2.4. Mineral analysisMinerals of ri

2.4. Mineral analysis

Minerals of rice seed were analyzed by Atomic Absorption Spectroscopy (AAS) using a modified method of Jiang, Wu, Feng, Yang, and Shi (2007). About 2.0 g of brown seed was taken in a crucible and ignited in a muffle furnace at 550–600 °C for 10 h. The ash of the rice sample was dissolved in 0.2 N HCl and filtered through whatman-42 filter paper. The filtrate was used for AAS analysis with respective hollow-cathode lamp (HCl).

2.5. Vitamin and anti-nutrient factor estimation

The niacin and thiamine content of rice seed were estimated by a spectrofluorometric method (Sadasivam & Manikam, 1991). Phytic acid was extracted with 2.4% HCl and estimated by spectrophotometer (Bhandari & Kawabata, 2006).

2.6. Two-dimension polyacrylamide gel electrophoresis (2-DE)

Total protein was isolated from rice seed (2.0 g) by phenol extraction method with some modification (Paul, Gayen, Datta, & Datta, 2015). The dehusked rice seeds were ground to a fine powder with liquid nitrogen using chilled mortar and pestle. The seed powder was suspended with 10.0 ml extraction buffer containing 0.5 M Tris–HCl (pH-7.5), 30% sucrose, 50 mM Na-EDTA, 2% SDS, 2% β-ME, 2% PVP and 2% PMSF, 2% DTT in 50 ml tube. The equal volume of Tris saturated phenol (pH-8.0) was added and incubated at 4 °C for 30 min, followed by centrifugation at 5000g for 30 min. After collecting the aqueous phase, equal volume of extraction buffer was added and incubated for 30 min at 4 °C. The upper aqueous phase was recollected by centrifugation and five volume of methanol containing 0.1 M ammonium acetate was added. The tube was stored at −20 °C for overnight. The isolated protein was precipitated by centrifugation at 5000g for 30 min and protein pellet was washed with cold methanol and acetone. The protein was air dried in laminar flow and resuspended in 2-DE sample buffer consisting of 7 M urea, 2 M thiourea, 4% (w/v) CHAPS, 20 mM DTT and 1% (v/v) Bio-Lyte pH 3-10 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) and protein concentration was measured by the Bradford method (Bradford, 1976). The protein (700 μg) was diluted to a final volume of 300 μl and loaded into immobilized pH gradient (IPG) strip holder containing 17 cm strips, pH gradient 4–7 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Isoelectric focusing (IEF) was carried out with the IEF Cell (Bio-Rad, USA) using following condition: 250 V linear for 30 min, 10,000 V linear for 4 h, 10,000 V for 43,000 Vh, 1000 V for 5 min. The strips were equilibrated twice in equilibration buffer I and equilibrium buffer II (Bio-Rad, USA) respectively, for 15 min each. The 2DE was carried out in 12% SDS–PAGE using PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad, USA). After electrophoresis, protein spots were stained by colloidal Coomassie Brilliant blue R 350 solutions and the gel was scanned by Calibrated Imaging Densitometer (Bio-Rad, GS-800).