For counts of fungi, yeast, and tot

For counts of fungi, yeast, and total bacteria, 100 mL of a decimal
dilution in 0.85% sterile saline solution was spread onto potatodextrose
(Difco) and YM agar plates supplemented with
penicillin-streptomycin (SigmaeAldrich, St. Louis, MO, USA) and
plate count agar (Difco) plates with cycloheximide (Sigma),
respectively. Incubation was carried out at 25
C for 3e5 days for
fungi, 29
C for 48 h for yeast, and 37
C for 30 h for total bacteria.
Plates counts were performed in triplicate, and the results from
plates with 30e300 colonies were expressed as log cfu/mL.
For PCR-DGGE analysis, a direct DNA extraction was performed
as described by Mills et al. (2002). Briefly, cell pellets resuspended
in 400 mL of breaking buffer [2% Triton X-100, 1% sodium dodecyl
sulphate, 100 mM NaCl, 10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0)]
and 400 mL of phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)
(Sigma) with 0.4 g of 0.5-mm zirconia-silica beads (Biospec, Bartlesville,
OK, USA) were disrupted using a FastPrep-24 bead beater
(BIO 101, Vista, CA, USA), and then the aqueous phase was purified
using the DNeasy Plant Mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). PCR
amplification was performed as described by Tanaka et al. (2012).
For the analysis of bacterial diversity, the V3 region of 16S rDNAwas
amplified by PCR using the universal bacterial primers 357F-GC and
517R. Fragments of the fungal gene at the 26S rRNA D1/D2 region
were generated using the eukaryotic universal primers NL1-GC and
LS2. DGGE analysis was performed in 8% (w/v) polyacrylamide gels
(acrylamide: bisacrylamide 37.5:1) using a Dcode apparatus (Bio-
Rad, Richmond, CA, USA). A denaturing gradient gel from 30% to
60%was run at 125 V and 60
C for 5.5 h. Bands visualized under UV
light were re-amplified using the same primers without the GC
clamp. The PCR products were purified using a QIAquick PCR

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สำหรับจำนวน ของเชื้อรา ยีสต์ แบคทีเรียรวม 100 mL ของทศนิยมเจือจางใน 0.85% น้ำใส่เกลือได้แพร่กระจายไปบน potatodextrose(Difco) และ YM agar แผ่นเสริมด้วยยาเพนนิซิลลิน-streptomycin (SigmaeAldrich, St. Louis, MO สหรัฐอเมริกา) และแผ่น agar (Difco) จำนวนแผ่นกับ cycloheximide (ซิกมา),ตามลำดับ คณะทันตแพทยศาสตร์ได้ดำเนินการที่ 25 C วัน 3e5 สำหรับเชื้อรา 29 C h 48 สำหรับยีสต์ และ C 37 สำหรับ h 30 สำหรับแบคทีเรียรวมดำเนินการตรวจนับจาน triplicate และผลจากแผ่นกับอาณานิคม 30e300 ถูกแสดงเป็นล็อก cfu/mLสำหรับการวิเคราะห์ PCR DGGE ทำการสกัดดีเอ็นเอโดยตรงตามที่อธิบายไว้โดยโรงงานผลิต et al. (2002) สั้น ๆ เซลล์ขี้ resuspendedใน 400 mL แบ่งบัฟเฟอร์ [2 ไตรตั้น X 100%, 1% โซเดียม dodecylซัลเฟต 100 มม. NaCl, 10 มม.