1. IntroductionSalmonella is a memb

1. Introduction

Salmonella is a member of the Enterobacteriaceae family, a
large group of Gram-negative, non-spore-forming bacilli and
facultative anaerobes [1]. Salmonella enterica (S. enterica)
causes nearly 99% of Salmonella infections in animals and
humans [2]. The S. enterica includes about 2600 diverse
serotypes which consist of two species, Salmonella bongori
and S. enterica and are divided into six subspecies: salamae,
enterica, diarizonae, arizonae, indica and houtenae [1].
S. enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) is a widely
distributed food-borne pathogen and one of the most popular
causes of bacterial food-borne disease in humans and animals
and deaths globally [3,4]. Salmonellosis is considered one of the
most significant food-borne zoonoses that is viewed in two kinds
of different diseases, enteric fever which can be typhoid or
paratyphoid and gastroenteritis which is non-typhoidal [5,6].
Bacterial pathogen in human causes 21 million cases of
typhoid fever and 200000 deaths per year, mainly in Southern
Asia, Africa and South America [7]. The discovery of a new
vaccine for salmonellosis is a challenge for the scientists.
Several vaccines have undergone clinical tests. The need of an
efficacious vaccine against salmonellosis providing strong
humoral as well as cellular immunity still persists [8].
S. enterica serovars have been classified based on reactivity of
antigen to somatic lipopolysaccharide, flagellar and capsular
antigens. From a clinical aspect, these may be broadly
grouped on the basis of host range and disease representation
[9]. The Salmonella pathogenicity islands (SPIs) 1 and 2 are
two important virulence determinants of S. enterica. They
encode type III secretion systems (T3SS), which carry the
effector proteins and enable the injection of effector proteins
directly into the cytosol of eukaryotic cells. These effectors
finally manipulate the cellular functions of the infected host
and comfort the development of the infection [10]. At present,
21 SPIs have been recognized in Salmonella. Many of the
identified SPI-encoded genes have only putative functions
with no obvious role in Salmonella pathogenesis.

The SPI-1 locus is a 40 kb chromosomal island, which carries
among all the others genes needed for the biosynthesis of a
functional T3SS, a number of some effector and regulatory
proteins and their chaperones [1]. The T3SS allows the secreted
proteins to pass through the bacterial outer and inner membranes
and a translocon creates a pore in the host cell membrane [11].
Location and function of these proteins in this system are
shown below. Inner membrane proteins: InvA, SpaP, Q, R, S;
associated inner membrane proteins: InvA, E; outer membrane
proteins: InvG, PrgK, PrgH; chaperone: SicA; putative
chaperone: InvI; secreted proteins involved in secretion: InvJ,
SpaO; secreted proteins with an effector function (target
proteins): SipA, SipB, Salmonella invasion protein C (SipC),
SipD, SptP [12].

Invasion is initiated by pathogen binding to the host cell
surface [13]. After invasion and entering the lumen of the small
intestine, environmental conditions enable T3SS-1 genes to be
expressed and subsequently the secretion system to be assembled
at the bacterial membrane [14]. Cell entry is determined by
rearrangements of the actin cytoskeleton, which is partly
interceded by SipC, a component of the bacterial translocon, at
the place of bacteria–host-cell contact [1]. SipC includes two
membrane-spanning areas with C- and N-terminal domains
front of the host-cell cytoplasm. This topological assembly of this
effector protein is a reason to the actin nucleation and the translocation
processes. Remarkably, both of these processes are primarily
dependent on the C-terminus of SipC. SipC can localize
actin polymerization at bacterial attachment site and employ actin
directly [15]. Kanamycin is inactivated with the aminophosphotransferases
by transferring the g-phosphate to the OH
group in the 30 position of the pseudosaccharide. The kan gene
was cloned and transformed in Escherichia coli (E. coli) cells [16].

The purpose of this study was to generate a plasmid that
carries kanamycin resistance gene replacement of S. typhimurium
native sipC gene with Up-Kan-Down fragment, using homologous
recombination technique.


2. Materials and methods

2.1. Bacterial complex, plasmids construction and
media

In this study, the protocol and informed consent forms were
approved by the Islamic Azad University, Shahrekord Branch,
Shahrekord, Iran with 17621105 grant number. Virulent S.
Typhimurium (ATCC-13311) collected from Microbiology
Laboratory of Islamic Azad University of Shahrekord Branch
was preserved as frozen glycerol stocks and cultured into Luria-
Bertani (LB) broth until the log growth phase (optical density
600 = 0.9) was reached. The kan gene was isolated from the
pET-28 vector. For cloning, preservation of DNA fragment and
subcloning, pGEM T-easy vector using TA cloning kit (Promega,
U.S) and pET-32 vector with E. coli strain TOP10F0 were
used, respectively. Bacterial cultures were grown at 37 C in LB
broth and LB agar plates.

2.2. Extraction of genomic DNA from S. typhimurium
DNA was isolated from colonies of bacteria using DNA
extraction kit (DNP™ Kit, CinnaGen, Iran) according to the
manufacturer's protocol. The quality of DNA was checked on 1%
agarose gel electrophoresis and quantified by spectrophotometric
mensuration at 260 nm, according to Sambrook and Russell [17].

