The avian influenza A virus (AIV) c

The avian influenza A virus (AIV) causes respiratory infections in animal species and evolve rapidly to adapt to new hosts via molecular changes caused by genetic variation (i.e., antigenic drifts like point mutations or antigenic shifts known as genetic reassortment) ( Medina and Garcia-Sastre, 2011 and Nelson and Holmes, 2007) and fast replication without proofreading activity (Ishihama et al., 1986). The AIV has eight single-stranded negative-sense RNA genomes encoding eight proteins: six internal proteins are composed of polymerase (PB1, PB2, PA), nucleoprotein (NP), matrix protein (M), and nonstructural protein (NS), and two external proteins named as the antigenic surface proteins are hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) ( Medina and Garcia-Sastre, 2011, Naffakh et al., 2008, Nelson and Holmes, 2007 and Ozawa and Kawaoka, 2013). Among them, HA and NA have been widely used in influenza subtype classification because of the diversity in the host immune response ( Naffakh et al., 2008, Nelson and Holmes, 2007 and Ozawa and Kawaoka, 2013). Up to this day, more than 100 AIV subtypes have been classified by the unique combinations of the different 16 HA and 9 NA types ( Medina and Garcia-Sastre, 2011 and Nelson and Holmes, 2007). However, four of the subtypes (e.g., H1N1, H1N2, H3N2, and H3N8) have been known to be widely distributed among humans, swine, canines, and equines all over the world ( Fouchier, 2003 and Ozawa and Kawaoka, 2013).

In general, the severity of an epidemic or pandemic outbreak of AIV is mainly determined by the new recombination of the eight segments through co-infections from different hosts or during interspecies transmission (Fouchier, 2003, Medina and Garcia-Sastre, 2011, Nelson and Holmes, 2007, Neumann et al., 2009, Ozawa and Kawaoka, 2013, Smith et al., 2009 and Tang et al., 2010). Given that reassortment occurs by continual shifts of the influenza genomic segments, novel influenza viruses are likely to be created not only from different subtypes but also from different groups of influenza viruses in the same subtypes circulating at any given time and place. Therefore, identifying a novel influenza is entirely dependent on sequencing its whole genome. Occasionally, however, it can be time-consuming, costly, and labor-intensive when sequencing many influenza viruses.

To date, various experimental methods to detect AIVs and identify the origin of reasserted viruses have been developed, including: restriction fragment length polymorphism (RFLP) (Sakamoto et al., 1996), heteroduplex mobility assays (HMA) (Berinstein et al., 2002 and Ellis and Zambon, 2001), single-strand conformation polymorphism (SSCP) (Lugovtsev et al., 2005), high resolution melting analysis (HRM) (Kalthoff et al., 2013, Lee et al., 2011 and Lin et al., 2008), reverse transcriptase-PCR (RT-PCR) (Chang et al., 2008 and Hoffmann et al., 2001), real-time RT-PCR (RRT-PCR) (Poon et al., 2010, Spackman et al., 2002 and Stone et al., 2004), oligonucleotide microarray hybridization (Sengupta et al., 2003), RT-PCR/electrospray ionization mass spectrometry (RT-PCR/ESI-MS) (Deyde et al., 2010 and Sampath et al., 2007), dual priming oligonucleotides (DPO) (Chun et al., 2007) and the recent pyrosequencing technique (Shcherbik et al., 2014). Among them, RT-PCR has been the preferred universal method for large-scale screening of AIVs, as it is a fast, convenient and relatively inexpensive molecular diagnostic approach. In particular, the DPO system composed of two separate priming regions – a 5′ conserved (18–25 nt) region and a 3′ specific (6–12 nt) region connected by a poly-deoxyinosine (I) stretch – shows especially high sensitivity in detecting SNPs (single nucleotide polymorphisms) (Chun et al., 2007). It is also advantageous when doing multiplex PCR due to its different functionalities formed by the bubble-like structure of the poly (I) linker, leading to differential annealing preferences (Chun et al., 2007). Thus, DPOs are widely used to monitor and diagnose viral infections (Chun et al., 2007, Chung et al., 2014, Kim et al., 2008, Kwon et al., 2014, Moon et al., 2010 and Woo et al., 2008).