ตรี (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0)]และ 400 mL แอลกอฮอล์ คลอโรฟอร์ม/วาง/isoamyl (25:24:1)(ซิกมา) กับ 0.4 g ของเม็ด 0.5 มม. zirconia-ซิลิก้า (Biospec, Bartlesvilleตกลง สหรัฐอเมริกา) ได้ระหว่างสองวันใช้ตีเป็นลูกปัด FastPrep-24(ไบโอ 101, Vista, CA, USA), แล้ว ระยะสเอาท์ที่บริสุทธิ์ใช้ชุดมินิโรงงาน DNeasy (Qiagen, Valencia, CA, USA) PCRขยายที่ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยทานากะ et al. (2012)สำหรับการวิเคราะห์แบคทีเรียหลากหลาย แคว้น V3 16S rDNAwasขยาย โดย PCR ที่ใช้ไพรเมอร์แบคทีเรียสากล 357F-GC และ517R การกระจายตัวของยีนเชื้อราใน 26S rRNA ภูมิภาคง 1/D2สร้างขึ้นโดยใช้ไพรเมอร์สากล eukaryotic NL1-GC และLS2 DGGE วิเคราะห์ได้ดำเนินการใน 8% (w/v) polyacrylamide gels(อะคริลาไมด์: bisacrylamide 37.5:1) โดยใช้เครื่อง Dcode (Bio-ราษฎร์ ริชมอนด์ CA, USA) เจ denaturing ไล่ระดับจาก 30%รันที่ 125 V และ C 60 สำหรับ h. 5.5 วง visualized ภายใต้ UV 60%ไฟได้ใหม่ขยายโดยใช้ไพรเมอร์เหมือนกัน โดย GCแคลมป์ ผลิตภัณฑ์ PCR ได้บริสุทธิ์โดยใช้ QIAquick PCR

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สำหรับข้อหาเชื้อรายีสต์และแบคทีเรียรวม 100
มิลลิลิตรของทศนิยมเจือจางใน0.85% น้ำเกลือปลอดเชื้อกระจายไปยัง potatodextrose
(Difco) และ YM
แผ่นวุ้นเสริมด้วยยาปฏิชีวนะ-streptomycin (SigmaeAldrich, เซนต์หลุยส์สหรัฐอเมริกา)
และแผ่นวุ้นนับ(Difco) แผ่นที่มี cycloheximide (ซิกม่า)
ตามลำดับ บ่มเพาะได้ดำเนินการที่ 25 องศาเซลเซียสวัน 3e5
สำหรับเชื้อราที่29 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 48 ชั่วโมงสำหรับยีสต์และ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 ชั่วโมงสำหรับแบคทีเรียทั้งหมด.
นับแผ่นได้ดำเนินการในเพิ่มขึ้นสามเท่าและผลจากแผ่นที่มี 30e300 อาณานิคมอยู่ แสดงตาม log cfu / มล. สำหรับการวิเคราะห์ PCR-DGGE การสกัดดีเอ็นเอโดยตรงได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยมิลส์และอัล (2002) สั้น ๆ , เม็ดเซลล์ resuspended ใน 400 มิลลิลิตรของการทำลายบัฟเฟอร์ [2% Triton X-100, โซเดียม 1% โดเดซิลซัลเฟต100 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ 10 มิลลิ Tris (pH 8.0) EDTA 1 มิลลิ (pH 8.0)] และ 400 มิลลิลิตรฟีนอล / คลอโรฟอร์ม / isoamyl เครื่องดื่มแอลกอฮอล์ (25: 24: 1) (ซิกม่า) 0.4 กรัม 0.5 มมลูกปัดเซอร์โคเนียซิลิกา (Biospec, บาร์เทิล, OK, สหรัฐอเมริกา) กระจัดกระจายใช้ชนะลูกปัด FastPrep-24 (BIO 101, Vista, CA, USA) และจากนั้นเฟสน้ำบริสุทธิ์โดยใช้พืชDNeasy ชุดมินิ (Qiagen, วาเลนเซีย, CA, USA) PCR ขยายได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยทานากะ, et