2. Materials and methods2.1. Screen

2. Materials and methods
2.1. Screening the antifungal activity of EOs

Clove, cinnamon leaf, lemon and mandarin EOs (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) were individually tested against Aspergillus flavus (CECT 2685), Aspergillus niger (CECT 20156) and Penicillium expansum (CECT 20140). The method described by Viuda-Martos et al. (2008) was employed with minor modifications. The stock cultures of fungi were supplied by the Spanish Type Culture Collection (CECT, Burjassot, Spain). The fungus were inoculated on Potato Dextrose Agar (PDA, Scharlab, Barcelona, Spain) and incubated at 25 °C for 7 days. Afterwards, spores were counted in a haemocytometer to achieve an inoculum density of 106 CFU/mL. Different EO concentrations were tested after taking into account previous studies ( Omidbeygi et al., 2007, Perdones et al., 2012 and Viuda-Martos et al., 2008). The concentrations of tested EOs were: 0.40, 0.45, 0.50 and 0.55 mg/g for clove oil; 0.50, 0.55, 0.60 and 0.65 mg/g for cinnamon leaf oil; 10, 12.50, 15 and 17.50 mg/g for lemon oil; 27.50, 30, 32.50 and 35 mg/g for mandarin oil. Aliquots of 15 g of PDA with the EOs and 0.1% (w/w) Tween 80 (Scharlab, Barcelona, Spain) were poured into Petri dishes. EOs were added to the culture medium at 50 °C and Tween 80 was added to the medium to ensure good EO distribution. The petri dishes without EO were used as control samples. The centre of each plate was inoculated with a PDA disc (7 mm diameter) taken from the edge of 0-day-old fungi culture, previously spread with 100 μL of the spore solution (106 CFU/mL). Each plate was sealed with Parafilm® and incubated for 7 days at 25 °C. Radial mycelial growth was evaluated daily for 7 days by measuring the diameter of each fungus. Values were expressed in mm diameter/day. All tests were run in duplicate.

2.2. Study of O/W emulsions

2.2.1. Emulsion preparation

Xanthan gum (XG, Satiaxane™ CX 911, Cargill, Barcelona, Spain) was dispersed in distilled water at 2.5, 5.0 and 7.5 mg/g, and stirred overnight at room temperature. After biopolymer dissolution, the clove and cinnamon leaf EOs were added to reach the final concentrations of 0.55, 0.65, 0.75 mg/g and 0.65, 0.75, 0.85 mg/g, respectively. The mixture was emulsified in a rotor-stator homogenizer (Ultraturrax, IKA®, Germany) at 10,000 rpm for 1 min and 20,000 rpm for 3 min. These emulsions were degasified at room temperature with a vacuum pump.

2.2.2. Physico-chemical characterisation of O/W emulsions

The particle size was determined with a laser diffractometer (Mastersizer 2000, Malvern Instruments, Worcestershire, UK). Emulsions were diluted in deionised water at 2000 rpm until an obscuration rate of 10% was obtained. The Mie theory was applied by considering a refractive index of 1.50 and absorption of 0.01.

The ζ-potential was carried out according to Sánchez-González, Cháfer, Chiralt, and González-Martínez (2010), using a Zetasizer nano-Z (Malvern Instruments, Worcestershire, UK).

The rheological behaviour of emulsions was analysed by a rotational rheometer (Haake Rheostress 1, Thermo Electric Corporation, Karlsruhe, Germany) with a type Z34DIN Ti sensor system of coaxial cylinders, assessed as described by Sánchez-González et al. (2010). Shear stress (τ) was measured as according to shear rate (View the MathML source from 0 to 512 s−1. Apparent viscosity values were calculated at 100 s−1.

2.2.3. GC–MS analysis

The clove and cinnamon leaf EOs and O/W emulsions composition were analysed by GC/MS. Two grams of the EO or O/W emulsions were suspended in a tube that contained 15 mL of n-hexane. The mixture was shaken gently and filtered through filter paper. n-Hexane was evaporated at 40 °C in a rota-vapour, and the obtained extracts were added to 2 mL of n-hexane and analysed by GC–MS.

The GC/MS analysis of the EOs was performed in a 6890/5975 inert GC–MS (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, US), equipped with a HP-5 fused silica capillary column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm). The oven temperature was held at 60 °C for 3 min, and then raised to 100 °C at 10 °C/min, to 140 °C at 5 °C/min, and finally to 240 °C at 20 °C/min. Helium gas was used as the carrier gas at a constant flow rate of 1 mL/min. The injector and MS transfer line temperatures were set at 250 °C and 230 °C, respectively. The parameters for the MS analysis were EI Ion source, electron energy 70 eV, solvent delay 3 min and m/z 40–550 amu. EO components were identified by matching mass spectra with the standard mass spectra from the NIST MS Search 2.0 library.

