The catalytic efficiency of MCOs an

The catalytic efficiency of MCOs and the range of substrates oxidized are determined partly by the redox potential of the type-1 copper that shuttles electrons from substrates to the trinuclear copper centre. Previous studies with CotA demonstrate the ability to manipulate the redox potential and catalytic efficiency of this enzyme through substituting amino acids involved in coordinating or stabilizing the type-I copper site (Durão et al., ,). In particular, replacing Met502 by leucine or phenylalanine increased the redox potential of CotA, while replacing L386 and I494 with alanine decreased the redox potential and catalytic efficiency of the enzyme.

The published crystal structure of SLAC revealed that the two domain protein forms trimers in solution, where each trimer contains three trinuclear copper clusters (types 2 and 3) and three mononuclear copper centres (type-1) (Skálová et al., 2009). Site-directed mutagenesis was recently used to investigate the role of Tyr108 in the reduction of oxygen, and revealed the potential of this tyrosine residue to minimize the lifetime of reactive oxygen species by providing an additional source of reductant (Gupta et al., 2012). In the current study, 17 amino acids were individually mutated to Ala to identify the residues important for SLAC activity, as well as to confirm key residues involved in copper binding, and to predict those that could be targeted to alter the substrate specificity of this enzyme (Table S1, Fig. S5).

Mutagenesis of SLAC confirmed an important role of the amino acid residues coordinating the mononuclear and trinuclear copper ions. Specifically, SLAC activity was dramatically reduced in mutant proteins containing 1 of 10 histidine substitutions or a cysteine substitution at positions predicted to coordinate the mononuclear (type-1) copper ion (H231A, C288A, H293A) and copper ions in the trinuclear (type 2 + type 3) cluster (H102A, H104A, H156A, H158A, H234A, H236A, H287A and H289A) (Fig. 3A). Substituting Met298 to alanine reduced SLAC activity by approximately 35%, which is consistent with role of this amino acid position in fine-tuning the redox potential of the type-1 copper ion (Durão et al., 2008b; Skálová et al., 2009). Notably, in a previous study of the corresponding Met502 residue in CotA, M502L and M502F substitutions reduced CotA turnover rates on ABTS to approximately 45% and 1% of wild-type levels, respectively, even though the redox potential of the mutant enzymes was higher than the wild-type (Durão et al., 2006). Similarly, the TvL laccase from Trametes villosa contains a Phe463 at the position typically occupied by the methionine that fine-tunes the redox potential of type 1 copper ions in other copper oxidases (Xu et al., 1997). When mutating Phe463 to methionine, the kcat value of TvL with ABTS nearly doubles, despite the wild-type enzyme having higher redox potential (Xu et al., 1997). These studies indicate that future efforts to increase the redox potential of SLAC by mutating Met298 should consider detrimental effects such mutations could have on turnover rate.