2.3. Amplification of flanking regions of sipC gene and
kan gene

Oligonucleotide primers were designed for amplification of
flanking regions of sipC gene of S. typhimurium. The sequences
of these primers were up-sipC-F: 50-ATGTCTAGA
CCCTAAATAAAGTGGCG-30 and up-sipC-R: 50 ATTAG
ATCTCTCCCTTTATTTGGCAG-30 (accession number:
CP008928.1) containing Xba I and Bgl II restriction sites and
down-sipC-F: 50-ATTGAGCTCTGACCACTGAAAGCCAC-30
and down-sipC-R: 50-ACACTCGAGTAATACCCAGACTT
TCCG-30 (accession number: CP007360.1) containing Sac I and
Xho I restriction sites. Primers were used for amplification of up
and down region of sipC gene, respectively. Moreover, kan-F:
50-ATAAGATCTATGAGCCATATTCAGCGTG-30 and kan-
R: 50-ATAGAGCTCTTAGAAAAATTCATCCAG-30 primers
containing Bgl II and Sac I restriction sites were designed for
amplification of kan gene and pET-28 vector was used as template.
Underlined sequences indicate restriction sites.

Three collections of PCR programs were performed singly
in high volume for amplification of kan gene and up and
down regions of sipC gene. PCR amplification programs
were carried out in a total volumes of 25 mL in 0.2 mL tubes
containing 1 mL of template DNA, 1 mmol/L of each primer,
2.5 mmol/L of 10× PCR buffer, 2 mmol/L MgCl2, 200 mmol/
L deoxy-ribonucleoside triphosphate and 1 unit of Taq DNA
polymerase (Fermentas, Germany). For the optimal amplification
of flanking regions of sipC gene and kan gene, an
initial denaturation step was performed at 95 C for 5 min,
then amplified for 32 cycles of denaturation at 94 C for
1 min, annealing at 62 C for 1 min and extension at 72 C
for 1 min. Lastly, a final extension phase was programmed
for 5 min at 72 C and amplified samples were held at
10 C.


2.4. Analysis of PCR products
The amplified products (10 mL) were analysed by electrophoresis
in 1% agarose gel in tetrabromoethane [tris-base
10.8 g 89 mmol/L, boric acid 5.5 g 2 mmol/L, ethylene
diamine tetraacetic acid 4 mL of 0.5 mol/L ethylene diamine
tetraacetic acid (pH 8.0) buffer]. Constant voltage of 80 V was
used for products differentiation. The 100 bp DNA ladder
(Fermentas, Germany) was used as a molecular weight marker.
After electrophoresis, the gel was stained with ethidium bromide
and images were taken in UVIdoc gel documentation
systems (UK).

2.5. Cloning of sipC gene and plasmid construction
The PCR products were purified using gel extraction kit
(Bioneer, Korea) according to manufacture's protocol. All PCR
products were cloned into pGEM T-easy vector and the recombinant
vectors were transformed by heat shock at 42 C and
calcium chloride method into E. coli TOP10F0 competent cells
in LB culture media (Merck, Germany). Kanamycin resistance
was used for the selection. The presence of flanking regions of
sipC gene and kan gene was confirmed by restriction endonucleases
analysis.

2.6. Subcloning of the sipC and kan genes
The up-sipC fragment was removed from the pGEM Teasy
vector by Xba I-Bgl II double digestion and subcloned in
Xba I-Bgl II linearized pET-32 to get pET-32-sipC up. Then,
kan fragment was released from the pGEM T-easy vector by
Bgl II-Sac I double digestion and subcloned into Bgl II-Sac I
linearized pET-32-sipC up producing pET-32-sipC up-kan.
Finally, pGEM-sipC down double digested with Sac I-Xho I
and down fragment of sipC was subcloned into Sac I-Xho I
linearized pET-32-sipC up-kan to produce pET-32-sipC upkan-
sipC down recombinant vector. Competent cells of
E. coli TOP10F0 strain were transformed with pET-32-sipC
up-kan-sipC down recombinant vector. Flanking regions of
sipC gene and kan gene containing restriction point of Xba I,
Bgl II, Sac I and Xho I were inserted in polyclonal site in
pET-32. E. coli TOP10F0 strain competent cells were used for
transformation and cultured in LB agar media containing
ampicillin. The final construct was confirmed by double
digestion by Xba I-Xho I and by PCR using up-sipC-F and
down-sipC-R primers.

3. Results
DNA was successfully extracted and PCR amplified products
for flanking regions of sipC and kan genes on 1% agarose gel
revealed 320 bp, 206 bp and 835 bp fragments, respectively
(Figure 1).

In the next step, the up and down regions of sipC gene of S.
typhimurium and kan gene were cloned with TA cloning technique
in pGEM T-easy vector successfully, separately
(Figure 2).

Plasmid purification and Xba I, Bgl II, Sac I and Xho I restriction
endonuclease digestion of pET-32-sipC up-kan-sipC
down recombinant plasmid confirmed the