Hence, we developed a highly sensitive and specific multiplex RT-PCR assay using DPO system for the effective detection of influenza viral segments as a rapid, cost-effective, and simple method. For the purpose, H3N8 equine influenza virus (EIV), which is dominantly circulating in horses since its first isolation in 1963 (Fouchier, 2003 and Ozawa and Kawaoka, 2013), was used as an example among other mammalian influenza viruses. To design EIV specific primers, specificity, coverage, and variation score of each primer, and host-specific amino acid residues were investigated, and then the primer performance were evaluated by multiplex RT-PCR with eight sets, which are composed of four different primer combinations of eight segments, using viral samples from various influenza hosts.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ไข้หวัดนกโดยไวรัส (AIV) ทำให้เกิดการติดเชื้อทางเดินหายใจในสัตว์ และพัฒนาอย่างรวดเร็วปรับเปลี่ยนโฮสต์ใหม่ผ่านการเปลี่ยนแปลงโมเลกุลที่เกิดจากความผันแปรทางพันธุกรรม (เช่น antigenic ลอยเช่นพันธุ์จุดหรือ antigenic กะเรียกว่าพันธุกรรม reassortment) (เมดินา และการ์เซีย-Sastre, 2011 และเนลสัน และโฮล์ มส์ 2007) และการจำลองแบบรวดเร็วโดยไม่ต้องพิสูจน์อักษรกิจกรรม (Ishihama et al. 1986) AIV มีแปดเดียวที่ควั่น RNA genomes รู้สึกลบรหัสแปดโปรตีน: โปรตีนภายในหกจะประกอบด้วยพอลิเมอเรส (PB1, PB2, PA), nucleoprotein (NP), โปรตีนเมทริกซ์ (M), และโปรตีน nonstructural (NS), และโปรตีนภายนอกสองชื่อเป็นโปรตีนผิว antigenic hemagglutinin (HA) และ neuraminidase (นา) (เมดินาและการ์เซีย-Sastre, 2011, Naffakh et al. 2008 เนลสันและโฮล์มส์ 2007 และวาและ Kawaoka , 2013) ในหมู่พวกเขา HA และ NA มีแพร่หลายในจำแนกชนิดย่อยของโรคไข้หวัดใหญ่เนื่องจากความหลากหลายในการตอบสนองภูมิคุ้มกันของโฮสต์ (Naffakh et al. 2008 เนลสัน และโฮล์ มส์ 2007 และวา และ Kawaoka, 2013) ขึ้นวันนี้ 100 AIV subtypes ถูกแบ่ง โดยเฉพาะชุดของ HA 16 แตกต่างกันและชนิดนา 9 (เมดินา และการ์เซีย-Sastre, 2011 และเนลสัน และโฮล์ มส์ 2007) อย่างไรก็ตาม สี่ subtypes (เช่น H1N1, H1N2, H3N2 และ H3N8) ได้รับทราบเพื่อเป็นกระจายอย่างกว้างขวางในหมู่มนุษย์ สุกร สุนัข และ equines ทั่วโลก (Fouchier, 2003 และวา และ Kawaoka, 2013)ทั่วไป ความรุนแรงของการระบาดระบาด หรือระบาดของ AIV ส่วนใหญ่กำหนด โดย recombination ใหม่ภาคแปดผ่านการติดเชื้อร่วม จากโฮสต์ที่แตกต่างกัน หรือใน ระหว่างการส่ง interspecies (Fouchier, 2003 เมดินาและการ์เซีย-Sastre, 2011 เนลสันและโฮล์มส์ 2007, Neumann et al. 2009 วาและ Kawaoka, 2013, Smith et al. 2009 และ Tang et al. 2010) ระบุว่าเกิด reassortment เวรต่อเนื่องภาคการไข้หวัดใหญ่ ไวรัสไข้หวัดใหญ่นวนิยายมีแนวโน้มที่จะสร้างไม่เพียง จาก subtypes ที่แตกต่างกัน แต่ จากกลุ่มของไวรัสไข้หวัดใหญ่ใน subtypes เดียวกันที่หมุนเวียนตลอดเวลาและสถานที่ ดังนั้น ระบุหวัดนวนิยายมีทั้งจัดลำดับพันธุของทั้งต้น บางครั้ง อย่างไรก็ตาม ได้ใช้ จ่าย และแรงงานมากเมื่อจัดลำดับไวรัสไข้หวัดใหญ่มากวัน วิธีการทดลองต่าง ๆ เพื่อตรวจหา AIVs และระบุมาของไวรัส reasserted ได้รับการพัฒนา รวมทั้ง: โพลิมอร์ฟิซึมส่วนข้อจำกัดความยาว (RFLP) (กาฮะเกสท์เฮาส์และ al. 1996), heteroduplex เคลื่อนไหว assays (HMA) (Berinstein et al. 2002 และเอลลิส และ Zambon, 2001), โพลิมอร์ฟิซึมโครงสร้างสาระเดียว (SSCP) (Lugovtsev et al. 2005), ความละเอียดสูงที่หลอมวิเคราะห์ (HRM) (Kalthoff et al. 2013, Lee et al , 2011 และ Lin et al. 2008), ปเท-PCR (RT-PCR) (ช้าง et al. 2008 และ Hoffmann et al. 2001), แบบเรียลไทม์ RT-PCR (RRT-PCR) (พูน et al. 2010, Spackman et al. 2002 และหิน et al. 2004), oligonucleotide microarray hybridization (Sengupta et al. 2003), RT-PCR/มิกส์ ไอออไนซ์รเมท (RT-PCR/ESI-MS) (Deyde et al. 2010 และแซมพาธ et al. 2007), คู่ปั๊ม oligonucleotides (DPO) (ชุน et al , 2007) และเทคนิค pyrosequencing ล่า (Shcherbik et al. 2014) ในหมู่พวกเขา RT-PCR ได้รับวิธีการสากลที่ต้องตรวจขนาดใหญ่ของ AIVs มันเป็นอย่างรวดเร็ว สะดวก และแพงโมเลกุลวินิจฉัยวิธีการ โดยเฉพาะ ระบบ DPO ประกอบด้วยของสองภูมิภาคแยกใบ –พื้นที่อนุรักษ์ 5′ (18-25 nt) และภูมิภาคเฉพาะ (6 – 12 nt) 3′ การเชื่อมต่อ โดยการยืดโพลี deoxyinosine (I) – แสดงความไวสูงในการตรวจหา SNPs (หลากหลายเดี่ยวเบื่อหน่าย) (ชุน et al. 2007) มันยังเป็นประโยชน์เมื่อทำมัลติเพล็กซ์ PCR เนื่องจากฟังก์ชันการทำงานที่แตกต่างเกิดขึ้นจากฟองเหมือนโครงสร้างของโพลี (I) เชื่อมโยงข้อมูล การนำการตั้งค่าหลอมต่าง (ชุน et al. 2007) ดังนั้น DPOs ใช้เพื่อตรวจสอบ และวินิจฉัยการติดเชื้อไวรัส (ชุน et al. 2007, Chung et al. 2014, Kim et al. 2008 ควัน et al. 2014 มูน et al. 2010 และ Woo et al. 2008)ดังนั้น เราสามารถพัฒนาเฉพาะเจาะจง และมีความสำคัญสูงมัลติเพล็กซ์ RT-PCR ทดสอบใช้ระบบ DPO สำหรับการตรวจจับมีประสิทธิภาพกลุ่มไวรัสไข้หวัดใหญ่อย่างรวดเร็ว คุ้มค่า และวิธีที่ง่าย H3N8 ม้าไข้หวัดใหญ่ไวรัส (EIV), ซึ่งมี dominantly การหมุนเวียนในม้าตั้งแต่แยกเป็นครั้งแรกในปี 1963 (Fouchier, 2003 และวา และ Kawaoka, 2013), ถูกใช้เป็นตัวอย่างระหว่างไวรัสไข้หวัดใหญ่κอื่น ๆ วัตถุประสงค์ การออกแบบไพรเมอร์เฉพาะ EIV ความ ครอบคลุม และการเปลี่ยนแปลงคะแนนรองพื้น และกรดอะมิโนเฉพาะสำหรับโฮสต์ที่มีการตรวจสอบสารตกค้าง และรองพื้นที่ ถูกประเมินประสิทธิภาพ โดยมัลติเพล็กซ์ RT-PCR กับชุดแปด ซึ่งประกอบด้วยชุดรองพื้นแตกต่างกันสี่ภาคแปด ใช้ตัวอย่างไวรัสจากโฮสต์ไข้หวัดต่าง ๆ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

