2. Materials and methods2.1. Plant

2. Materials and methods
2.1. Plant material and treatments
Mature apple (Malus domestica, Var. Granny Smith) fruit,
which were not producing detectable ethylene, were harvested
from the orchard of the University of Maryland in Western
Maryland,MD, USA. Fruits were transported to the University of
Maryland,College Park and kept at 1 °C in airwith 80%humidity.
For the air and lowoxygen treatments, fifteen to twenty fruitswere
placed in 20 L desiccators and connected to air cylinder (Air) or
low oxygen cylinder (1.5% O2) at a flow rate of 30–40 ml/min.
For 1-MCP treatment, fifteen to twenty fruits were placed in 20 L
desiccators and exposed to 10 μL/L 1-methylcyclopropene (Ethyl
Bloc from Biotechnologies for Horticulture Inc, Walterboro, SC,
USA) for 18–20 h. 1-MCP was generated in the desiccators by
placing required inert powder in the Eppendroff tube and adding
water through rubber septum using a syringe. After 1-MCP
treatment the desiccators were connected to air cylinder with the
above flow rate. Depending on the experiments done the above
desiccators sets were kept at 18 °C, 7 °C or 1 °C as mentioned in
the figure legends. Immature green GS apple fruits kept in air at
18 °C were also subjected to ethylene (10 ppm) for 24 h and 48 h to
study influence of exogenous ethylene. Fruits were removed from
the desiccators at different time points, peeled and the cortex tissue
was cut in small pieces and frozen in liquid N2. The frozen tissue
was ground to a fine powder and stored at −70 °C until used.
2.2. Measurement of ethylene production
Two ml gas sample was withdrawn from continuous airflow
from 20 L desiccators containing fifteen to twenty apples and
injected into the gas chromatograph (HP, 6890 series) to measure
ethylene every alternate day. The average of three readings from
each desiccators was taken as measure of ethylene production for
each set. Data are expressed as means±SD (standard deviation) of
at least 3–4 replicates.
2.3. Total RNA isolation, cloning and sequencing of cDNA
Total RNA from apple fruit was isolated as described by Asif
et al. (2006).RTPCRwas performed usingRTPCRkit (Invitrogen
Inc., USA) as per manufacturer's recommendations. Briefly, 2 μg
total RNA was reverse transcribed by MuMLV Reverse
Transcriptase at 42 °C using oligo(dT) primer. One tenth of the
reaction was used for PCR product using degenerate or gene
specific primers. The PCR products were cloned using TATopo
cloning kit (Invitrogen Inc., USA). To isolate full-length cDNAof
the genes 5′- and 3′-RACE was performed using gene specific
primers and respective kits (Invitrogen Inc., USA). The primers
used for isolation of partial cDNA and 5′- and 3′-RACE are listed
in Supplementary Table 1. Nucleotide sequence of each cDNA
was established using M13 universal and reverse primers.
Sequencing was carried out on an automated DNA sequencing
system (ABI 377A, Applied Biosystems Inc., USA) using the dye
terminator cycle sequencing kit. Sequence comparisons against
databases were performed using BLAST and BLASTX algorithms
(Altschul et al., 1990) at the National Center for
Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov).