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

1. บทนำสายเป็นสมาชิกของครอบครัว Enterobacteriaceae การกลุ่มใหญ่ไม่ใช่สปอร์รูป แบคทีเรียแกรมลบ bacilli และfacultative anaerobes [1] สาย enterica (S. enterica)ทำให้เกือบ 99% ของการติดเชื้อซัลในสัตว์ และมนุษย์ [2] S. enterica มีประมาณ 2600 มีความหลากหลายserotypes ซึ่งประกอบด้วยสองชนิด ซัล bongoriและ S. enterica และจะแบ่งออกเป็นชนิดย่อยที่ 6: salamaeenterica, diarizonae, arizonae, indica และ houtenae [1]S. enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) เป็นแพร่หลายแจกจ่ายอาหารโดยเชื่อว่าการศึกษาหนึ่งนิยมมากที่สุดสาเหตุของโรคเชื่อว่าอาหารแบคทีเรียในมนุษย์และสัตว์และเสียชีวิตทั่วโลก [3, 4] Salmonellosis ถือเป็นหนึ่งในที่สำคัญเชื่อว่าอาหาร zoonoses ที่ดูในสองประเภทโรคต่าง ๆ enteric ไข้ซึ่งอาจเป็นรากสาด หรือparatyphoid และโรคกระเพาะอักเสบที่ไม่ใช่ typhoidal [5,6]การศึกษาแบคทีเรียในมนุษย์ทำให้ 21 ล้านไข้รากสาดน้อยและเสียชีวิต 200000 ต่อปี ส่วนใหญ่ในภาคใต้เอเชีย แอฟริกา และอเมริกาใต้ [7] การค้นพบของใหม่วัคซีนสำหรับ salmonellosis เป็นความท้าทายสำหรับนักวิทยาศาสตร์ที่รู้หลายมีระดับการทดสอบทางคลินิก จำเป็นต้องมีบ็อชวัคซีนต่อต้าน salmonellosis ให้แข็งแกร่งhumoral เป็นเซลล์ภูมิคุ้มกันยังคงยังคงอยู่ [8]S. enterica serovars ได้ถูกจัดประเภทตามการเกิดปฏิกิริยาของตรวจหาการ somatic lipopolysaccharide, flagellar และ capsularantigens จากลักษณะทางคลินิก เหล่านี้อาจได้อย่างกว้างขวางจัดกลุ่มตามโฮสต์แสดงช่วงและโรค[9] ระดับ pathogenicity เกาะ (SPIs) 1 และ 2ดีเทอร์มิแนนต์ virulence สำคัญสองของ S. enterica พวกเขาเข้ารหัสชนิด III หลั่งระบบ (T3SS), ซึ่งดำเนินการโปรตีน effector และเปิดใช้งานการฉีดโปรตีน effectorเข้าไปในไซโตซอล eukaryotic เซลล์ เบสเหล่านี้สุดท้าย จัดการฟังก์ชันโทรศัพท์มือถือของโฮสต์ติดเชื้อและความสะดวกสบายของการติดเชื้อ [10] ในปัจจุบัน21 SPIs ได้รับในระดับ จำนวนมากยีนที่เข้ารหัส SPI ระบุมีเฉพาะ putative ฟังก์ชันมีบทบาทไม่ชัดเจนในสายพยาธิกำเนิดโลกัสโพล SPI 1 เป็น 40 kb ของโครโมโซมเกาะ ซึ่งดำเนินอื่น ๆ ระหว่าง ยีนที่จำเป็นสำหรับการสังเคราะห์ของการT3SS ทำงาน จำนวน effector บาง และกำกับดูแลโปรตีนและ chaperones ของพวกเขา [1] T3SS ช่วยให้ที่ secretedโปรตีนผ่านแบคทีเรียภายนอก และภายในสารและ translocon การสร้างความรูในเยื่อหุ้มเซลล์ของโฮสต์ [11]ตำแหน่งและหน้าที่ของโปรตีนเหล่านี้ในระบบนี้แสดงด้านล่างนี้ ภายในเมมเบรนโปรตีน: InvA, SpaP, Q, R, Sเชื่อมโยงภายในเมมเบรนโปรตีน: InvA, E เยื่อหุ้มภายนอกโปรตีน: InvG, PrgK, PrgH chaperone: SicA putativechaperone: InvI secreted เกี่ยวข้องกับการหลั่งโปรตีน: InvJSpaO โปรตีน secreted พร้อมฟังก์ชั่น effector (เป้าหมายโปรตีน): SipA, SipB สายบุกรุกโปรตีนซี (SipC),SipD, SptP [12]การรุกรานเริ่มต้น โดยการศึกษารวมไปถึงเซลล์โฮสต์พื้นผิว [13] หลังจากการบุกรุกและป้อน lumen ของขนาดเล็กลำไส้ T3SS-1 ยีนจะช่วยให้สภาพแวดล้อมแสดง และต่อมาระบบหลั่งเพื่อจะรวบรวมที่เยื่อหุ้มตัวแบคทีเรีย [14] ป้อนข้อมูลในเซลล์จะถูกกำหนดโดยrearrangements ของ cytoskeleton แอกติน ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งinterceded