2.2. Cloning of allergens into pTrc

2.2. Cloning of allergens into pTrcHisA vector and expression in
Express I
q E. coli
The four gel purified PCR products (1 g of each) were digested
with the appropriate restriction enzymes; Gal d 1 and Gal d 3
with XhoI and HindIII & Gal d 2 and Gal d 4 with BamHI and
EcoRI. Separately, two 1 g batches of pTrcHisA vector (Invitrogen,
Cat.No.: V360-20) were digested with XhoI and HindIII &
BamHI and EcoRI. The digests were then gel purified using E-Gel
Clonewell 0.8% SYBR Safe agarose gels and concentrations were
measured. The four digested PCR fragments and the pTrcHisA
vectors were then used in separate ligation reactions. The ligations
were carried out with a vector:insert ratio of 1:1 (∼20 ng
of each) and T4 DNA ligase and ligase buffer with ATP (Promega,
Cat.No.: 1801). Ligation reactions were incubated overnight at
4 ◦C. The four ligation reactions, conducted for each PCR product,
were then transformed into Express I
q chemically competent E. coli
cells (New England BioLabs, Cat.No.: C3037H) following manufacturer’s
guidelines. The transformants were plated on LB agar (one
plate for each allergen) with 50 g/mL ampicillin and incubated
overnight at 37 ◦C. Next day, single colonies from each LB agar
plate were picked and grown overnight in LB + ampicillin at 37 ◦C.
Afterwards, 2 mL of each culture was centrifuged at 13,000 rpm to
pellet the cells, and supernatant discarded. These cell pellets were
used to isolate the pTrcHisA vectors containing the inserts using
QIAprep Miniprep kit (Qiagen, Cat.No.: 27104) following manufacturer’s
guidelines. The isolated plasmids were sequenced to
confirm insert of the PCR product (allergen) using pTrcHisA forward
and reverse primers: F 5
-GAGGTATATATTAATGTATCG-3 and
R 5
- GATTTAATCTGTATCAGG-3
. The sequences were compared
with published allergen sequences on IUIS/NCBI.
For expression of the proteins, overnight cultures of E. coli
colonies containing each allergen construct were grown separately
in LB media with ampicillin. The overnight cultures were then reinoculated
in 10 mL of fresh LB media and grown to mid-log phase
(OD600 0.4–0.6). A 1 mL sample of each culture was collected and
pelleted and frozen for later analysis. Expression was induced with
40 L of 100 mM IPTG to give a final concentration of 0.4 mM and
grown for six hours at 37 ◦C with shaking. Samples were collected,