2.4. Northern blot analysis
Total RNA was resolved on 1.2% formaldehyde denaturing
agarose gel and transferred to Hybond XL membrane
(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, NA, USA) according
to the manufacturer's protocol. The blot was prehybridized
overnight at 42 °C in a mixture containing 50% formaldehyde,
1% SDS, 5X SSC and 5X Denhardts solution. Denatured 32P
dCTP radiolabelled probes were added to the same but fresh
hybridization solution. The probes were prepared to a specific
activity of approximately 108 cpm μg−1 using Invitrogen
RadPrime labeling kit, and at least 1×106 cpm were added per
ml hybridization solution. The hybridization was carried out at
42 °C for 14–16 h. The washing of the blot was carried out in
SSC plus 0.1% SDS. The final wash of the blots was done at

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1 การปลูกวัสดุและรักษาแอปเปิ้ลสุก (Malus domestica สมิธยายเพียง) ผลไม้ซึ่งได้ผลิตเอทิลีนสามารถตรวจสอบได้ ไม่ได้เก็บเกี่ยวจากสวนของมหาวิทยาลัยแมริแลนด์ในตะวันตกแมริแลนด์ MD สหรัฐอเมริกา ผลไม้ถูกขนส่งไปมหาวิทยาลัยแมริแลนด์ คอลเล และเก็บที่ 1 ° C ในความชื้น 80% airwithสำหรับการที่อากาศและ lowoxygen รักษา สิบห้าถึงยี่สิบ fruitswereวางใน desiccators 20 L และเชื่อมต่อกับถังอากาศ (Air) หรือถังออกซิเจนต่ำ (1.5% O2) ที่อัตราการไหล 30 – 40 ml/นาทีการรักษา 1-MCP ผลไม้สิบห้าถึงยี่สิบถูกวางใน 20 Ldesiccators และสัมผัสกับ 10 μL/L 1-methylcyclopropene (เอทิลค่ายจาก Biotechnologies สำหรับพืชสวน Inc, Walterboro, SCสหรัฐอเมริกา) 18 – 20 h. 1-MCP ถูกสร้างใน desiccators โดยทำผงต้องใช้ inert ในหลอด Eppendroff และเพิ่มน้ำผ่าน septum ยางที่ใช้เป็นเข็ม หลังจาก 1-MCPรักษา desiccators ที่เชื่อมต่อกันเพื่อรูปทรงกระบอกมีการสูงกว่าอัตราการไหล ขึ้นอยู่กับการทดลองทำการข้างต้นชุด desiccators ถูกเก็บไว้ที่ 18 ° C, 7 ° C หรือ 1 ° C ตามตำนานรูป แอปเปิ้ล GS immature สีเขียวผลไม้เก็บไว้ในอากาศนอกจากนี้ยังถูกต้องเอทิลีน (10 ppm) 18 ° C ใน 24 h และ h 48 เพื่อศึกษาอิทธิพลของเอทิลีนบ่อย ผลไม้ออกจากdesiccators ที่จุดเวลาที่แตกต่าง ปอกเปลือกและเนื้อเยื่อ cortexตัดเป็นชิ้นเล็ก ๆ และ N2 เหลวแช่แข็งใน เนื้อเยื่อแช่แข็งพื้นดินเป็นผงดี และเก็บไว้ที่ −70 ° C จนกว่าจะใช้2.2 การวัดผลิตเอทิลีนตัวอย่างก๊าซมลสองถูกถอนจากการไหลเวียนของอากาศอย่างต่อเนื่องจาก desiccators 20 L ประกอบด้วยสิบห้าถึงยี่สิบแอปเปิ้ล และฉีดเข้าไปใน chromatograph ก๊าซ (HP ชุด 6890) วัดเอทิลีนทุกวันเว้นวัน ค่าเฉลี่ยของการพิจารณาจากแต่ละ desiccators ถูกนำเป็นวัดผลิตเอทิลีนแต่ละชุด