โดย SipC ส่วนประกอบของ translocon แบคทีเรีย ที่เซลล์แบคทีเรีย – โฮสต์ติดต่อ [1] SipC มีสองพื้นที่ที่เมมเบรนซึ่งประกอบไป ด้วย C - และ N-เทอร์มินัลโดเมนหน้าของไซโทพลาซึมเซลล์โฮสต์ แอสเซมบลีนี้ topological ของนี้โปรตีน effector เป็นเหตุผล nucleation แอกตินและการสับเปลี่ยนที่กระบวนการทาง อย่างยิ่ง ทั้งในกระบวนการเหล่านี้เป็นหลักขึ้นอยู่กับ C-นัสของ SipC SipC สามารถแปลแอกติน polymerization ที่แนบแบคทีเรียไซต์ และจ้างแอกตินโดยตรง [15] กานามัยซินถูกยกเลิก ด้วยการ aminophosphotransferasesโดยโอนย้ายฟอสเฟต g ไป OHกลุ่มใน pseudosaccharide ที่ตำแหน่ง 30 ยีนกันโคลน และแปลง Escherichia coli (E. coli) เซลล์ [16]วัตถุประสงค์ของการศึกษานี้คือการ สร้าง plasmid ที่ดำเนินการแทนยีนต้านทานกานามัยซิน S. typhimuriumเจ้า sipC ยีน มีส่วนขึ้น-กาฬลง ใช้ homologousrecombination เทคนิค2. วัสดุและวิธีการ2.1. แบคทีเรียซับซ้อน plasmids ก่อสร้าง และสื่อในการศึกษานี้ แบบโพรโทคอลและแจ้งความยินยอมได้ได้รับอนุมัติจากมหาวิทยาลัย Azad อิสลาม Shahrekord สาขาShahrekord อิหร่านมีเงินช่วยเหลือ 17621105 Virulent S.Typhimurium (ATCC-13311) รวบรวมจากจุลชีววิทยาห้องปฏิบัติการมหาวิทยาลัยอิสลามออนไลน์ของ Shahrekord สาขาถูกเก็บรักษาไว้ เป็นกลีเซอรแช่แข็งหุ้น และอ่างเป็น Luria-ซุป Bertani (ปอนด์) จนถึงขั้นตอนการเจริญเติบโตบันทึก (แสงความหนาแน่น600 = 0.9) ถึง ยีนกาฬถูกแยกต่างหากจากการสัตว์เลี้ยง-28 เวกเตอร์ สำหรับการโคลน อนุรักษ์ของดีเอ็นเอแยกส่วน และsubcloning, pGEM เวกเตอร์ T ง่ายใช้ TA โคลนชุด (Promegaอเมริกา) และเวกเตอร์ pET-32 ด้วยต้องใช้ E. coli ถูก TOP10F0ใช้ ตามลำดับ วัฒนธรรมจากแบคทีเรียได้เติบโตที่ 37 C ปอนด์ซุปและแผ่น agar ปอนด์2.2 การสกัดของ genomic DNA จาก S. typhimuriumดีเอ็นเอถูกแยกจากอาณานิคมของแบคทีเรียโดยใช้ดีเอ็นเอชุดสกัด (DNP ™ชุด CinnaGen อิหร่าน) ตามโพรโทคอลของผู้ผลิต มีการตรวจสอบคุณภาพของดีเอ็นเอบน 1%agarose เจ electrophoresis และ quantified โดย spectrophotometricmensuration ที่ 260 nm ตาม Sambrook และรัสเซลล์ [17]2.3 การขยายของ flanking แคว้น sipC ยีน และยีนกันไพรเมอร์ oligonucleotide ถูกออกแบบสำหรับขยายของflanking แคว้น sipC ยีนของ S. typhimurium ลำดับที่ไพรเมอร์เหล่านี้มีค่า sipC F: 50-ATGTCTAGACCCTAAATAAAGTGGCG-30 และค่า-sipC-R: 50 ATTAGATCTCTCCCTTTATTTGGCAG 30 (เลขทะเบียน:CP008928.1) Xba ที่มีฉันและไซต์จำกัด Bgl II และลง-sipC-F: 50-ATTGAGCTCTGACCACTGAAAGCCAC-30และลง sipC R: 50-ACACTCGAGTAATACCCAGACTTTCCG 30 (เลขทะเบียน: CP007360.1) ประกอบด้วย Sac ฉัน และXho ฉันไซต์จำกัด ใช้ไพรเมอร์สำหรับการขยายของค่าและ ลงของยีน sipC ตามลำดับ นอกจากนี้ กาญจน์-F:50-ATAAGATCTATGAGCCATATTCAGCGTG-30 และกาฬ-R: ไพรเมอร์ 50-ATAGAGCTCTTAGAAAAATTCATCCAG-30ประกอบด้วย Bgl II และ Sac ฉันจำกัดเว็บไซต์ถูกออกแบบสำหรับขยายของเวกเตอร์ยีนและสัตว์เลี้ยง-28 กันถูกใช้เป็นแม่แบบขีดเส้นใต้ลำดับระบุไซต์จำกัดดำเนินโปรแกรม PCR สามชุดเดี่ยวในปริมาณสูงสำหรับขยายยีนกาฬ และค่า และลงพื้นที่ของยีน sipC โปรแกรมขยาย PCRได้ดำเนินการไดรฟ์ข้อมูลทั้งหมดของ 25 mL ในหลอด 0.2 mLประกอบด้วย 1 mL ของดีเอ็นเอต้นแบบ 1 mmol/L แต่ละพื้น2.5 mmol/L ของบัฟเฟอร์ PCR × 10, 2 mmol/L MgCl2, 200 mmol /L deoxy ribonucleoside โนซีนไตรฟอสเฟตและ Taq DNA 1 หน่วยพอลิเมอเรส (Fermentas เยอรมนี) สำหรับขยายดีที่สุดของ flanking ภูมิภาค sipC ยีนและยีนกาฬ การขั้นตอน denaturation เริ่มทำที่ C 95 ใน 5 นาทีแล้ว ขยายสำหรับวงจร 32 การ denaturation ที่ 94 C สำหรับ1 นาที การอบเหนียวที่ 62 C 1 นาทีและส่วนขยายที่ 72 Cใน 1 นาที สุดท้าย ระยะสุดท้ายส่วนขยายโปรแกรมใน 5 นาทีที่ 72 C และตัวอย่างเอาต์ได้จัดขึ้นที่ค. 102.4 การวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ PCRผลิตภัณฑ์เอาต์ (10 mL) ถูก analysed โดย electrophoresisใน 1% agarose เจลใน tetrabromoethane [ฐานทริสเรทติ้งเอทิลีน กรด boric 5.5 g 2 mmol/L, 10.8 g 89 mmol/Lกรด tetraacetic diamine 4 mL ของ 0.5 โมล/L เอทิลีน diaminetetraacetic กรด (pH 8.0) บัฟเฟอร์] ถูกแรงคงที่ 80 Vใช้สำหรับการสร้างความแตกต่างของผลิตภัณฑ์ บันได 100 bp ดีเอ็นเอ(Fermentas เยอรมนี) ถูกใช้เป็นเครื่องหมายของน้ำหนักโมเลกุลหลังจาก electrophoresis เจมีสีกับโบรไมด์ ethidiumและภาพที่ถ่ายในเอกสารเจ UVIdocระบบ (UK)2.5 การโคลนของ sipC ยีนและ plasmidผลิตภัณฑ์ PCR ได้บริสุทธิ์ใช้ชุดแยกเจ(Bioneer เกาหลี) ตาม protocol ของการผลิต PCR ทั้งหมดผลิตภัณฑ์ถูกโคลนเป็นเวกเตอร์ T ง่าย pGEM และวททชเวกเตอร์ถูกแปลง โดยไล่ความร้อนที่ 42 C และวิธีแคลเซียมคลอไรด์ลงในเซลล์มีอำนาจ TOP10F0 E. coliป.วัฒนธรรมสื่อ (เมอร์ค เยอรมนี) ต้านทานกานามัยซินใช้สำหรับการเลือก ของแคว้น flankingsipC ยีนยีนและกาฬได้รับการยืนยัน โดย endonucleases จำกัดวิเคราะห์2.6 การ subcloning ของยีน sipC และกาฬส่วน sipC ขึ้นถูกเอาออกจาก pGEM Teasyเวกเตอร์จาก Xba II-Bgl คู่ย่อยอาหาร และ subcloned ในII-Bgl Xba เป็นเส้นตรง pET-32 จะได้รับ pET-32-sipC ค่า แล้วส่วนกาญออกจากเวกเตอร์ T กลาย pGEM โดยBgl II-Sac ฉันคู่ย่อยอาหาร และ subcloned เป็น Bgl II-Sac ฉันเป็นเส้นตรง pET-32-sipC ค่าผลิต pET-32-sipC ขึ้นกันสุดท้าย pGEM-sipC ลงคู่เจ่ากับ Sac ฉัน-Xho ฉันและลงส่วนของ sipC ถูก subcloned เป็น Sac ฉัน-Xho ฉันเป็นเส้นตรง pET-32-sipC ขึ้นกาฬผลิต pET-32 sipC upkan-sipC ลง recombinant vector เซลล์มีอำนาจต้องใช้ TOP10F0 e. coli ถูกแปลง ด้วย pET-32-sipCสายกาฬ-sipC ลง recombinant vector Flanking แคว้นsipC ยีนและยีนกันประกอบด้วยข้อจำกัดจุดของ XbaBgl II, Sac ฉันและฉันถูกแทรกลงในไซต์ polyclonal Xhoสัตว์เลี้ยง-32 ใช้สำหรับ e. coli TOP10F0 เซลล์ต้องใช้อำนาจการแปลง และอ่างในปอนด์ agar media ประกอบด้วยแอมพิซิลลิน โครงสร้างสุดท้ายได้รับการยืนยัน โดยคู่ย่อยอาหารจาก Xba ฉัน-Xho ฉัน และ PCR ที่ใช้ขึ้น-sipC-F และไพรเมอร์ลง-sipC-R3. ผลลัพธ์ดีเอ็นเอถูกตอ และ PCR ขยายผลิตภัณฑ์สำหรับ flanking แคว้น sipC และกาฬยีนบน 1% agarose เจลเปิดเผย 320 bp, 206 bp และบางส่วนของ bp 835 ตามลำดับ(รูป 1)ในขั้น ตอน ขึ้น และลงภูมิภาคของยีน sipC ของ s ได้ยีน typhimurium และกาฬถูกโคลน ด้วยโคลนเทคนิค TAใน pGEM T-ง่ายเวกเตอร์สำเร็จ แยกต่างหาก(รูปที่ 2)Plasmid ฟอกและ Xba ฉัน Bgl II, Sac ฉันและ Xho ฉันจำกัดendonuclease การย่อยอาหารของสัตว์เลี้ยง-32-sipC ขึ้นกาฬ-sipCลง plasmid recombinant ยืนยันการ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