2.2.4. Antifungal activity of O/W emulsions

The antifungal activity of the clove and cinnamon leaf emulsions against A. flavus, A. niger and P. expansum was determined by the methodology described in Section 2.1. In this case, 0.5 g of each O/W emulsion was added to 49.5 g of PDA at 50 °C. Next aliquots of 15 g of PDA with the emulsions were poured into Petri dishes. The PDA with a dispersion prepared with distilled wa

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. การตรวจหาฤทธิ์ของกล้อง EOsกานพลู อบเชยใบ มะนาว และแมนดาริน EOs (Sigma Aldrich เซนต์หลุยส์ สหรัฐอเมริกา) แต่ละรายการรับการทดสอบต่อ Aspergillus flavus (CECT 2685), Aspergillus ไนเจอร์ (CECT 20156) และศาสตราจารย์ expansum (CECT 20140) วิธีการอธิบายไว้โดย Viuda Martos et al. (2008) ถูกจ้าง ด้วยการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย วัฒนธรรมหุ้นของเชื้อราได้มาจากสเปนชนิดลเล็ก (CECT, Burjassot สเปน) เชื้อรา inoculated บนมันฝรั่งวุ้นเดกซ์โทรส (PDA, Scharlab บาร์เซโลนา สเปน) และได้รับการกกที่ 25 ° C 7 วัน หลังจากนั้น สปอร์นับได้ใน haemocytometer เพื่อให้ได้ความหนาแน่นผิด inoculum ของ 106 CFU/mL ความเข้มข้นแตกต่างกันของ EO ทดสอบหลังจากพิจารณาบัญชีศึกษาก่อนหน้านี้ (Omidbeygi et al. 2007, Perdones et al. 2012 และ Viuda Martos et al. 2008) มีความเข้มข้นของทดสอบ EOs: 0.40, 0.45, 0.50 และ 0.55 มิลลิกรัม/กรัมสำหรับน้ำมันกานพลู 0.50, 0.55, 0.60 และ 0.65 mg/g สำหรับน้ำมันใบอบเชย 10, 12.50, 15 และ 17.50 mg/g สำหรับน้ำมันมะนาว 27.50, 30, 32.50 และ 35 มิลลิกรัม/กรัมน้ำมันแมนดาริน Aliquots 15 กรัมของ PDA กับกล้อง EOs และ 0.1% (w/w) 80 โลก (Scharlab บาร์เซโลนา สเปน) ถูกเทลงในจานเพาะ กล้อง EOs ถูกเพิ่มไปยังสื่อวัฒนธรรมที่ 50 ° C และ 80 แต่ถูกสื่อให้กระจายดี EO อาหารเพาะ โดย EO ถูกใช้เป็นตัวอย่างควบคุม ศูนย์กลางของแต่ละจานถูก inoculated กับ PDA แผ่น (เส้นผ่าศูนย์กลาง 7 มม.) นำมาจากขอบของวัฒนธรรมเชื้อ 0 วันเก่า ก่อนหน้านี้ มีแพร่กระจาย ด้วย μL 100 โซลูชันสปอร์ (106 CFU/mL) แต่ละจานถูกปิดผนึก ด้วย Parafilm® และรับการกก 7 วันที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส เติบโต mycelial รัศมีถูกประเมินทุกวัน 7 วัน โดยการวัดเส้นผ่าศูนย์กลางของแต่ละเชื้อรา ค่าถูกแสดงในมม.