โรคไข้หวัดนกไวรัส (AIV) ทำให้เกิดการติดเชื้อในระบบทางเดินหายใจในสัตว์และมีวิวัฒนาการอย่างรวดเร็วเพื่อปรับให้เข้ากับโฮสต์ใหม่ผ่านการเปลี่ยนแปลงโมเลกุลที่เกิดจากการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรม (เช่นกองแอนติเจนเช่นการกลายพันธุ์จุดหรือเปลี่ยนแปลงแอนติเจนที่รู้จักในฐานะ Reassortment ทางพันธุกรรม) (เมดินาและ Garcia- Sastre 2011 และเนลสันและโฮล์มส์, 2007) และการจำลองแบบรวดเร็วโดยไม่ต้องกิจกรรมพิสูจน์อักษร (Ishihama et al., 1986) AIV มีแปดเดียวควั่นลบความรู้สึกจีโนมอาร์เอ็นเอเข้ารหัสแปดโปรตีน: หกโปรตีนภายในจะประกอบด้วยโพลิเมอร์ (Pb1, PB2, PA) นิวคลีโอ (NP) โปรตีนเมทริกซ์ (M) และโปรตีน nonstructural (NS) และ สองโปรตีนภายนอกชื่อว่าเป็นโปรตีนแอนติเจนพื้นผิวจะ hemagglutinin (HA) และ neuraminidase (NA) (เมดินาการ์เซีย Sastre 2011 Naffakh et al., 2008 เนลสันและโฮล์มส์ปี 2007 และโอซาวะและ Kawaoka, 2013) ในหมู่พวกเขา HA และ NA ได้รับการใช้กันอย่างแพร่หลายในการจำแนกโรคไข้หวัดใหญ่ชนิดย่อยเพราะความหลากหลายในการตอบสนองภูมิคุ้มกัน (Naffakh et al., 2008 เนลสันและโฮล์มส์ปี 2007 และโอซาวะและ Kawaoka, 2013) ขึ้นไปในวันนี้กว่า 100 AIV ชนิดย่อยได้รับการจำแนกโดยรวมกันเป็นเอกลักษณ์ของที่แตกต่างกัน 16 ไร่และ 9 ชนิด NA (เมดินาการ์เซียซาสเตร, ปี 2011 และเนลสันและโฮล์มส์, 2007) แต่สี่ของชนิดย่อย (เช่น H1N1, H1N2, H3N2 และ H3N8) ได้รับทราบเพื่อจะกระจายอย่างกว้างขวางในหมู่มนุษย์สุกรสุนัขและ equines ทั่วทุกมุมโลก (Fouchier, 2003 และโอซาวะและ Kawaoka, 2013) โดยทั่วไปความรุนแรงของการแพร่ระบาดหรือโรคระบาดระบาดของ AIV จะถูกกำหนดโดยส่วนใหญ่รวมตัวกันใหม่ของแปดกลุ่มผ่านการติดเชื้อร่วมจากครอบครัวที่แตกต่างกันหรือในระหว่างการส่ง interspecies (Fouchier 2003 และเมดินาการ์เซีย Sastre 2011 เนลสันและ โฮล์มส์ 2007 Neumann et al., 2009 โอซาวะและ Kawaoka 2013 สมิ ธ et al., 2009 และ Tang et al., 2010) ระบุว่า Reassortment เกิดขึ้นจากการเปลี่ยนแปลงอย่างต่อเนื่องของไข้หวัดใหญ่กลุ่มจีโนมของไวรัสไข้หวัดใหญ่นวนิยายมีแนวโน้มที่จะถูกสร้างขึ้นไม่เพียง แต่จากเชื้อที่แตกต่างกัน แต่ยังมาจากกลุ่มที่แตกต่างกันของไวรัสไข้หวัดใหญ่ชนิดย่อยเดียวกันหมุนเวียนในเวลาที่กำหนดและสถานที่ ดังนั้นการระบุไข้หวัดใหญ่นวนิยายเรื่องทั้งหมดขึ้นอยู่กับลำดับทั้งจีโนมของมัน อย่างไรก็ตามในบางครั้งมันอาจจะใช้เวลานานค่าใช้จ่ายและแรงงานมากเมื่อ sequencing ไวรัสไข้หวัดใหญ่จำนวนมาก. ในวันที่การทดลองวิธีการต่าง ๆ ในการตรวจสอบ AIVs