซ์ 12H3 แอนติบอดีชุบยับยั้งโดย Tregs ใน Teff การ เพิ่มจำนวน รูปที่ 41 แสดงให้เห็นกราฟของมาซึ่งการวิเคราะห์เปรียบเทียบการเพิ่มจำนวนของเซลล์Teff กระตุ้นด้วยสารวัตร Treg ปราบปรามลูกปัด 30 (Miltenyi, San Diego, CA) และรับการรักษาด้วยแผ่นผูกพัน 12H3 VL1VH1 หรือไอโซไทป์ควบคุมIgG4 ในการปรากฏตัวของ Tregs ในอัตราส่วน Treg / Teff 1: 2 เมื่อเทียบกับไอโซไทป์ควบคุม (hIgG4) 12H3 VL1VH1 ชุบฤทธิ์ในการยับยั้งของ Tregs ใน Teff การเพิ่มจำนวนตามที่ระบุโดยการเพิ่มขึ้นของจำนวนเซลล์ในยอดเขาที่ต่อเนื่อง(ที่ต่ำกว่าความเข้มเรืองแสง) เป็นตัวแทนของหน่วยเซลล์ภายหลังตรวจพบมี CelltraceTM ม่วง ย้อม CelltraceTM ม่วงสีย้อมยึดเกาะกับการเปิดใช้งานกลุ่ม amine ภายในเซลล์. รูปที่ 42 แสดงให้เห็นถึงผลกระทบของไคเมริก 12H3 (ฮิวเมน IgG4 / x), ฮิวเมไนซ์5 12H3 VL1VH1 หรือ 12H3 VL1VH2 (IgG4 ทั้ง / x) เพียงอย่างเดียว หรือร่วมกับ OX4OL (5 i_tg / มิลลิลิตร) / แอนติ -His mAb (5 IIG / มิลลิลิตร) ในการจำลองแบบของเซลล์ Teff ที่ Treg อัตราส่วน Teff 0: 1 (รูป 42A) หรือ 1: 4 (รูป 42B ) ในเซลล์ที่แยกได้จากผู้บริจาคหนึ่ง ในกรณีที่ไม่มี Tregs (รูป 42A) CD2 / CD3 / CD28 ลูกปัดกระตุ้นคนเดียวเหนี่ยวนำให้เกิดการเพิ่มจำนวนในฮิวเมนCD134 แสดง Teffs (เช่นไอโซไทป์คอนโทรล) ไคเมริก 10 และฮิวเมไนซ์แอนติ -CD134 แอนติบอดีเช่นเดียวกับ OX4OL กระตุ้นการเพิ่มจำนวนของเซลล์CD4 + T เมื่อเทียบกับไอโซไทป์คอนโทรล การเพิ่มจำนวนเพิ่มขึ้นเล็กน้อยกับการรวมกันของ VL1VH2 2113 (ที่ SF2) กับ OX4OL ในการปรากฏตัวของ Tregs (รูป 42B) CD2 / CD3 / CD28 ลูกปัดกระตุ้นชักนำคนเดียว CD4 น้อย T เซลล์การเพิ่มจำนวนเมื่อเทียบกับการเพิ่มจำนวนของเซลล์ CD4 T 15 โดยไม่ต้องปราบปราม Treg (ดัชนีการจำลองแบบประมาณ 3 เทียบกับประมาณ 5) ปราบปราม Treg ได้รับผลกระทบในการปรากฏตัวของไคเมริก 12H3, ฮิวเมไนซ์ 12H3 VL1VH1 และ12H3 VL1VH2 เช่นเดียวกับ OX4OL การปรากฏตัวของการรวมกันของ 12H3 VL1VH1 หรือ12H3 VL1VH2 และ OX4OL แสดงให้เห็นถึงผลเสริมฤทธิ์กันเล็กน้อย ในรูปเซลล์ Teff การเพิ่มจำนวนคือแสดงเป็นดัชนีการทำแบบจำลองซึ่งคือ 20 ตัวชี้วัดของพับการขยายตัวของเซลล์ Teff ว่าได้มีการแบ่งอย่างน้อยหนึ่งครั้งในการตอบสนองต่อสิ่งเร้า(เช่นจำนวนของเซลล์ในล้านที่ ในตอนท้ายของวัฒนธรรม. ที่ได้รับอย่างน้อยหนึ่งส่วน) ตารางที่ 3 สรุปผลของการ 12H3 VH1VH2 IgG4 / x) ในผลกระทบต่อ Teff. การเพิ่มจำนวนในการปรากฏตัวของ Tregs ในอัตราส่วน Treg / Teff 0: 1, 1: 2 และ 1: 4 สำหรับ 12H3 25 VL1VH2 (IgG4k) ในเซลล์ที่ได้รับจากผู้บริจาคที่ 5 ระดับของการเพิ่มจำนวนได้แสดงเป็น Replicaton ดัชนี ในกรณีที่ไม่มี Tregs ที่ 12H3 VL1VH2 กระตุ้นเซลล์Teff การเพิ่มจำนวนในทุกเซลล์ของผู้บริจาคที่ได้มาเมื่อเทียบกับไอโซไทป์ควบคุม(ที่มีการเปิดใช้งานโดยใช้ Teff CD2 / CD3 / ลูกปัด CD28) ในการปรากฏตัวของ Tregs ทั้งที่ 1: 2 หรือ 1: 4. Treg / อัตราส่วน Teff การปรากฏตัวของ 12H3 VL1VH2 ชุบ Treg 30 การปราบปรามในทุกเซลล์ของผู้บริจาคที่ได้มาจากผลการศึกษาพบว่า 12H3 VL1VH1 และ 12H3 VL1VH2 มีผลกระทบต่อการตรวจ CD4 เอ ฟเฟคเตอร์ T เซลล์กระตุ้นให้เกิดการเพิ่มจำนวนของพวกเขาและแอนติบอดี้วาทกรรม Teffs ค่อนข้างทนต่อ Tregs หรือว่าตัวเองเป็น Tregs ปราบปรามน้อยกว่าในการปรากฏตัวของแอนติบอดีที่. ตารางที่ 3