เส้นผ่าศูนย์กลางวัน การทดสอบทั้งหมดถูกเรียกใช้สำเนา2.2. ศึกษา O/W อิมัลชัน2.2.1. อิมัลชันเตรียมหมากฝรั่ง xanthan (XG, Satiaxane™ CX 911 คาร์กิลล์ บาร์เซโลนา สเปน) กระจายตัวในน้ำกลั่นที่ 2.5, 5.0 และ 7.5 mg/g และกวนข้ามคืนที่อุณหภูมิห้อง หลังจากยุบ biopolymer กานพลูและอบเชยใบ EOs ได้เพิ่มถึงความเข้มข้นสุดท้ายของ 0.55, 0.65, 0.75 mg/g และ 0.65, 0.75, 0.85 mg/g ตามลำดับ ส่วนผสมถูก emulsified ใน homogenizer สเตใบพัด (Ultraturrax, IKA® เยอรมนี) ที่ 10,000 rpm 1 นาที และ 3 นาที 20,000 รอบต่อนาที สารแขวนลอยเหล่านี้ถูก degasified ที่อุณหภูมิห้องกับปั๊มสุญญากาศ2.2.2. ดิออร์ตรวจลักษณะเฉพาะของของอิมัลชัน O/Wขนาดอนุภาคที่ถูกกำหนด ด้วยการเลเซอร์ diffractometer (Mastersizer 2000 เครื่องมือมัลเวิร์น วูสเตอร์เชอร์ UK) อิมัลชันถูกเจือจางในน้ำ deionised ที่ 2000 รอบต่อนาทีจนมีอัตรา obscuration 10% ได้รับ ทฤษฎีมิเอะถูกนำไปใช้ โดยพิจารณาดัชนีหักเห 1.50 และการดูดซึมของ 0.01Ζศักยภาพได้ดำเนินการตาม González สุดน่ารักถือ Cháfer, Chiralt และ González-มาร์ตีเนซ (2010), ใช้ a Zetasizer nano-Z (เครื่องมือมัลเวิร์น วูสเตอร์เชอร์ สหราชอาณาจักร)คือวิเคราะห์พฤติกรรมการไหลของอิมัลชัน โดยรีหมุน (Haake Rheostress 1 เทอร์โม คอร์ปอเรชั่น คาร์ลสฮัวร์ เยอรมัน) มีชนิดระบบเซ็นเซอร์ Z34DIN Ti ถังโคแอกเซียล ประเมินตามที่อธิบายไว้โดยสุดน่ารักถือ González et al. (2010) ความเครียดเฉือน (τ) โดยวัดเป็นอัตราเฉือน (ดูแหล่ง MathML จาก 0 ถึง 512 s−1 ตาม มีคำนวณค่าความหนืดปรากฏที่ 100 s−12.2.3. GC – MS วิเคราะห์กานพลู และอบเชยใบ EOs และองค์ประกอบของอิมัลชัน O/W ถูกวิเคราะห์ ด้วย GC/MS สองกรัมของอิมัลชัน EO หรือ O/W ได้ลอยอยู่ในท่อที่มีอยู่ของเอ็นเฮกเซน 15 mL เขย่าเบา ๆ และถูกกรองผ่านกระดาษกรองส่วนผสม แก้ไขระเหยเฮกเซน n ที่ 40 ° C ในโรตาไอ และสารสกัดที่ได้รับเพิ่ม 2 มล.ของเอ็นเฮกเซน และวิเคราะห์ ด้วย GC-MSดำเนินการวิเคราะห์ GC/MS ของกล้อง EOs ใน 6890/5975 เฉื่อย GC – MS (Agilent เทคโนโลยี ซานตาคลารา CA สหรัฐอเมริกา), พร้อมกับ HP-5 ครอบฟันด้วยทั่วซิฝอยคอลัมน์ (30 m × 0.25 mm × 0.25 ไมครอน) อุณหภูมิเตาอบ 60 ° C เป็นเวลา 3 นาที และเลี้ยง 100 ° c 10 ° C/นาที ถึง 140 ° C ที่ 5 ° C/นาที และในที่สุด ถึง 240 ° C ที่ 20 ° C/นาที ฮีเลียม แก๊สใช้เป็นผู้ขนส่งก๊าซใน 1 มิลลิลิตร/นาทีอัตราไหลคง หัวฉีดและ MS โอนสายอุณหภูมิตั้งไว้ที่ 250 ° C และ 230 ° C ตามลำดับ พารามิเตอร์สำหรับการวิเคราะห์ MS ถูกแหล่ง EI ไอออน อิเล็กตรอนพลังงาน 70 eV ตัวทำละลายหน่วงเวลา 3 นาทีและ m/z การ์เดี้ยน 40 – 550 คอมโพเนนต์ EO ถูกระบุ โดยตรงมวลสเปกตรัมด้วยสเปกตรัมมวลมาตรฐานจาก NIST MS 2.0 ค้นหาไลบรารี2.2.4. ฤทธิ์ของอิมัลชัน O/Wฤทธิ์ของกานพลูและอบเชยใบอิมัลชัน A. flavus, A. ไนเจอร์ และ P. expansum ถูกกำหนด โดยวิธีการที่อธิบายไว้ในส่วน 2.1 ในกรณีนี้ ถูก 0.5 กรัมของอิมัลชัน O/W แต่ละ 49.5 g ของ PDA ที่อุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียส Aliquots ถัดไป 15 กรัมของ PDA กับสารแขวนลอยถูกเทลงในจานเพาะ PDA ที่ มีการกระจายตัวที่เตรียมกับ wa กลั่น