1. บทนำSalmonella เป็นสมาชิกของครอบครัว Enterobacteriaceae เป็นกลุ่มใหญ่ของแกรมลบที่ไม่สร้างสปอร์แบคทีเรียและanaerobes ตามอำเภอใจ [1] เชื้อ Salmonella enterica (เอส enterica) ทำให้เกิดเกือบ 99% ของการติดเชื้อ Salmonella ในสัตว์และมนุษย์[2] enterica เอสมีประมาณ 2,600 หลากหลายสายพันธุ์ซึ่งประกอบด้วยสองชนิดbongori Salmonella และ S. enterica และมีการแบ่งออกเป็นหกชนิดย่อย: salamae, enterica, diarizonae, arizonae indica และ houtenae [1]. เอส enterica serovar typhimurium (typhimurium เอส) เป็นกันอย่างแพร่หลายเชื้อโรคกระจายที่เกิดจากอาหารและเป็นหนึ่งในความนิยมมากที่สุดสาเหตุของการเกิดโรคที่เกิดจากอาหารของแบคทีเรียในคนและสัตว์และเสียชีวิตทั่วโลก[3,4] Salmonellosis ถือเป็นหนึ่งของzoonoses ที่เกิดจากอาหารที่สำคัญที่สุดที่จะถูกมองในสองชนิดของโรคที่แตกต่างกันมีไข้ลำไส้ซึ่งสามารถไทฟอยด์หรือไข้รากสาดเทียมและกระเพาะอาหารและลำไส้ซึ่งเป็นที่ไม่typhoidal [5,6]. การติดเชื้อแบคทีเรียที่ทำให้เกิดในมนุษย์ 21 ล้าน กรณีของไข้ไทฟอยด์และ200,000 รายต่อปีส่วนใหญ่อยู่ในภาคใต้ของเอเชียแอฟริกาและอเมริกาใต้[7] การค้นพบของใหม่วัคซีนสำหรับเชื้อ Salmonella เป็นความท้าทายสำหรับนักวิทยาศาสตร์ที่. วัคซีนหลายคนได้ผ่านการทดสอบทางคลินิก ความต้องการของวัคซีนมีประสิทธิภาพต่อเชื้อ Salmonella ให้แข็งแกร่งของร่างกายเช่นเดียวกับการสร้างภูมิคุ้มกันโทรศัพท์มือถือยังคงอยู่[8]. เอส enterica serovars ได้รับการจำแนกอยู่บนพื้นฐานของการเกิดปฏิกิริยาของสารที่จะlipopolysaccharide ร่างกาย, flagellar และ capsular แอนติเจน จากลักษณะทางคลินิกเหล่านี้อาจจะกว้างจัดกลุ่มบนพื้นฐานของช่วงโฮสต์และการเป็นตัวแทนของโรค[9] เกาะเชื้อ Salmonella (Spis) ที่ 1 และ 2 มีสองปัจจัยความรุนแรงที่สำคัญของเอสenterica พวกเขาเข้ารหัสประเภทที่สามระบบการหลั่ง (T3SS) ซึ่งดำเนินการ effector โปรตีนและเปิดใช้งานการฉีดของโปรตีน effector โดยตรงในเซลล์ของเซลล์ eukaryotic เอฟเฟคเหล่านี้ในที่สุดก็จัดการกับฟังก์ชั่นโทรศัพท์มือถือของโฮสต์ที่ติดเชื้อและความสะดวกสบายของการพัฒนาของการติดเชื้อ[10] ในปัจจุบัน21 Spis ได้รับการยอมรับใน Salmonella หลายคนระบุยีน SPI เข้ารหัสมีฟังก์ชั่นสมมุติเท่านั้นไม่มีบทบาทที่ชัดเจนในการเกิดโรคSalmonella. SPI-1 สถานที่คือ 40 กิโลเกาะโครโมโซมซึ่งเป็นพาหนะในทุกยีนอื่นๆ ที่จำเป็นสำหรับการสังเคราะห์ของT3SS การทำงานเป็นจำนวนมาก ของ effector บางและกฎระเบียบโปรตีนและครูใหญ่ของพวกเขา[1] T3SS ช่วยให้หลั่งโปรตีนผ่านเยื่อหุ้มด้านนอกและด้านแบคทีเรียและtranslocon สร้างรูขุมขนในเยื่อหุ้มเซลล์โฮสต์ [11]. ที่ตั้งและการทำงานของโปรตีนเหล่านี้ในระบบนี้มีการแสดงด้านล่าง โปรตีนภายใน: InvA, SPAP, Q, R, S; โปรตีนภายในที่เกี่ยวข้อง: InvA อี; เยื่อหุ้มชั้นนอกโปรตีน: InvG, PrgK, PrgH; chaperone: SICA; สมมุติพี่เลี้ยง: InvI; โปรตีนที่หลั่งมามีส่วนร่วมในการหลั่ง: InvJ, SPAO; หลั่งโปรตีนที่มีฟังก์ชั่น effector (ที่เป้าหมายโปรตีน): SIPA, SIPB บุก Salmonella โปรตีน C (SIPC). SipD, SptP [12] บุกจะเริ่มโดยเชื้อโรคผูกพันกับเซลล์โฮสต์พื้นผิว [13] หลังการรุกรานและเข้าสู่เซลล์ขนาดเล็กที่ลำไส้ช่วยให้สภาพแวดล้อมยีน T3SS-1 ที่จะแสดงและต่อมาระบบการหลั่งที่จะรวมตัวกันที่เมมเบรนของแบคทีเรีย[14] รายการของเซลล์จะถูกกำหนดโดยrearrangements ของโครงร่างของเซลล์โปรตีนซึ่งเป็นส่วนหนึ่งค้านโดยSIPC เป็นส่วนประกอบของ translocon แบคทีเรียที่สถานที่ของการติดต่อเชื้อแบคทีเรียที่เป็นเจ้าภาพเซลล์[1] SIPC มีสองพื้นที่ซึ่งประกอบไปด้วยเมมเบรนที่มีC- และ n- ขั้วโดเมนด้านหน้าของพลาสซึมของเซลล์โฮสต์ นี้ประกอบทอพอโลยีนี้โปรตีน effector