การแปล กรุณารอสักครู่..

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:[สำเนา]

คัดลอก!

ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าทั้งหมดหกฮิวเมไนซ์ igg4ic แอนติ - ฮิวเมน
cd134 แอนติบอดีโคลน 12h3 รุ่น มีค่า cd134 แอนติเจนจำเพาะของผูกพัน
10 กว่าเมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลนและ 12h3 ไคเมริก
ฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 12h3

ตัวอย่าง 12แอนติ - cd134 ภูมิคุ้มกันปราบปราม fox3p การแสดงออกในเซลล์ treg

treg 15 แยกและขยาย : leukopacks ซื้อมาจากอาหารชีวภาพ
( colamar , PA ) และเม็ดเลือดแดง lysed กับ ACK บัฟเฟอร์ ( สเต็มเซลล์
Technologies , Vancouver , BC , แคนาดา ) บนน้ำแข็ง เซลล์มีการล้าง และ resuspended
ใน automacs วิ่งบัฟเฟอร์ ทีเร็กส์ได้แยกกับ CD4 cd25
20 cd127dim / - treg ชุดทั้งบน automacs Pro และ / หรือ LD คอลัมน์ด้วย
quadromacs ทั้งหมดจาก miltenyi BIOTECH ( San Diego , CA ) คำสั่งต่อไปนี้ของผู้ผลิต