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 การตรวจคัดกรองกิจกรรมต้านเชื้อราของ EOS

กานพลูใบอบเชย, มะนาวและส้มแมนดาริน EOS (Sigma-Aldrich, เซนต์หลุยส์, USA) ได้รับการทดสอบเป็นรายบุคคลกับเชื้อรา Aspergillus flavus (CECT 2685) Aspergillus ไนเจอร์ (CECT 20,156) และ Penicillium expansum (CECT 20140) . วิธีการอธิบายโดย Viuda-Martos et al, (2008) ถูกจ้างมาด้วยการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย วัฒนธรรมหุ้นของเชื้อราที่ถูกจัดทำโดยสเปนประเภทวัฒนธรรมสะสม (CECT, Burjassot, สเปน) เชื้อราถูกเชื้อในมันฝรั่ง Dextrose Agar (PDA, Scharlab, บาร์เซโลนา, สเปน) และบ่มที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 7 วัน หลังจากนั้นสปอร์นับสไลด์นับเม็ดเลือดเพื่อให้บรรลุความหนาแน่นของเชื้อ 106 CFU / มิลลิลิตร ความเข้มข้นของ EO ที่แตกต่างกันได้รับการทดสอบหลังจากที่คำนึงถึงการศึกษาก่อนหน้า (Omidbeygi et al., 2007 Perdones et al., 2012 และ Viuda-Martos et al., 2008) ความเข้มข้นของ EOS ทดสอบคือ: 0.40, 0.45, 0.50 และ 0.55 มิลลิกรัม / กรัมน้ำมันกานพลู; 0.50, 0.55, 0.60 และ 0.65 มิลลิกรัม / กรัมน้ำมันใบอบเชย; 10, 12.50, 15 และ 17.50 มิลลิกรัม / กรัมน้ำมันมะนาว 27.50, 30, 32.50 และ 35 มิลลิกรัม / กรัมน้ำมันส้มแมนดาริน aliquots 15 กรัมของ PDA กับ EOS และ 0.1% (w / w) Tween 80 (Scharlab, บาร์เซโลนา, สเปน) ถูกเทลงไปในจานเลี้ยงเชื้อ EOS ถูกเพิ่มเข้าไปในอาหารเลี้ยงเชื้อที่ 50 องศาเซลเซียสและ Tween 80 ถูกบันทึกอยู่ในกลางเพื่อให้แน่ใจว่าการกระจาย EO ดี อาหารเลี้ยงเชื้อโดยไม่ต้อง EO ถูกนำมาใช้เป็นตัวอย่างการควบคุม ศูนย์กลางของแต่ละแผ่นได้รับเชื้อด้วยแผ่น PDA (7 มิลลิเมตรเส้นผ่าศูนย์กลาง) นำมาจากขอบของวัฒนธรรมเชื้อรา 0 วันเก่า, การแพร่กระจายก่อนหน้านี้กับ 100 ไมโครลิตรของการแก้ปัญหาสปอร์ (106 CFU / มิลลิลิตร) แต่ละจานถูกปิดผนึกด้วยParafilm®และบ่มเป็นเวลา 7 วันที่ 25 ° C การเจริญเติบโตของเส้นใยเรเดียลถูกประเมินในชีวิตประจำวันเป็นเวลา 7 วันโดยการวัดขนาดเส้นผ่าศูนย์กลางของแต่ละเชื้อรา ค่าที่ได้สามารถแสดงออกในเส้นผ่าศูนย์กลางมิลลิเมตร / วัน การทดสอบทั้งหมดได้ทำงานในที่ซ้ำกัน.

2.2 การศึกษา O / อีมัลชั่ W

2.2.1 เตรียมอิมัลชัน

Xanthan หมากฝรั่ง (XG, Satiaxane ™ CX 911, คาร์กิล, บาร์เซโลนา, สเปน) คือการกระจายตัวในน้ำกลั่นที่ 2.5, 5.0 และ 7.5 มก. / g และกวนค้างคืนที่อุณหภูมิห้อง หลังจาก biopolymer ละลายกานพลูและอบเชยใบ EOS ถูกเพิ่มไปถึงความเข้มข้นสุดท้ายของ 0.55, 0.65, 0.75 มิลลิกรัม / กรัมและ 0.65, 0.75, 0.85 มิลลิกรัม / กรัมตามลำดับ ส่วนผสมที่ถูก emulsified ในโรเตอร์สเตเตอร์โฮโมจีไน (Ultraturrax, IKA®, เยอรมนี) ที่ 10,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 1 นาทีและ 20,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 3 นาที อีมัลชั่เหล่านี้ถูก degasified ที่อุณหภูมิห้องพร้อมปั๊มสูญญากาศ.