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ประสิทธิภาพของ MCOs ตัวเร่งปฏิกิริยาและทำพื้นผิวออกซิไดซ์ถูกกำหนดบางส่วน โดยศักยภาพ redox ของทองแดงชนิด 1 ที่รถอิเล็กตรอนจากพื้นผิวศูนย์ trinuclear ทองแดง การศึกษาก่อนหน้านี้ ด้วย CotA แสดงให้เห็นถึงความสามารถในการจัดการ redox ตัวเร่งปฏิกิริยา และมีศักยภาพประสิทธิภาพของเอนไซม์นี้ผ่านแทนกรดอะมิโนที่เกี่ยวข้องในการประสานงาน หรือ stabilizing ชนิด-ฉันทองแดงไซต์ (Durão et al.,,) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง แทน Met502 leucine หรือ phenylalanine เพิ่มศักยภาพ redox ของ CotA ขณะเปลี่ยน L386 และ I494 ด้วยอะลานีนลด redox ตัวเร่งปฏิกิริยา และมีศักยภาพประสิทธิภาพของเอนไซม์โครงสร้างผลึกประกาศของ SLAC เปิดเผยว่า โปรตีนโดเมนสองฟอร์ม trimers ในโซลูชัน ซึ่งแต่ละ trimer ประกอบด้วยคลัสเตอร์ trinuclear ทองแดงสาม (ประเภท 2 และ 3) และสาม mononuclear ทองศูนย์ (ชนิด-1) (Skálová et al., 2009) ตรงไซต์ mutagenesis เมื่อเร็ว ๆ นี้ใช้ในการตรวจสอบบทบาทของ Tyr108 ในการลดลงของออกซิเจน และเปิดเผยศักยภาพของสารตกค้างนี้ tyrosine เพื่อลดอายุการใช้งานชนิดปฏิกิริยาออกซิเจนให้กับแหล่งเพิ่มเติมของ reductant (กุปตา et al., 2012) ในการศึกษาปัจจุบัน กรดอะมิโน 17 ได้แยกกลายไปอลาระบุตกสำคัญสำหรับ SLAC กิจกรรม เช่น เป็นยืนยันตกคีย์ที่เกี่ยวข้องในการเชื่อมทองแดง การทำนายที่สามารถกำหนดเป้าหมายเปลี่ยน specificity พื้นผิวของเอนไซม์นี้ (ตาราง S1 ฟิก S5)Mutagenesis of SLAC confirmed an important role of the amino acid residues coordinating the mononuclear and trinuclear copper ions. Specifically, SLAC activity was dramatically reduced in mutant proteins containing 1 of 10 histidine substitutions or a cysteine substitution at positions predicted to coordinate the mononuclear (type-1) copper ion (H231A, C288A, H293A) and copper ions in the trinuclear (type 2 + type 3) cluster (H102A, H104A, H156A, H158A, H234A, H236A, H287A and H289A) (Fig. 3A). Substituting Met298 to alanine reduced SLAC activity by approximately 35%, which is consistent with role of this amino acid position in fine-tuning the redox potential of the type-1 copper ion (Durão et al., 2008b; Skálová et al., 2009). Notably, in a previous study of the corresponding Met502 residue in CotA, M502L and M502F substitutions reduced CotA turnover rates on ABTS to approximately 45% and 1% of wild-type levels, respectively, even though the redox potential of the mutant enzymes was higher than the wild-type (Durão et al., 2006). Similarly, the TvL laccase from Trametes villosa contains a Phe463 at the position typically occupied by the methionine that fine-tunes the redox potential of type 1 copper ions in other copper oxidases (Xu et al., 1997). When mutating Phe463 to methionine, the kcat value of TvL with ABTS nearly doubles, despite the wild-type enzyme having higher redox potential (Xu et al., 1997). These studies indicate that future efforts to increase the redox potential of SLAC by mutating Met298 should consider detrimental effects such mutations could have on turnover rate.