al (2012). สำหรับการวิเคราะห์ความหลากหลายของแบคทีเรียในภูมิภาค V3 ของ 16S rDNAwas ขยายโดยวิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์ของแบคทีเรียสากล 357F-GC และ517R ชิ้นส่วนของยีนเชื้อราที่ 26S rRNA D1 / D2 ภูมิภาคถูกสร้างขึ้นโดยใช้ไพรเมอร์สากลeukaryotic NL1-GC และLS2 การวิเคราะห์ DGGE ได้ดำเนินการใน 8% (w / v) เจลอะคริเลต(ริลาไมด์: bisacrylamide 37.5: 1) โดยใช้อุปกรณ์ Dcode (Bio- ราดริชมอนด์, CA, USA) เจลลาดเสียสภาพจาก 30% เป็น60% ได้รับการทำงานที่ 125 V และ 60? C เป็นเวลา 5.5 ชั่วโมง วงดนตรีที่มองเห็นภายใต้แสงยูวีแสงเป็นอีกครั้งที่การขยายการใช้ไพรเมอร์เหมือนเดิมโดยไม่ต้องประชาคมโลกยึด ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้วิธี PCR QIAquick

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เพราะนับจากเชื้อรา ยีสต์ และแบคทีเรียรวม 100 มล. เจือจางในสารละลาย น้ำเกลือ 0.85 % ทศนิยม
เป็นหมันถูกกระจายลงบน potatodextrose
( difco ) และการใช้แผ่นเสริม
เพนนิซิลลิน สเตรปโตมัยซิน ( sigmaealdrich เซนต์หลุยส์ โม , USA ) และ
Planetmath reference ( difco ) แผ่นกับร้อยเรียง ( ซิกม่า )
) ระยะเวลาดำเนินการ 25
C 3e5 วัน
รา29
องศาเซลเซียสเป็นเวลา 48 ชั่วโมง ยีสต์ และ 37
C 30 H สำหรับแบคทีเรียทั้งหมด .
แผ่นนับได้ทั้งสามใบ และผลจาก
แผ่น 30e300 อาณานิคมได้ถูกแสดงเป็น log CFU / ml
วิเคราะห์ดีเอ็นเอ 9 แถบบ่งชี้ , ดีเอ็นเอตรงแยกกระทำ
ตามที่อธิบายไว้โดยโรงงาน et al . ( 2002 ) สั้น ๆ , เซลล์เม็ด resuspended
ใน 400 ml ทำลายบัฟเฟอร์ [ 2 % Triton X-100 ,
1 % โซเดียมโดเดซิลซัลเฟตขนาด 100 มม. , 10 มม. นอกจากนี้ ( pH 8.0 ) 1 mM EDTA pH 8.0 ) ]
และ 400 มล. ของฟีนอล / ยาสลบ / แอลกอฮอล์ในปริมาณ ( 25:24:1 )
( Sigma ) 0.4 กรัม เม็ดซิลิกา 0.5-mm ลูกปัด ( biospec bartlesville
, , โอเค , USA ) ติดขัดใช้ fastprep-24 ผู้ชนะ
ลูกปัด ( ไบโอ 101 , Vista , CA , USA ) แล้วระยะที่น้ำบริสุทธิ์
ใช้ dneasy พืช Mini Kit ( QIAGEN , Valencia , CA , USA ) โดย
ขยายได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยทานากะ et al . ( 2012 ) .
สำหรับวิเคราะห์ความหลากหลายของแบคทีเรีย , V3 ภูมิภาคของ 16S rdnawas
ขยายโดยวิธี PCR โดยใช้ primers และแบคทีเรียสากล 357f-gc
517r ชิ้นส่วนของยีนแบคทีเรียเชื้อราที่ 26 D1 / D2 ภูมิภาค
ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ดีเอ็นเอ eukaryotic สากล nl1-gc และ
ls2 . การวิเคราะห์การทดลองแสดงใน 8 % ( w / v )
โพลีอะคริลาไมด์เจล( อะคริลาไมด์ : bisacrylamide 37.5:1 ) โดยใช้เครื่องมือ dcode ( ไบโอ -
ราด ริชมอนด์ แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา ) เป็นเจลี่ไล่ระดับจาก 30%
60% ใช้ 125 V 60
C 5.5 ชั่วโมง วงมองเห็นแสงยูวี
ถูกขยายโดยใช้ไพรเมอร์อีกเหมือนกัน โดย GC
ที่หนีบ ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดจะถูกใช้โดย qiaquick บริสุทธิ์