pelleted and frozen every 1 hour for determination of optimum
expression time.
2.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 โคลนสารก่อภูมิแพ้เข้าสู่ pTrcHisA เวกเตอร์และการแสดงออกใน
เอ็กซ์เพรสฉัน
Q E. coli
สี่เจลบริสุทธิ์ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ (1 กรัมของแต่ละคน) ถูกย่อย
ด้วยเอนไซม์ข้อ จำกัด ที่เหมาะสม Gal D ที่ 1 และ D 3 สาว
กับ XhoI และ HindIII & D Gal ที่ 2 และ Gal D 4 กับ BamHI และ
EcoRI แยกกันสอง 1 สำหรับกระบวนการกรัม pTrcHisA เวกเตอร์ (Invitrogen,
Cat.No .: V360-20) ถูกย่อยด้วย XhoI และ HindIII และ
BamHI และ EcoRI ย่อยสลายได้รับแล้วเจลบริสุทธิ์โดยใช้ E-เจล
Clonewell 0.8% SYBR เจล agarose ปลอดภัยและความเข้มข้น
วัด สี่ย่อยเศษ PCR และ pTrcHisA
เวกเตอร์ถูกนำมาใช้แล้วในปฏิกิริยา ligation แยกต่างหาก พันธะ
ได้ดำเนินการกับเวกเตอร์: ใส่อัตราส่วน 1: 1 (~20 NG
ของแต่ละคน) และ T4 ดีเอ็นเอลิกาเซลิกาเซบัฟเฟอร์และเอทีพี (Promega,
Cat.No .: 1801) ปฏิกิริยา ligation ถูกบ่มค้างคืนที่
4 ◦C สี่ปฏิกิริยา ligation ดำเนินการสำหรับแต่ละผลิตภัณฑ์ PCR,
ถูกเปลี่ยนแล้วเป็นเอ็กซ์เพรสฉัน
Q อำนาจทางเคมี E. coli
เซลล์ (นิวอิงแลนด์ BioLabs, Cat.No .: C3037H) ดังต่อไปนี้ผู้ผลิต
แนวทาง transformants ถูกชุบบน LB agar (หนึ่ง
แผ่นสำหรับแต่ละสารก่อภูมิแพ้) 50 g / ml ampicillin และบ่ม
ค้างคืนที่ 37 ◦C วันรุ่งขึ้นอาณานิคมเดียวจากแต่ละวุ้น LB
แผ่นถูกหยิบและเติบโตขึ้นในชั่วข้ามคืน LB + ampicillin ที่ 37 ◦C.
หลังจากนั้น 2 มิลลิลิตรของแต่ละวัฒนธรรมหมุนเหวี่ยงที่ 13,000 รอบต่อนาทีเพื่อให้
เม็ดเซลล์และใสทิ้ง เหล่านี้เม็ดเซลล์ถูก
ใช้เพื่อแยกพาหะ pTrcHisA มีแทรกโดยใช้
QIAprep miniprep Kit (Qiagen, Cat.No .: 27104) ดังต่อไปนี้ผู้ผลิต
แนวทาง พลาสมิดบางแห่งมีลำดับขั้นตอนในการ
ยืนยันการแทรกของผลิตภัณฑ์ PCR (สารก่อภูมิแพ้) โดยใช้ pTrcHisA ไปข้างหน้า
และย้อนกลับไพรเมอร์: F 5?
-GAGGTATATATTAATGTATCG-3? และ
R 5?
-
GATTTAATCTGTATCAGG-3? ลำดับถูกนำมาเปรียบเทียบ
กับการตีพิมพ์ลำดับสารก่อภูมิแพ้ใน IUIS / NCBI.
สำหรับการแสดงออกของโปรตีนในชั่วข้ามคืนวัฒนธรรมของเชื้อ E. coli
อาณานิคมที่มีสารก่อภูมิแพ้ในแต่ละปลูกสร้างแยกต่างหาก
ในสื่อ LB กับจิบูตี วัฒนธรรมค้างคืนถูก reinoculated แล้ว
ใน 10 มิลลิลิตรของสื่อ LB สดและเติบโตขึ้นระยะกลางเข้าสู่ระบบ
(OD600 0.4-0.6) 1 ตัวอย่างมลของแต่ละวัฒนธรรมที่ถูกเก็บรวบรวมและ
เม็ดและแช่แข็งสำหรับการวิเคราะห์ในภายหลัง การแสดงออกถูกชักนำด้วย
40 ลิตร 100 มิลลิเมตร IPTG เพื่อให้ได้ความเข้มข้น 0.4 มิลลิเมตรและมี
การเจริญเติบโตเป็นเวลาหกชั่วโมงที่ 37 ◦Cเขย่า เก็บตัวอย่าง,
เม็ดและแช่แข็งทุก 1 ชั่วโมงสำหรับการกำหนดที่เหมาะสม
เวลาการแสดงออก.