และระบุที่มาของไวรัสชุ่มฉ่ำได้รับการพัฒนารวมไปถึง: ข้อ จำกัด แตกต่างความยาวชิ้นส่วน ( RFLP) (Sakamoto et al., 1996), การวิเคราะห์การเคลื่อนไหว heteroduplex (HMA) (Berinstein et al., 2002 และเอลลิสและ Zambon, 2001), เดี่ยว Strand polymorphism โครงสร้าง (SSCP) (Lugovtsev et al., 2005) สูง การวิเคราะห์ความละเอียดละลาย (HRM) (Kalthoff et al., 2013 Lee et al., 2011 และหลิน et al., 2008), reverse transcriptase-PCR (RT-PCR) (ช้าง et al., 2008 และ Hoffmann, et al , 2001) แบบ real-time RT-PCR (RRT-PCR) (พูน et al., 2010 Spackman et al., 2002 และหิน et al., 2004) oligonucleotide microarray hybridization (กุป et al., 2003), RT-PCR / electrospray ไอออนไนซ์มวลสาร (RT-PCR / ESI-MS) (Deyde et al., 2010 และ Sampath et al., 2007) oligonucleotides รองพื้นคู่ ( อ.ส.ค. ) (จุน et al., 2007) และล่าสุด เทคนิค pyrosequencing (Shcherbik et al., 2014) ในหมู่พวกเขา RT-PCR ได้รับการแนะนำวิธีการสากลสำหรับการตรวจคัดกรองขนาดใหญ่ของ AIVs ขณะที่มันเป็นไปอย่างรวดเร็วสะดวกและราคาไม่แพงวิธีการวินิจฉัยโมเลกุล โดยเฉพาะอย่างยิ่งระบบ อ.ส.ค. ประกอบด้วยสองภูมิภาครองพื้นที่แยกต่างหาก - 5 'อนุรักษ์ (18-25 NT) ภูมิภาคและ 3' โดยเฉพาะ (6-12 NT) ภาคการเชื่อมต่อโดยโพลี deoxyinosine (I) ยืด - แสดงสูงโดยเฉพาะอย่างยิ่ง ความไวในการตรวจสอบ SNPs (หลากหลายเดี่ยวเบื่อหน่าย) (จุน et al., 2007) นอกจากนี้ยังเป็นข้อได้เปรียบเมื่อทำ multiplex PCR เนื่องจากฟังก์ชันการทำงานที่แตกต่างกันที่เกิดขึ้นจากโครงสร้างฟองเหมือนของโพลี (I) ลิงเกอร์ที่นำไปสู่การตั้งค่าความแตกต่างหลอม (จุน et al., 2007) ดังนั้น DPOs ใช้กันอย่างแพร่หลายในการตรวจสอบและวินิจฉัยการติดเชื้อไวรัส (จุน et al., 2007 Chung et al., 2014 คิม et al., 2008 เทควันโด et al., 2014 ดวงจันทร์ et al., 2010 และวู et al., 2008). ดังนั้นเราจึงพัฒนาความไวสูงและเฉพาะเจาะจง multiplex RT-PCR ทดสอบการใช้ระบบ อ.ส.ค. สำหรับการตรวจสอบที่มีประสิทธิภาพของกลุ่มไข้หวัดใหญ่ไวรัสอย่างรวดเร็วเป็นค่าใช้จ่ายที่มีประสิทธิภาพและวิธีการที่ง่าย เพื่อวัตถุประสงค์ H3N8 เชื้อไวรัสไข้หวัดใหญ่ม้า (EIV) ซึ่งครอบครองหมุนเวียนในม้าตั้งแต่แยกเป็นครั้งแรกในปี 1963 (Fouchier, 2003 และโอซาวะและ Kawaoka 2013) ถูกนำมาใช้เป็นตัวอย่างในหมู่ไวรัสไข้หวัดใหญ่อื่น ๆ ที่เลี้ยงลูกด้วยนม การออกแบบ EIV ไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงจำเพาะคุ้มครองและให้คะแนนการเปลี่ยนแปลงของแต่ละไพรเมอร์และโฮสต์เฉพาะกรดอะมิโนที่ได้รับการตรวจสอบแล้วประสิทธิภาพการทำงานของไพรเมอร์ได้รับการประเมินโดย multiplex RT-PCR กับแปดชุดซึ่งจะประกอบด้วยสี่ไพรเมอร์ที่แตกต่างกัน การรวมกันของแปดกลุ่มโดยใช้ตัวอย่างไวรัสไข้หวัดใหญ่จากครอบครัวต่างๆ