คือเหตุผลกับนิวเคลียสโปรตีนและโยกย้ายเป็นกระบวนการ อย่างน่าทึ่งทั้งของกระบวนการเหล่านี้ส่วนใหญ่จะมีขึ้นอยู่กับ C-ปลายทางของ SIPC SIPC สามารถ จำกัด วงพอลิเมอโปรตีนที่เว็บไซต์ของสิ่งที่แนบมาของเชื้อแบคทีเรียและใช้โปรตีนโดยตรง[15] กานามัยซินจะใช้งานกับ aminophosphotransferases โดยการโอนกรัมฟอสเฟตกับ OH กลุ่มใน 30 ตำแหน่งของ pseudosaccharide ยีนกาฬถูกโคลนและเปลี่ยนในเชื้อ Escherichia coli (E. coli) เซลล์ [16]. วัตถุประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้เพื่อสร้างพลาสมิดที่ดำเนินกานามัยซินแทนยีนต้านทานของ typhimurium S. ยีน SIPC พื้นเมืองที่มีส่วน Up-กาญจน์ลง โดยใช้คล้ายคลึงกันเทคนิคการรวมตัวกันอีก. 2 วัสดุและวิธีการ2.1 ที่ซับซ้อนแบคทีเรีย, พลาสมิดก่อสร้างและสื่อในการศึกษานี้โปรโตคอลและรูปแบบความยินยอมที่ได้รับการอนุมัติจากอิสลามAzad มหาวิทยาลัย Shahrekord สาขาShahrekord อิหร่านกับ 17621105 จำนวนทุน รุนแรง S. Typhimurium (ATCC-13311) เก็บรวบรวมจากวิทยาทางห้องปฏิบัติการของอิสลามAzad มหาวิทยาลัย Shahrekord สาขาได้รับการเก็บรักษาไว้เป็นหุ้นกลีเซอรอลแช่แข็งและการเพาะเลี้ยงเข้าLuria- Bertani (LB) น้ำซุปจนระยะการเจริญเติบโตเข้าสู่ระบบ (ความหนาแน่นออปติคอล600 = 0.9) ก็มาถึง . ยีนกาฬที่แยกได้จากสัตว์เลี้ยง 28 เวกเตอร์ สำหรับการโคลน, การเก็บรักษาของชิ้นดีเอ็นเอและsubcloning, เวกเตอร์ pGEM T-ง่ายโดยใช้ชุดการโคลน TA (Promega, สหรัฐ) และสำหรับผู้รักสัตว์ 32 เวกเตอร์ที่มีอีโคไลสายพันธุ์ TOP10F0 ถูกนำมาใช้ตามลำดับ วัฒนธรรมแบคทีเรียเติบโตที่ 37 องศาเซลเซียสใน LB น้ำซุปและจานอาหารเลี้ยงเชื้อ LB. 2.2 การสกัดดีเอ็นเอจาก typhimurium S. ดีเอ็นเอที่แยกได้จากโคโลนีของเชื้อแบคทีเรียโดยใช้ดีเอ็นเอชุดสกัด (DNP ™ชุด CinnaGen อิหร่าน) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต คุณภาพของดีเอ็นเอที่ได้รับการตรวจสอบเมื่อวันที่ 1% ข่าวคราว agarose และวัดโดยสเปกการวัดที่260 นาโนเมตรตาม Sambrook และรัสเซล [17]. 2.3 การขยายของภูมิภาคขนาบยีน SIPC และยีนกาฬไพรเมอร์Oligonucleotide ได้รับการออกแบบสำหรับการขยายของภูมิภาคขนาบยีนSIPC ของ typhimurium เอส ลำดับของไพรเมอร์เหล่านี้ขึ้น SIPC-F: 50 ATGTCTAGA CCCTAAATAAAGTGGCG-30 และขึ้น SIPC-R: 50 ATTAG ATCTCTCCCTTTATTTGGCAG-30 (หมายเลขภาคยานุวัติ: CP008928.1) ที่มี XBA I และ II BGL เว็บไซต์และข้อ จำกัดลง SIPC -F: 50 ATTGAGCTCTGACCACTGAAAGCCAC-30 และลง SIPC-R: 50 ACACTCGAGTAATACCCAGACTT TCCG-30 (หมายเลขภาคยานุวัติ: CP007360.1) ที่มี Sac ฉันและXho ฉันไซต์ข้อ จำกัด ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับการขยายของขึ้นและลงพื้นที่ของยีน SIPC ตามลำดับ นอกจากนี้ kan-F: 50 ATAAGATCTATGAGCCATATTCAGCGTG-30 และ kan- R: 50 ATAGAGCTCTTAGAAAAATTCATCCAG-30 ไพรเมอร์ที่มีBGL ครั้งที่สองและฉัน Sac เว็บไซต์ข้อ จำกัด ได้รับการออกแบบสำหรับการขยายของยีนกาฬและสัตว์เลี้ยง28 เวกเตอร์ที่ใช้เป็นแม่แบบ. ลำดับแสดงให้เห็นขีดเส้นใต้ เว็บไซต์ข้อ จำกัด . สามคอลเลกชันของโปรแกรม PCR ได้ดำเนินการโดยลำพังในปริมาณสูงสำหรับการขยายของยีนกาฬขึ้นไปและลงภูมิภาคของยีนSIPC PCR โปรแกรมขยายได้ดำเนินการในปริมาณรวมทั้งสิ้น25 มิลลิลิตรใน 0.2 หลอดมิลลิลิตรมี1 มิลลิลิตรของดีเอ็นเอแม่แบบ 1 มิลลิโมล / ลิตรของแต่ละไพรเมอร์, 2.5 มิลลิโมล / ลิตร 10 ×บัฟเฟอร์ PCR 2 มิลลิโมล / ลิตร MgCl2 200 มิลลิโมล / L-Deoxy ribonucleoside triphosphate และ 1 หน่วยดีเอ็นเอ Taq โพลิเมอร์ (Fermentas, เยอรมนี) สำหรับการขยายที่ดีที่สุดของขนาบภูมิภาคของยีน SIPC และยีนกาฬเป็นขั้นตอนdenaturation