2

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2 . การโคลนและการแสดงออกใน ptrchisa Allergens ในเวกเตอร์แสดงฉันQ E . coli4 เจลบริสุทธิ์ผลิตภัณฑ์ PCR ( 1 กรัมของแต่ละคน ) ถูกย่อยกับเอนไซม์จำกัดที่เหมาะสม ; D และ D 3 แกลลอน 1 แกลลอนและด้วย xhoi - & สาว D 2 สาว D 4 ด้วย BamHI และด้วย . แยกกันสองชุดของเวกเตอร์ที่ 1 กรัม ( Invitrogen ptrchisa ,แมว . . . : v360-20 ) ถูกย่อยด้วย xhoi - & และด้วย BamHI แล้ว . ที่ย่อยสลายแล้วเจลบริสุทธิ์ใช้ e-gelclonewell 0.8% SYBR ปลอดภัย , เจลและปริมาณวัด 4 ) ชิ้นส่วนย่อย และ ptrchisaเวกเตอร์แล้วใช้ในปฏิกิริยา Ligation แยกต่างหาก การ ligationsทดลองกับเวกเตอร์ : แทรกในอัตราส่วน 1 : 1 ( ∼ 20 นาโนของแต่ละคน ) และไลเกส ดีเอ็นเอไลเกสบัฟเฟอร์และ ATP ( T4 promega ด้วย ,แมว หมายเลข : 2344 ) ปฏิกิริยา Ligation ถูกบ่มค้างคืนที่4 ◦ C สี่ Ligation ปฏิกิริยา PCR ) สำหรับแต่ละผลิตภัณฑ์แล้วเปลี่ยนเป็นบริการฉันQ E . coli เชี่ยวชาญทางเคมีเซลล์ ( อังกฤษ biolabs แมว ไม่ . . . . . : c3037h ) ต่อไปนี้ของผู้ผลิตแนวทาง พลาสมิดที่ถูกชุบวุ้น ( หนึ่งปอนด์แผ่นสำหรับแต่ละ allergen ) 50 g / ml และ ampicillin )ค้างคืนที่ 37 ◦ C . วันถัดไป , เดี่ยวอาณานิคมจากแต่ละ lb agarจานที่ถูกเลือก และโตข้ามคืนในปอนด์ + ดอกดั้วที่ 37 ◦ Cหลังจากนั้น 2 ml ของแต่ละวัฒนธรรมคือระดับที่ 13 , 000 รอบต่อนาที เพื่อเม็ดเซลล์ และนำทิ้ง เม็ดเซลล์เหล่านี้ใช้เพื่อแยก ptrchisa เวกเตอร์ที่มีแทรกโดยใช้qiaprep miniprep Kit ( QIAGEN แมว ไม่ . . . . . : 27104 ) ต่อไปนี้ของผู้ผลิตแนวทาง นี้จะถูกแยกพลาสมิดยืนยันใส่ผลิตภัณฑ์ PCR ( allergen ) ใช้ ptrchisa ไปข้างหน้าและกลับด้วย : F 5- gaggtatatattaatgtatcg-3 และR 5- gatttaatctgtatcagg-3. ลำดับการเปรียบเทียบกับหัวข้อลำดับในสารก่อภูมิแพ้ iuis / ncbi .สำหรับการแสดงออกของโปรตีน , วัฒนธรรมในชั่วข้ามคืนของ E . coliสร้างอาณานิคมที่มีสารก่อภูมิแพ้ที่ปลูกแยกแต่ละสื่อในปอนด์กับยาเพนนิซิลลิน วัฒนธรรมคืนแล้ว reinoculatedใน 10 ml ของสื่อปอนด์สดและโต mid log phase( od600 0.4 - 0.6 ) จำนวน 1 มิลลิลิตร ในแต่ละวัฒนธรรมและรวบรวมเม็ดและแช่แข็งสำหรับการวิเคราะห์ในภายหลัง แสดงนำกับ40 ลิตรโปรตีน 100 มม. เพื่อให้ความเข้มข้นสุดท้าย 0.4 มม. และโต 6 ชั่วโมง 37 ◦ C กับสั่น ตัวอย่างที่รวบรวมเม็ดและแช่แข็งทุก 1 ชั่วโมง สำหรับการกำหนดที่เหมาะสมเวลาที่กำหนด2 .