ข้อมูลจะแสดงเป็น means±SD (ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน) ของน้อย 3-4 เหมือนกับ2.3 การแยกอาร์เอ็นเอรวม โคลน และลำดับเบสของ cDNAอาร์เอ็นเอรวมจากผลไม้แอปเปิ้ลถูกแยกตามที่อธิบายไว้ โดย asif นาซีร์al. ร้อยเอ็ด (2006)ทำ RTPCRwas usingRTPCRkit (Invitrogenอิงค์ สหรัฐอเมริกา) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต สั้น ๆ 2 μgอาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกย้อนทับศัพท์ โดย MuMLV กลับTranscriptase ที่ 42 ° C โดยใช้รองพื้น oligo(dT) สิบหนึ่งของการใช้สำหรับผลิตภัณฑ์ PCR degenerate หรือยีนปฏิกิริยาไพรเมอร์เฉพาะ ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกโคลนโดยใช้ TATopoโคลนชุด (Invitrogen Inc., USA) การแยก cDNAof ปราศจากยีน 5′ - และ 3′-แข่งทำใช้เฉพาะยีนไพรเมอร์และชนิดติดตั้งอิสระตามลำดับ (Invitrogen Inc., USA) ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับแยกของบางส่วน cDNA และ 5′ - และ 3′-แข่งขันอยู่ใน 1 ตารางเสริม ลำดับนิวคลีโอไทด์ของ cDNA แต่ละได้ก่อตั้งขึ้นโดยใช้ไพรเมอร์ M13 สากล และย้อนกลับลำดับที่ดำเนินการในการจัดลำดับดีเอ็นเออัตโนมัติระบบ (ABI 377A ใช้ Biosystems Inc., USA) ใช้การย้อมเทอร์มิเนเตอร์วงจรลำดับชุด ลำดับการเปรียบเทียบกับฐานข้อมูลถูกทำได้โดยใช้อัลกอริทึมในการระเบิดและ BLASTX(Altschul et al., 1990) ที่ศูนย์แห่งชาติข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพ (www.ncbi.nlm.nih.gov)2.4 การการวิเคราะห์เหนือคืนในตาอาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกแก้ไขใน 1.2% ฟอร์มาลดีไฮด์ denaturingagarose เจ และโอนย้ายไปเมมเบรน Hybond XL(เวลาออก Amersham บักกิงแฮมเชอร์ นา สหรัฐอเมริกา) ตามการโพรโทคอลของผู้ผลิต คืนในตาถูก prehybridizedนอนที่ 42 ° C ส่วนผสมที่ประกอบด้วยฟอร์มาลดีไฮด์ 50%1% SDS, 5 X SSC และ 5 X Denhardts โซลูชั่น Denatured 32Pคลิปปากตะเข้ dCTP radiolabelled เพิ่มเหมือนกันแต่สดhybridization โซลูชัน คลิปปากตะเข้ได้เตรียมการกิจกรรมของประมาณ 108 cpm μg−1 โดยใช้ Invitrogenเพิ่ม RadPrime ที่ติดฉลากชุด และน้อย 1 × 106 cpm ต่อมล hybridization โซลูชัน Hybridization ที่ถูกดำเนินการที่42 ° C สำหรับ h 14-16 เครื่องซักผ้าของคืนในตาถูกดำเนินการในSSC บวก 0.1% SDS ทำที่ล้างขั้นสุดท้ายของการกันบล็อท

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 วัสดุอาคารและการรักษา
ผู้ใหญ่แอปเปิ้ล (Malus domestica, Var. ยายสมิ ธ ) ผลไม้
ที่ไม่ได้ผลิตเอทิลีนที่ตรวจพบถูกเก็บเกี่ยว
จากสวนผลไม้ของมหาวิทยาลัยแมรี่แลนด์ในตะวันตก
แมริแลนด์, MD, USA ผลไม้ถูกส่งไปที่มหาวิทยาลัย
แมริแลนด์คอลเลจพาร์กและเก็บไว้ ณ วันที่ 1 ° C ใน airwith 80% ความชื้น.