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ประสิทธิภาพเร่งปฏิกิริยาของ MCOs และช่วงของพื้นผิวออกซิไดซ์จะถูกกำหนดโดยส่วนหนึ่งที่มีศักยภาพรีดอกซ์ของชนิด-1 ทองแดงที่รถรับส่งอิเล็กตรอนจากพื้นผิวไปยังศูนย์ทองแดง trinuclear การศึกษาก่อนหน้ากับ Cota แสดงให้เห็นถึงความสามารถในการจัดการที่มีประสิทธิภาพที่มีศักยภาพและการเร่งปฏิกิริยารีดอกซ์ของเอนไซม์นี้ผ่านแทนกรดอะมิโนมีส่วนร่วมในการประสานงานหรือเสถียรภาพเว็บไซต์ประเภท-I ทองแดง (Durão et al.,) โดยเฉพาะอย่างยิ่งการเปลี่ยน Met502 โดย Leucine หรือฟีนิลเพิ่มศักยภาพรีดอกซ์ของ Cota ในขณะที่การเปลี่ยน L386 และ I494 กับอะลานีนลดลงที่มีศักยภาพรีดอกซ์และประสิทธิภาพการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์โครงสร้างผลึกตีพิมพ์ SLAC เปิดเผยว่าทั้งสองโปรตีนโดเมน Trimers รูปแบบในการแก้ปัญหา ซึ่งแต่ละ trimer มีสามกลุ่มทองแดง trinuclear (ประเภทที่ 2 และ 3) และสามศูนย์ทองแดงโมโนนิวเคลียร์ (ประเภท 1) (Skalova et al., 2009) เว็บไซต์กำกับการกลายพันธุ์ถูกนำมาใช้เมื่อเร็ว ๆ นี้ในการตรวจสอบบทบาทของ Tyr108 ในการลดออกซิเจนและเปิดเผยศักยภาพของสารตกค้างซายน์นี้จะลดอายุการใช้งานของออกซิเจนโดยการให้เป็นแหล่งที่เพิ่มดัก (Gupta et al., 2012) . ในการศึกษาปัจจุบัน, 17 กรดอะมิโนที่กลายพันธุ์เป็นรายบุคคลเพื่อ Ala เพื่อระบุสารตกค้างที่สำคัญสำหรับกิจกรรม SLAC รวมทั้งเพื่อยืนยันสารตกค้างที่สำคัญที่เกี่ยวข้องกับการมีผลผูกพันทองแดงและการทำนายผู้ที่จะได้รับการกำหนดเป้าหมายในการปรับเปลี่ยนพื้นผิวจำเพาะของเอนไซม์นี้ (ตารางที่ S1, รูป. S5) และการกลายพันธุ์ของ SLAC ยืนยันบทบาทที่สำคัญของกรดอะมิโนประสานงานโมโนนิวเคลียร์และไอออนทองแดง trinuclear โดยเฉพาะกิจกรรมที่ SLAC ได้รับการลดลงอย่างมากในโปรตีนกลายพันธุ์ที่มี 1 จาก 10 แทนฮิสติดีนหรือทดแทน cysteine ​​ที่ตำแหน่งคาดว่าจะประสานงานโมโนนิวเคลียร์ (ประเภท 1) ไอออนทองแดง (H231A, C288A, H293A) และไอออนทองแดงใน trinuclear (ชนิดที่ 2 ประเภท + 3) กลุ่ม (H102A, H104A, H156A, H158A, H234A, H236A, H287A และ H289A) (รูปที่ 3A.) แทน Met298 กับอะลานีนกิจกรรม SLAC ลดลงประมาณ 35% ซึ่งมีความสอดคล้องกับบทบาทของตำแหน่งนี้กรดอะมิโนในการปรับจูนศักยภาพรีดอกซ์ของไอออนทองแดงชนิด-1 (Durãoและคณะ, 2008b;.. Skalova et al, 2009 ) โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการศึกษาก่อนหน้านี้ของสารตกค้าง Met502 ที่สอดคล้องกันใน Cota, M502L และ M502F แทนลดอัตราการหมุนเวียนใน Cota ABTS ประมาณ 45% และ 1% ของระดับป่าชนิดตามลำดับแม้ว่าศักยภาพรีดอกซ์ของเอนไซม์กลายพันธุ์สูง กว่าชนิดป่า (Durão et al., 2006) ในทำนองเดียวกัน laccase TVL จาก Trametes villosa มี Phe463 ในตำแหน่งที่มักจะครอบครองโดย methionine ที่ปรับแต่งที่มีศักยภาพรีดอกซ์ของชนิด 1 ทองแดงใน oxidases ทองแดงอื่น ๆ (Xu et al., 1997) เมื่อกรรมวิธี Phe463 เพื่อ methionine ค่า kcat ของ TVL กับ ABTS เกือบสองเท่าแม้จะมีเอนไซม์ชนิดป่าที่มีศักยภาพรีดอกซ์ที่สูงขึ้น (Xu et al., 1997) การศึกษาเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าความพยายามในอนาคตเพื่อเพิ่มศักยภาพในการรีดอกซ์ของ SLAC โดยกรรมวิธี Met298 ควรพิจารณาผลอันตรายกลายพันธุ์ดังกล่าวอาจมีผลต่ออัตราการหมุนเวียน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ประสิทธิภาพการ mco และช่วงของพื้นผิวออกซิไดซ์ได้บางส่วน โดยรีดอกซ์ศักยภาพของทองแดง 1 ที่ลำอิเล็กตรอนจากพื้นผิวเพื่อ trinuclear ทองแดงศูนย์การศึกษากับ Cota แสดงให้เห็นถึงความสามารถในการ จัดการรีดอกซ์ศักยภาพและประสิทธิภาพเร่งของเอนไซม์นี้ผ่านการประสานงานหรือกรดอะมิโนที่เกี่ยวข้องกับการรักษาเสถียรภาพของเว็บไซต์ประเภท - I ( เหล็ก ทองแดง ฮัล o et al . , , ) โดยเฉพาะการเปลี่ยน met502 โดยลิวซีนหรือฟีนิลอะลานีนเพิ่มขึ้นศักยภาพรีดอกซ์ของ Cota ,และในขณะที่แทน l386 i494 กับลานินลดลง รีดอกซ์ศักยภาพและประสิทธิภาพเร่งของเอนไซม์ .