ทีเร็กส์ได้นับและ 1x106 ทีเร็กส์ / ดีกำลังขยาย 24 ดี
แผ่นใน texmacs กลางด้วยลูกปัดขยาย treg ( macsibead อนุภาค pre -
โหลดทันที cd28 และแอนติบอดี ;miltenyi Biotech ) ต่อไปนี้ผู้ผลิต 25 คำสั่ง เซลล์เพาะเลี้ยงในอัตราส่วน 4 เม็ด / เซลล์ในการปรากฏตัวของ
- 500 IU / ml และ IL-2 ราปาไมซิน ( 100 nm ) 5 วัน หลังจากการแยกเซลล์
ถูกย้ายไป welllplate 40 ป. 6 เม็ด / ดีและสื่อ 3 ( 500
IU / 1 ) และ ราปาไมซิน ( 100 nm ) มีการเพิ่ม อาหารที่ประกอบด้วย 2 เพิ่ม
ตามต้องการ และเซลล์ที่ถูกโอนไปยัง 10 มม. แผ่นจานกลมและขยาย
30 ต่อไป หลังจาก 30 วัน , ลูกปัดถูกลบออกด้วย macsimag ก่อนการใช้งานต่อเนื่อง

treg กระตุ้น : ทีเร็กส์ขยายเป็นป้ายชื่อ celltrace ม่วงตาม
คําแนะนําของผู้ผลิต ( เทคโนโลยี ชีวิตบนเกาะแกรนด์ , นิวยอร์ก ) 1.5x105
การขยายและการขยายตัวทีเร็กส์ 3x105 treg ลูกปัด ( 1viacsibead อนุภาคก่อนโหลดกับทันที
cd28 และแอนติบอดี ; miltenyi Biotech ) ชุบรอบล่าง 96 -
5 ดีแผ่นและบ่มที่ 37 ° C ใน 15 x-vivo เติม 5 %
เซรั่ม 1 ปากกาและ Strep - 500 IU / ml ของ IL-2 กับค็อคโดยไม่ 12h3 ( 0.5 และ 5
µกรัม / มิลลิลิตร ) และ / หรือฮิวเมน ox4ol ( 1 µกรัม / มิลลิลิตรr & D ระบบ ) และแอนติ - มาบของเขา ( 1 µ g / ml
r & D ระบบ หลังจาก 3 วัน เซลล์ที่ถูกกระตุ้นด้วย ทั้งนี้ restimulated
ค็อกเทลกับ BD golgiplug ( 2 DL / ml BD BIOSCIENCES , San Jose , CA ) 5 ชั่วโมง 10 ล้างและย้อมด้วยชีวิต / ตาย®ซ่อมได้ใกล้อินฟราเรดเซลล์ที่ตายคราบ Kit ( เทคโนโลยีกับชีวิต
) คำสั่งต่อไปนี้ของผู้ผลิต . เซลล์มีการล้างครั้งเดียว
การกระทำดังต่อไปนี้การตรึงเซลล์ / permeabilization ด้วย
foxp3 / ถอดความปัจจัยการตั้งค่าบัฟเฟอร์ ( ebioscience , San Diego , CA )
ตามขั้นตอนของผู้ผลิต ดังนั้นต่อไปนี้ที่ใช้ : ทันที 15 v500 ( โคลน sp34-2 BD BIOSCIENCES ) ; foxp3 PE ( โคลน 206d biolegend , ) ; ค่า
percp ( โคลน okt4 biolegend , ) ; และ ox40 ( โคลน act35 ebioscience , )เซลล์มี
บ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศา C และล้าง เซลล์มีการเรียกใช้ใน BD แทนการใช้โมโน
( BD BIOSCIENCES ) และวิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ flowjo ( แอชแลนด์ , หรือ ) , gating บน
สดเสื้อกล้ามทันที 4 . ค่าเฉลี่ยเรขาคณิตเรืองแสงเข้มที่ได้จากแอนติ -
20 foxp3 PE ( r-phycoerythrin ) ( geomfi ) ถูกบันทึกไว้ .
รูป 40 แสดงให้เห็นว่าทั้งเมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 antibodyl2h3

การแปล กรุณารอสักครู่..

ภาษาอื่น ๆ

การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.