สำหรับอากาศและการรักษา lowoxygen, 15-20 fruitswere
วางไว้ในดูดความชื้น 20 ลิตรและเชื่อมต่อกับถังอากาศ (Air) หรือ
ออกซิเจนต่ำ ถัง (1.5% O2) ในอัตราการไหลของ 30-40 มล. / นาที
สำหรับการรักษา 1-MCP, 15-20 ผลไม้อยู่ใน 20 ลิตร
ดูดความชื้นและสัมผัสถึง 10 ไมโครลิตร / ลิตรสาร 1-MCP (Ethyl
หมู่จาก Biotechnologies สำหรับ การปลูกพืชสวน Inc, Walterboro, SC,
USA) 18-20 ชั่วโมง 1-MCP ที่ถูกสร้างขึ้นในดูดความชื้นโดย
การวางผงเฉื่อยจำเป็นต้องใช้ในหลอด Eppendroff และเพิ่ม
น้ำผ่านเยื่อบุโพรงยางโดยใช้เข็มฉีดยา หลังวันที่ 1-MCP
รักษาดูดความชื้นได้รับการเชื่อมต่อกับถังอากาศที่มี
อัตราการไหลดังกล่าวข้างต้น ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับการทดลองทำด้านบน
ชุดดูดความชื้นที่ถูกเก็บไว้ที่ 18 องศาเซลเซียส, 7 ° C หรือ 1 ° C เป็นที่กล่าวถึงใน
ตำนานร่าง แอปเปิ้ลสีเขียวอ่อน GS ผลไม้เก็บไว้ในอากาศที่
18 องศาเซลเซียสถูกยัดเยียดยังเอทิลีน (10 ppm) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงและ 48 ชั่วโมงเพื่อ
ศึกษาอิทธิพลของเอทิลีนจากภายนอก ผลไม้ที่ถูกถอดออกจากการ
ดูดความชื้นที่จุดเวลาที่แตกต่างกัน, ปอกเปลือกและเยื่อหุ้มสมองเนื้อเยื่อ
ถูกตัดเป็นชิ้นเล็ก ๆ และแช่แข็งในของเหลว N2 เนื้อเยื่อแช่แข็ง
ถูกบดให้เป็นผงละเอียดและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -70 ° C จนใช้.
2.2 วัดของการผลิตเอทิลีน
ตัวอย่างก๊าซสองมลถูกถอนออกจากการไหลของอากาศอย่างต่อเนื่อง
ตั้งแต่วันที่ 20 L ดูดความชื้นที่มี 15-20 แอปเปิ้ลและ
ฉีดเข้าไปในก๊าซ Chromatograph (HP, 6890 ซีรีส์) ในการวัด
เอทิลีนทุกวันสลับกัน เฉลี่ยของสามอ่านจาก
ดูดความชื้นในแต่ละคนถูกนำมาเป็นตัวชี้วัดของการผลิตเอทิลีนสำหรับ
แต่ละชุด ข้อมูลจะแสดงเป็นหมายถึง± SD (ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน) ของ
อย่างน้อย 3-4 ซ้ำ.
2.3 แยก RNA รวม, โคลนและการหาลำดับเบสของยีน
ทั้งหมด RNA จากผลไม้แอปเปิ้ลที่แยกได้ตามที่อธิบายราวกับ
และคณะ (2006) .RTPCRwas ดำเนิน usingRTPCRkit (Invitrogen
Inc. , ประเทศสหรัฐอเมริกา) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต สั้น ๆ 2 ไมโครกรัม
RNA ทั้งหมดถูกถ่ายทอดกลับโดย MuMLV ย้อนกลับ
Transcriptase ที่ 42 ° C โดยใช้ Oligo (dT) ไพรเมอร์ หนึ่งในสิบของ
ปฏิกิริยาที่ใช้สำหรับผลิตภัณฑ์ PCR โดยใช้คนเลวหรือยีน
ที่จำเพาะ ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ถูกโคลนใช้ TATopo
ชุดโคลน (Invitrogen Inc. , ประเทศสหรัฐอเมริกา) ในการแยกเต็มความยาว cDNAof
ยีน 5'- และ 3'-RACE ได้รับการดำเนินการโดยใช้เฉพาะยีน
ไพรและชุดตามลำดับ (Invitrogen Inc. , ประเทศสหรัฐอเมริกา) ไพรเมอร์
ที่ใช้ในการแยกยีนบางส่วนและ 5'- และ 3'-RACE มีการระบุไว้
ในตารางที่ 1 การเสริมลำดับเบสของแต่ละ cDNA
ก่อตั้งขึ้นโดยใช้ M13 สากลและไพรเมอร์กลับ.