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4. แร่วิเคราะห์แร่ธาตุของเมล็ดข้าวถูกวิเคราะห์โดยอะตอมดูดซึมสเปกโทรสโก (AAS) โดยใช้วิธีการแก้ไขของเจียง Wu ฮ ยาง และ Shi (2007) ประมาณ 2.0 กรัมเมล็ดสีน้ำตาลถ่ายในเบ้าหลอมตัว และติดไฟในเตาไฟอุด 550-600 ° c สำหรับ 10 ชม แอชของตัวอย่างข้าวละลายใน 0.2 N HCl และถูกกรองผ่านกระดาษกรอง whatman-42 การกรองใช้สำหรับ AAS วิเคราะห์ ด้วยโคมไฟกลวงแคโทดตามลำดับ (HCl)2.5. วิตามินและสารอาหารที่ต่อต้านปัจจัยการประเมินไนอะซินและไทอามีนที่เนื้อหาของเมล็ดข้าวที่ถูกประเมิน โดยวิธีการ spectrofluorometric (Sadasivam & Manikam, 1991) กรดไฟติกถูกสกัด ด้วย 2.4% HCl และประมาณ โดยสเปค (บันดารี & คาวาบาตะ 2006)2.6 ขนาดสองตรวจสอบวิเคราะห์อิ (2-DE)โปรตีนทั้งหมดถูกแยกออกจากเมล็ดข้าว (2.0 g) โดยวิธีการสกัดฟีนอมีปรับเปลี่ยนบางอย่าง (พอล Gayen, Datta และ Datta, 2015) เมล็ดข้าว dehusked ถูกพื้นดินผงกับไนโตรเจนเหลวที่ใช้แช่เย็นครกและสาก ผงเมล็ดถูกระงับ ด้วย 10.0 ml สกัดบัฟเฟอร์ที่มี 0.5 M ทริสเรทติ้ง – HCl (pH 7.5), 30% น้ำตาลซูโครส 50 มม.นา-EDTA, 2% SDS β-ME 2%, 2% PVP และ 2% PMSF, 2% DTT ในหลอด 50 ml ระดับเสียงเท่าของทริสเรทติ้งอิ่มตัว (pH 8.0) ถูกเพิ่ม และรับการกกที่ 4 ° C เป็นเวลา 30 นาที ตาม ด้วยหมุนเหวี่ยงที่ 5000 กรัมสำหรับ 30 นาที หลังจากสะสมเฟสอ ปริมาณเท่าของบัฟเฟอร์สกัดเพิ่ม และรับการกก 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส บนเฟสอถูกจัด โดยหมุนเหวี่ยง และเพิ่มห้าปริมาตรของเมทานอลที่ประกอบด้วยแอมโมเนีย 0.1 M อะซิเตท หลอดถูกเก็บไว้ที่ −20 ° C สำหรับหลาย มีการตกตะกอนโปรตีนแยก โดยการหมุนเหวี่ยงที่ 5000 กรัม 30 นาที และเม็ดโปรตีนถูกล้าง ด้วยอะซิโตนและเมทานอลเย็น โปรตีนถูกอากาศแห้งในนาร์ และ resuspended ในตัวอย่าง 2-DE บัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วยยูเรีย 7 M, 2 M thiourea, CHAPS 4% (w/v) 20 มม. DTT และ 1% (v/v) ไบโอ-Lyte pH 3-10 (Bio-ล้อ เฮอร์คิวลิส CA, USA) และความเข้มข้นของโปรตีนโดยวัดจากวิธีแบรดฟอร์ด (แบรดฟอร์ด 1976) โปรตีน (700 μ) ถูกเจือจางให้มีปริมาตรสุดท้ายของ 300 μl และโหลดลงใน pH ถูกตรึงกับที่ไล่ระดับสี (IPG) แถบยึดที่ประกอบด้วยแถบ 17 ซม. pH ไล่ระดับ 4 – 7 (Bio-ล้อ เฮอร์คิวลิส CA, USA) Isoelectric โฟกัส (IEF) ดำเนินการ ด้วย IEF เซลล์ (Bio-ล้อ สหรัฐอเมริกา) ใช้ต่อไปนี้เงื่อนไข: 250 V เส้น 30 นาที 10,000 V สำหรับ 43,000 Vh, 10,000 เชิงเส้นสำหรับ 4 h V, 1000 V 5 นาที แถบที่ equilibrated ในบัฟเฟอร์ equilibration ผมและสมดุลบัฟเฟอร์ II (Bio-ล้อ สหรัฐอเมริกา) ตามลำดับ 15 นาที 2DE ที่ดำเนินการใน 12% SDS – หน้าใช้ PROTEAN Tetra เซลล์ (Bio-ล้อ สหรัฐอเมริกา) หลังจากอิ โปรตีนจุดภาพ โดย colloidal Coomassie สดใสสีฟ้า R 350 โซลูชัน และเจถูกสแกน โดย Densitometer ภาพปรับเทียบ (Bio-ล้อ GS-800)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4 การวิเคราะห์แร่

แร่ของเมล็ดข้าวที่ได้มาวิเคราะห์โดยการดูดซึมกสเปก (AAS) โดยใช้วิธีการแก้ไขของเจียงวูฮยางและชิ (2007) เกี่ยวกับ 2.0 กรัมเมล็ดสีน้ำตาลได้รับการดำเนินการในเบ้าหลอมและจุดประกายในเตาเผาที่ 550-600 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 ชั่วโมง เถ้าของตัวอย่างข้าวถูกละลายใน 0.2 N HCl และกรองผ่านกระดาษ Whatman-42 ตัวกรอง กรองถูกนำมาใช้สำหรับการวิเคราะห์ AAS กับแต่ละหลอดกลวงแคโทด (HCl).