2.2.2 ลักษณะทางกายภาพและทางเคมีของ O / อีมัลชั่ W

ขนาดอนุภาคถูกกำหนดด้วย diffractometer เลเซอร์ (Mastersizer 2000 เวิร์นเครื่องดนตรีวูสเตอร์, สหราชอาณาจักร) อีมัลชั่เจือจางในน้ำ deionised 2000 รอบต่อนาทีจนกว่าอัตราเงา 10% ที่ได้รับ ทฤษฎีเมียถูกนำมาใช้โดยพิจารณาดัชนีหักเห 1.50 และการดูดซึมของ 0.01.

ζศักยภาพได้ดำเนินการตามSánchezอนซาเลซ, chafer, Chiralt และGonzález-Martinez (2010) โดยใช้ Zetasizer Nano-Z (เวิร์น เครื่องดนตรีวูสเตอร์, สหราชอาณาจักร).

พฤติกรรมการไหลของอิมัลชันได้รับการวิเคราะห์โดย rheometer หมุน (Haake Rheostress 1, เทอร์โมไฟฟ้า Corporation, Karlsruhe, เยอรมนี) กับชนิดของระบบเซ็นเซอร์ Z34DIN Ti ถังคู่สาย, การประเมินตามที่อธิบายSánchezอนซาเลซและ อัล (2010) เฉือนความเครียด (τ) วัดเป็นตามอัตราเฉือน (ดูแหล่งที่มา MathML 0-512 S-1. ค่าความหนืดจะถูกคำนวณที่ 100 S-1.

2.2.3. การวิเคราะห์ GC-MS

กานพลูและอบเชย EOS ใบ และองค์ประกอบ o / w อิมัลชันถูกนำมาวิเคราะห์ด้วย GC / MS. สองกรัมของ EO หรือ O / W อิมัลชันถูกระงับในหลอดที่มี 15 มล n-เฮกเซนได้. ส่วนผสมที่ถูกเขย่าเบา ๆ และกรองผ่านกระดาษกรอง. n- เฮกเซนถูกระเหยที่ 40 ° C ในโรตาไอและสารสกัดที่ได้ถูกเพิ่มเข้าไปใน 2 มล n-เฮกเซนและวิเคราะห์โดย GC-MS.

การวิเคราะห์ GC / MS ของ EOS ได้ดำเนินการใน GC เฉื่อย 6890/5975 -MS (Agilent Technologies, ซานตาคลารา, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) พร้อมกับ HP-5 ผสมซิลิกาคอลัมน์เส้นเลือดฝอย (30 เมตร× 0.25 มิลลิเมตร× 0.25 ไมครอน). อุณหภูมิเตาอบถูกจัดขึ้นที่ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 นาทีแล้ว ยกขึ้นถึง 100 ° C ที่ 10 ° C / นาที, 140 ° C ที่ 5 องศาเซลเซียส / นาทีและในที่สุดก็ถึง 240 ° C ที่อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส / นาที. ก๊าซฮีเลียมที่ใช้เป็นก๊าซที่มีอัตราการไหลคงที่ของ 1 มิลลิลิตร / นาที. หัวฉีดและ MS การโอนสายอุณหภูมิที่ตั้งอยู่ที่ 250 องศาเซลเซียสและ 230 ° C ตามลำดับ พารามิเตอร์สำหรับการวิเคราะห์ MS ที่เป็นแหล่งที่มา EI ไอออนพลังงานอิเล็กตรอน 70 eV ตัวทำละลายล่าช้า 3 นาทีและ m / z 40-550 Amu ส่วนประกอบ EO ถูกระบุโดยการจับคู่กับมวลสเปกตรัมสเปกตรัมมวลมาตรฐานจาก 2.0 ห้องสมุด NIST MS ค้นหา.

2.2.4 กิจกรรมต้านเชื้อราของ O / W อิมัลชัน

กิจกรรมต้านเชื้อราของกานพลูและอบเชยใบอิมัลชันกับ A. flavus, A. ไนเจอร์และพี expansum ถูกกำหนดโดยวิธีการที่อธิบายไว้ในมาตรา 2.1 ในกรณีนี้ 0.5 กรัมของแต่ละ o / w อิมัลชันถูกบันทึกอยู่ใน 49.5 กรัมของ PDA ที่ 50 ° C aliquots ถัดไป 15 กรัมของ PDA กับอิมัลชันที่ถูกเทลงไปในจานเลี้ยงเชื้อ PDA ที่มีการกระจายตัวที่เตรียมไว้กับวากลั่น