ในโครงสร้างผลึกของซเลคสองโดเมนโปรตีน พบว่า รูปแบบ trimers ในสารละลายที่ประกอบด้วย 3 กลุ่มแต่ละไตรเมอร์ ทองแดง trinuclear ( ประเภท 2 และ 3 ) และ 3 ) ทองแดง ( 1 ) ปกติ ( SK . kgm lov . kgm et al . , 2009 )เว็บไซต์ของที่เพิ่งใช้เพื่อศึกษาบทบาทของ tyr108 ในการลดลงของออกซิเจน และแสดงศักยภาพของกากนี้แต่อย่างใด เพื่อลดการใช้งานของชนิดออกซิเจนปฏิกิริยาโดยการให้เป็นแหล่งที่มาเพิ่มเติมของรีดักแทนท์ ( Gupta et al . , 2012 ) ในการศึกษาปัจจุบัน17 กรดอะมิโนนักเรียนรายบุคคลกลายพันธุ์ให้เอ๋หาสารตกค้างที่สำคัญสำหรับกิจกรรมซแลค รวมทั้งยืนยันตกค้างหลักที่เกี่ยวข้องในทองแดงผูกพันและทำนายที่สามารถเป็นเป้าหมายเพื่อเปลี่ยนแปลงความจำเพาะของเอนไซม์ตั้งต้น ( ตาราง S1 S5

รูป )การกลายพันธุ์ของซเลคยืนยันบทบาทสำคัญของกรดอะมิโนเหลือใช้ ปกติ trinuclear ไอออนทองแดงและประสานงาน . โดยเฉพาะ กิจกรรมซแลคคือการลดลงอย่างมากในโปรตีนกลายพันธุ์ที่มี 1 10 เมื่อเปลี่ยนกรดอะมิโนที่ตำแหน่งหรือการใช้ทำนายการประสานงานปกติ ( 1 ) ทองแดงไอออน ( h231a c288a , ,h293a ) และไอออนของทองแดงใน trinuclear ( ประเภท 2 ประเภท 3 ) กลุ่ม ( h102a h104a h156a h158a , , , , h236a h234a , และ , h287a h289a ) ( รูปที่ 3 ) แทนเพื่อลดกิจกรรม met298 อะลานีนซแลคประมาณ 35% ซึ่งสอดคล้องกับบทบาทของกรดอะมิโนที่ตำแหน่งในการปรับจูนรีดอกซ์ศักยภาพของไอออนทองแดง 1 ( ช่วงฮัล o et al . , 2008b ; SK . kgm lov . kgm et al . , 2009 ) โดยเฉพาะในการศึกษาก่อนหน้านี้ของสารตกค้าง met502 สอดคล้องกันใน Cota , m502l m502f แทนและลดอัตราการหมุนเวียนใน Cota Abbr ประมาณ 45 % และ 1% ของระดับตามลำดับ แม้ว่าศักยภาพรีดอกซ์กลายพันธุ์ของสูงกว่า ( ช่วงของฮัล o et al . , 2006 ) ในทํานองเดียวกันโดย Mohamed แลคเคสจาก trametes ventricosa ประกอบด้วย phe463 ที่ตำแหน่งมักจะครอบครองโดย methionine ที่ได้เพลงที่รีดอกซ์ที่มีศักยภาพของประเภท 1 ไอออนทองแดงใน oxidases ทองแดงอื่น ๆ ( Xu et al . , 1997 ) เมื่อติดเชื้อ phe463 กับเมทไธโอนีน , kcat มูลค่า Mohamed กับ Abbr เกือบสองเท่า แม้มีศักยภาพรีดอกซ์ของเอนไซม์สูงกว่า ( Xu et al . , 1997 )การศึกษานี้บ่งชี้ว่า ความพยายามในอนาคต เพื่อเพิ่มศักยภาพของซแลคด้วยกรรมวิธีรีดอกซ์ met298 ควรมีผลการกลายพันธุ์ดังกล่าวจะมีอัตราการหมุนเวียน