2.5 การประมาณค่าวิตามินและสารอาหารที่ต่อต้านปัจจัย

ไนอาซินวิตามินบีและเนื้อหาของเมล็ดพันธุ์ข้าวประมาณโดยวิธี spectrofluorometric (Sadasivam & Manikam, 1991) กรดไฟติกถูกสกัดด้วย 2.4% HCl และประมาณการโดย spectrophotometer (บันดารี & Kawabata, 2006).

2.6 สองมิติ polyacrylamide gel electrophoresis (2-de)

โปรตีนทั้งหมดถูกแยกออกจากเมล็ดข้าว (2.0 กรัม) โดยวิธีการสกัดฟีนอลที่มีการปรับเปลี่ยนบางอย่าง (พอล, Gayen, Datta & Datta, 2015) เมล็ดข้าว dehusked มาบดให้เป็นผงละเอียดด้วยไนโตรเจนเหลวโดยใช้ครกและสากแช่เย็น ผงเมล็ดถูกระงับด้วย 10.0 มล. บัฟเฟอร์สกัดที่มี 0.5 M Tris-HCl (pH 7.5) 30% ซูโครสขนาด 50 มมนา EDTA, 2% SDS, 2% β-ME, 2% PVP และ 2% PMSF, 2% DTT ในหลอด 50 มล. ปริมาณที่เท่ากันของทริสอิ่มตัวฟีนอล (พีเอช 8.0) คือการเพิ่มและการบ่มที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาทีตามด้วยการหมุนเหวี่ยงที่ 5000G เป็นเวลา 30 นาที หลังจากที่เก็บรวบรวมเฟสน้ำปริมาณที่เท่ากันของบัฟเฟอร์สกัดถูกบันทึกและบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่ 4 ° C เฟสน้ำบนถูกลืมโดยการหมุนเหวี่ยงและห้าปริมาณเมทานอลที่มี 0.1 M แอมโมเนียมอะซิเตทถูกเพิ่มเข้ามา หลอดเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสเป็นเวลาชั่วข้ามคืน โปรตีนบางแห่งได้รับการตกตะกอนโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 5000G เป็นเวลา 30 นาทีและโปรตีนเม็ดถูกล้างด้วยเมทานอลและอะซีโตนเย็น โปรตีนที่ได้รับอากาศแห้งในการไหลแบบราบเรียบและ resuspended ในบัฟเฟอร์ตัวอย่าง 2-de ประกอบด้วย 7 มยูเรีย 2 M thiourea, 4% (w / v) CHAPS, 20 มิลลิเมตร DTT และ 1% (v / v) Bio-เต้พีเอช 3-10 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) และโปรตีนเข้มข้นวัดโดยวิธีแบรดฟ (แบรด, 1976) โปรตีน (700 ไมโครกรัม) ถูกเจือจางปริมาณสุดท้ายของ 300 ไมโครลิตรและโหลดลงในตัวยึดตรึงค่า pH ลาด (IPG) มีแถบ 17 ซมแถบลาดค่า pH 4-7 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) Isoelectric มุ่งเน้น (IEF) ได้ดำเนินการกับ IEF มือถือ (Bio-Rad, สหรัฐอเมริกา) โดยใช้เงื่อนไขต่อไปนี้: 250 V เชิงเส้นสำหรับ 30 นาที 10,000 V เชิงเส้นสำหรับ 4 ชั่วโมง 10,000 V for 43,000 Vh, 1000 V เป็นเวลา 5 นาที แถบถูก equilibrated สองครั้งในการปรับสมดุลบัฟเฟอร์ I และ II สมดุลบัฟเฟอร์ (Bio-Rad, สหรัฐอเมริกา) ตามลำดับสำหรับ 15 นาทีในแต่ละ 2DE ได้ดำเนินการใน 12% SDS-PAGE ใช้ Protean Tetra มือถือ (Bio-Rad, สหรัฐอเมริกา) หลังจาก electrophoresis จุดโปรตีนมีการย้อมโดยคอลลอยด์ Coomassie สีฟ้าสดใส R 350 โซลูชั่นและเจลได้รับการสแกนโดยสอบเทียบการถ่ายภาพ Densitometer (Bio-Rad, GS-800)