ลำดับได้รับการดำเนินการในลำดับดีเอ็นเออัตโนมัติ
ระบบ (ABI 377A, Applied Biosystems Inc. , ประเทศสหรัฐอเมริกา) โดยใช้สีย้อม
วงจรเทอร์มิชุดลำดับ การเปรียบเทียบลำดับกับ
ฐานข้อมูลที่ถูกดำเนินการโดยใช้ระเบิดและขั้นตอนวิธี BLASTX
(Altschul et al., 1990) ที่ศูนย์แห่งชาติสำหรับ
ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพ (www.ncbi.nlm.nih.gov).
2.4 ภาคเหนือวิเคราะห์ blot
รวม RNA ได้รับการแก้ไขในไฮด์ 1.2% denaturing
เจล agarose และโอนไปยัง Hybond XL เมมเบรน
(Amersham ชีววิทยาศาสตร์เหมือนเดิม, NA, ประเทศสหรัฐอเมริกา) ตาม
โปรโตคอลของผู้ผลิต blot ถูก prehybridized
ค้างคืนที่ 42 ° C ในส่วนผสมที่มีไฮด์ 50%,
1% SDS, 5X SSC และ 5X แก้ปัญหา Denhardts เอทิลแอลกอฮอล์ 32P
dCTP probes รังสีถูกเพิ่มเข้าไปเหมือนกัน แต่สด
การแก้ปัญหาการผสมข้ามพันธุ์ ยานสำรวจที่ถูกจัดทำขึ้นเพื่อที่เฉพาะเจาะจง
กิจกรรมประมาณ 108 ไมโครกรัม CPM-1 ใช้ Invitrogen
ชุดติดฉลาก RadPrime และอย่างน้อย 1 × 106 แผ่นต่อนาทีถูกเพิ่มต่อ
มิลลิลิตรผสมข้ามพันธุ์ การผสมพันธุ์ได้ดำเนินการที่
42 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 14-16 ชั่วโมง ล้าง blot ได้ดำเนินการใน
SSC บวก 0.1% SDS ล้างสุดท้ายของการสูญเสียการได้รับการทำที่

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . วัสดุโรงงานและการรักษา
ผู้ใหญ่แอปเปิ้ล ( มารุ domestica ) , ยาย Smith ) ผลไม้ที่ไม่ผลิตได้

เอทิลีนเก็บจากสวนของมหาวิทยาลัยแมรีแลนด์ในตะวันตก
Maryland , MD , ผลไม้สหรัฐอเมริกา ถูกส่งไปยังมหาวิทยาลัย
แมรี่แลนด์ คอลเลจพาร์คและเก็บไว้ที่ 1 ° C ใน airwith 80 % ความชื้น
สำหรับอากาศและ lowoxygen การบําบัดสิบห้าถึงยี่สิบ fruitswere
วางไว้ใน 20 L ยากง่ายและเชื่อมต่อกับกระบอกลม ( Air ) หรือ
ถังออกซิเจนต่ำ ( 1.5 % O2 ) ที่อัตราการไหล 30 – 40 ml / min
สำหรับชุดรักษา สิบห้าถึงยี่สิบผลไม้อยู่ใน 20 L
ยากง่ายและเปิดเผยถึง 10 μ l / l 1-methylcyclopropene ( -
บล็อก จาก มร. พืชสวน Inc , วอเตอร์โบโร , SC ,
USA ) 18 – 20 ชั่วโมงสามารถถูกสร้างขึ้นในโถทำแห้งโดยการใช้ผง
เฉื่อยใน eppendroff ท่อและเพิ่ม
น้ำผ่านยางกะบังโดยใช้กระบอกฉีดยา หลังจากรักษา
รักษายากง่ายเชื่อมต่อกับกระบอกลมกับ
ข้างบน อัตราการไหล ขึ้นอยู่กับการทดลองทำข้างต้นชุด
ยากง่ายไว้ที่ 18 ° C , 7 ° C หรือ 1 ° C
รูปที่กล่าวถึงในตำนาน