เริ่มต้นเป็นที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที, ขยายแล้วสำหรับ 32 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 94? C เป็นเวลา1 นาที, การอบที่ 62 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 และการขยายนาทีที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา1 นาที สุดท้ายขั้นตอนสุดท้ายคือการขยายโปรแกรมเป็นเวลา 5 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียสและตัวอย่างขยายถูกจัดขึ้นที่ 10 องศาเซลเซียส. 2.4 การวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ PCR ผลิตภัณฑ์ขยาย (10 มิลลิลิตร) ถูกนำมาวิเคราะห์โดยอิเลในเจลagarose 1% ใน Tetrabromoethane [tris ฐาน10.8 กรัม 89 มิลลิโมล / ลิตร, กรดบอริก 5.5 กรัม 2 มิลลิโมล / ลิตร, เอทิลีนdiamine tetraacetic กรด 4 มิลลิลิตร 0.5 โมล / ลิตร diamine เอทิลีนกรดtetraacetic (pH 8.0) บัฟเฟอร์] แรงดันคงที่ 80 V ถูกใช้สำหรับความแตกต่างของผลิตภัณฑ์ บันไดดีเอ็นเอ bp 100 (Fermentas, เยอรมนี) ถูกใช้เป็นเครื่องหมายน้ำหนักโมเลกุล. หลังจากที่อิเลคเจลที่ถูกย้อมด้วย ethidium bromide และภาพที่ถูกถ่ายใน UVIdoc เจลเอกสารระบบ(สหราชอาณาจักร). 2.5 การโคลนยีน SIPC ก่อสร้างพลาสมิดผลิตภัณฑ์PCR ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ชุดการสกัดเจล(Bioneer เกาหลี) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต ทั้งหมด PCR ผลิตภัณฑ์ถูกโคลนเข้า pGEM T-ง่ายเวกเตอร์และ recombinant เวกเตอร์ถูกเปลี่ยนโดยช็อตความร้อนที่ 42 องศาเซลเซียสและวิธีแคลเซียมคลอไรด์ลงในเชื้อE. coli TOP10F0 เซลล์ที่มีความสามารถในการเลี้ยงเชื้อLB (เมอร์ค, เยอรมนี) ต้านทานกานามัยซินที่ใช้สำหรับการเลือก การปรากฏตัวของขนาบภูมิภาคของยีน SIPC และยีนกาญจน์ได้รับการยืนยันโดยข้อ จำกัด endonucleases วิเคราะห์. 2.6 Subcloning ของ SIPC และยีนกาฬชิ้นขึ้นSIPC ถูกลบออกจาก pGEM Teasy เวกเตอร์โดย XBA I-II BGL ย่อยอาหารคู่และ subcloned ในXBA I-II BGL เชิงเส้นสำหรับผู้รักสัตว์ 32 ที่จะได้รับสำหรับผู้รักสัตว์ 32 SIPC ขึ้น จากนั้นส่วนกาญจน์ได้รับการปล่อยตัวจาก pGEM เวกเตอร์ T-ง่ายโดยการ BGL II-Sac ฉันเป็นสองเท่าการย่อยอาหารและ subcloned เข้า BGL II-Sac ผมเชิงเส้นสำหรับผู้รักสัตว์32 SIPC ผลิตขึ้นสำหรับผู้รักสัตว์ 32 SIPC ขึ้นกาฬ. สุดท้าย pGEM- SIPC ย่อยลงคู่กับ I-Sac Xho ฉันและลงส่วนของSIPC ถูก subcloned เข้า I-Sac Xho ฉันเชิงเส้นสำหรับผู้รักสัตว์32 SIPC ขึ้นกาฬในการผลิตสำหรับผู้รักสัตว์ 32 SIPC upkan- SIPC ลงเวกเตอร์ recombinant เซลล์อำนาจของอี coli สายพันธุ์ TOP10F0 ถูกเปลี่ยนกับสัตว์เลี้ยง 32 SIPC ขึ้น kan-SIPC ลงเวกเตอร์ recombinant ขนาบภูมิภาคของยีน SIPC และยีนกาฬที่มีข้อ จำกัด ของการจุด XBA ผม BGL ครั้งที่สอง Sac ฉันและ Xho ฉันถูกแทรกอยู่ในเว็บไซต์ของโพลีในสัตว์เลี้ยง32 สายพันธุ์อีโคไล TOP10F0 เซลล์อำนาจถูกนำมาใช้สำหรับการเปลี่ยนแปลงและการเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อLB สื่อที่มีampicillin สร้างสุดท้ายได้รับการยืนยันโดยการดับเบิลย่อยอาหารโดย XBA I-Xho I และโดยวิธี PCR โดยใช้ขึ้น SIPC-F และลงSIPC-R ไพรเมอร์. 3 ผลดีเอ็นเอถูกสกัดและประสบความสำเร็จ PCR ผลิตภัณฑ์ขยายสำหรับภูมิภาคขนาบของSIPC และยีนกาฬในเจล agarose 1% เผย 320 bp 206 bp และ 835 ชิ้น bp ตามลำดับ(รูปที่ 1). ในขั้นตอนต่อไปขึ้นและลงของภูมิภาค SIPC ยีนเอสtyphimurium และยีนกาฬถูกโคลนด้วยเทคนิคการโคลนนิ่ง TA ใน pGEM เวกเตอร์ T-ง่ายประสบความสำเร็จแยกกัน(รูปที่ 2). การทำให้บริสุทธิ์และพลาสมิด XBA I, II BGL ตันฉันและ Xho ฉันข้อ จำกัดการย่อยอาหารของสัตว์เลี้ยงของ endonuclease-32 -sipC ขึ้น kan-SIPC ลงพลาสมิดสายผสมได้รับการยืนยัน