Assay for proteolytic activity The

Assay for proteolytic activity The standard proteolytic activity against casein in protein purification was assayed according to the method of Satake et al. (46). The reaction mixture (165 μl) consisted of 140 μl of 1% (w/v) casein in 50 mM phosphate buffer (pH 7.5) and 25 μl of cordysobin solution (1.75 μg). The reaction was started by adding enzyme solution at 37°C. After incubation for 15 min, the reaction was stopped by adding 600 μl of 5% (w/v) trichloroacetic acid. The reaction mixture was kept on ice for another 10 min, then centrifuged at 12,000×g for 5 min at 4°C. The absorbance of the supernatant was read at 280 nm against water as a blank using a UV spectrophotometer. Protease activity was expressed in units, where one unit represented a 0.001 absorbance increase per minute in the supernatant per ml of reaction mixture under specified conditions (4).
Serine specific proteolytic activity against Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA in functional assays was measured according to the method of Jiang et al. (47). Appropriately 25 μl of diluted cordysobin (1 μg) was added to 450 μl of 10 mM Tris–HCl buffer, pH 8.0. The reaction was immediately initiated by the addition of 25 μl of 1 mM substrate and incubated at 37°C for 10 min. To stop the reaction, 750 μl of the stopping agent (methyl alcohol:isopropyl alcohol:distilled water=35:30:35, v/v) was added. The fluorescence intensity of the liberated 7-amino-4-methylcoumarin (AMC) was measured by a fluorescence microplate reader (Tecan) at an excitation wavelength of 380 nm and an emission wavelength of 450 nm. One unit of enzyme activity was defined as the amount of the enzyme to release 1 nmol of AMC/min.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ตรวจหาโปรตีนกิจกรรมกิจกรรมโปรตีนเคซีนกับมาตรฐานในการทำโปรตีนให้บริสุทธิ์ได้รับการวิเคราะห์ตามวิธีการของ Satake et al, (46) ปฏิกิริยาของสารผสม (165 ไมโครลิตร) ประกอบด้วย 140 ไมโครลิตร 1% (w / v) เคซีนในขนาด 50 มมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7.5) และ 25 ไมโครลิตรของการแก้ปัญหา cordysobin (1.75 ไมโครกรัม) ปฏิกิริยาเริ่มต้นโดยการเพิ่มการแก้ปัญหาการทำงานของเอนไซม์ที่ 37 ° C หลังจากการบ่มนาน 15 นาทีปฏิกิริยาก็หยุดโดยการเพิ่ม 600 ไมโครลิตร 5% (w / v) กรดไตรคลอโร ผสมปฏิกิริยาถูกเก็บไว้บนน้ำแข็งอีก 10 นาทีแล้วหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 ×กรัมเป็นเวลา 5 นาทีที่ 4 ° C ค่าการดูดกลืนของสารละลายได้อ่านที่ 280 นาโนเมตรกับน้ำเปล่าใช้ spectrophotometer รังสียูวี กิจกรรมโปรติเอสได้รับการแสดงในหน่วยที่หน่วยหนึ่งเป็นตัวแทน 0 เพิ่มขึ้น 001 การดูดกลืนแสงต่อนาทีในสารละลายต่อมิลลิลิตรผสมปฏิกิริยาภายใต้เงื่อนไขที่ระบุไว้ (4)
กิจกรรมโปรตีเอสซีรีนที่เฉพาะเจาะจงกับ Suc-Leu-Leu-Val-เทอร์เอ็มในการตรวจวัดการทำงานตามวิธีการของเจียง et al, (47) เหมาะสม 25 ไมโครลิตรของ cordysobin เจือจาง (1 ไมโครกรัม) ถูกบันทึกอยู่ใน 450 ไมโครลิตร 10 บัฟเฟอร์ mM Tris-HCl ค่า pH 8.0 ปฏิกิริยาที่เป็นจุดเริ่มต้นทันทีโดยนอกเหนือจาก 25 ไมโครลิตรของพื้นผิวที่ 1 มิลลิเมตรและบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที ที่จะหยุดการเกิดปฏิกิริยา 750 ไมโครลิตรของตัวแทนหยุด (เมทิลแอลกอฮอล์: เครื่องดื่มแอลกอฮอล์ isopropyl: น้ำกลั่น = 35: 30: 35, v / v) ถูกเพิ่มเข้ามา ความเข้มของการเรืองแสงของอิสรเสรี 7-Amino-4-methylcoumarin (AMC) โดยวัดจากผู้อ่านเรืองแสง microplate (Tecan) ที่ความยาวคลื่นกระตุ้น 380 นาโนเมตรและความยาวคลื่นปล่อย 450 นาโนเมตร

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สำหรับกิจกรรม การทดสอบโปรตีนมาตรฐานโปรตีนเคซีนในกิจกรรมต่อต้านโปรตีนเอนไซม์บำบัดน้ำเสียตามวิธีการของซาตาเกะ et al . ( 46 ) ปฏิกิริยาผสม ( 165 μ L ) จำนวน 140 μ L 1% ( w / v ) เคซีนในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ 50 มม. ( pH 7.5 ) และ 25 μ l cordysobin โซลูชั่น ( μ 1.75 กรัม ) ปฏิกิริยาเริ่มต้นโดยการเติมสารละลายเอนไซม์ที่อุณหภูมิ 37 องศา หลังจากบ่มเป็นเวลา 15 นาที ปฏิกิริยาที่ถูกหยุดโดยการเพิ่ม 600 μ L 5 % ( w / v ) กรดไตรคลอโรอะซิติก . ปฏิกิริยาผสมที่ถูกเก็บไว้ในน้ำแข็งอีก 10 นาที แล้วไฟฟ้าที่ 12000 × G สำหรับ 5 นาทีที่ 4 ° C ค่าการดูดกลืนแสงของน่านคืออ่านที่ 280 nm กับน้ำเป็นว่างใช้ UV Spectrophotometer . กิจกรรมของเอนไซม์โปรติเอสถูกแสดงในหน่วยที่ 1 หน่วยที่แสดงเป็น 0.001 ค่าเพิ่มสูงต่อมิลลิลิตรต่อนาทีในปฏิกิริยาผสมภายใต้เงื่อนไขที่ระบุไว้ ( 4 )เอนไซม์ที่เฉพาะเจาะจงกับโปรตีนกิจกรรม SUC ลิวลิววาล tyr MCA ในวิธีการทำงานได้ตามวิธีการของเจียง et al . ( 47 ) เหมาะสม 25 μ l cordysobin เจือจาง ( 1 μ g ) เพิ่ม 450 μ L 10 mm และ HCL หรือบัฟเฟอร์ pH 8.0 . ปฏิกิริยาทันทีที่ริเริ่มโดยเพิ่ม 25 μ L ( 1 มิลลิเมตร บ่มที่ 37 องศา C นาน 10 นาที เพื่อหยุดปฏิกิริยา , 750 μผมของหยุดแทน ( เมทิลแอลกอฮอล์ : isopropyl แอลกอฮอล์ : น้ำ = 35:30:35 , V / V ) ถูกเพิ่มเข้ามา ความเข้มของการเรืองแสงเป็น 7-amino-4-methylcoumarin ( AMC ) วัดจากพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย ( อ่านเรืองทีแคน ) ที่ความยาวคลื่น 380 nm และกระตุ้นการปล่อยความยาวคลื่น 450 nm . หนึ่งหน่วยของเอนไซม์ถูกกำหนดเป็นปริมาณของเอนไซม์จะปล่อย 1 ? ของ AMC / min