Human lung carcinoma A549 cells wer

Human lung carcinoma A549 cells were grown in Dulbecco's modified
Eagle's medium supplemented with 10% fetal bovine serum,
2 mM L-glutamine, 50 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin.
The cytoskeleton was visualized by double staining of actin filaments
and microtubules. Briefly, cells seeded on coverslips were washed
with phosphate-buffered saline (PBS: 150 mM NaCl, 5 mM Naphosphate
buffer, pH 7.4), fixed with 4% formaldehyde in PBS for
10 min, washed with PBS, permeabilized for 1 min with PBS containing
0.5% triton X-100, washed with PBS and incubated for 1 h with monoclonal
anti-alpha tubulin (DM1A) antibody (Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO) in PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA). The cells
were then washed with PBS, and microtubules were stained with
FITC-conjugated anti-mouse-IgG antibody in PBS containing 1% BSA.
To visualize microfilaments and the nucleus, the cells were stained
with Alexa Fluo488 phalloidin and 4′,6-diamidino-2-phenylindole, respectively,
as described in detail elsewhere [25–27]. Actin filaments
and microtubules were disrupted by 20–30-min treatment with
20 μM cytochalasin B and 10 μM vinblastine, respectively.
Cell volume was measured in substrate-attached cells with an improved
version of the DISUR technique described in detail previously
[23]. Cells seeded on coverslips were mounted in a custom-made
flow-through imaging chamber and perfused during ~25 min at 1–
2ml/minwith HEPES-buffered isotonicmediumB (B-iso) at 37 °C. Isosmotic
medium (B-iso, ~310 mOsm) was composed of 135 mM NaCl,
5 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 1.3 mM CaCl2, 1.2 mM Na2HPO4, 10mMDglucose,
10 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic
acid (HEPES); pH 7.4, adjusted with NaOH. To trigger swelling, cells
were incubated in hyposmotic medium B (B-hypo, ~180 mOsm) in
which [NaCl] was decreased to 70 mM. Cell shrinkage was caused by
their perfusion with hyperosmotic medium B (B-hyper, 510 mOsm)
contained 200 mM mannitol.
To estimate the relative impact of membrane-bound transporters
and cytoplasmic biogel in volume adjustment, A549 cells were permeabilized
by ~2-min exposure to 5 μg/ml (~4 μM) of digitonin (Sigma-
Aldrich) in intracellular-like solution (ILS, ~304 mOsm) containing
10 mM NaCl, 110 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM Na-ATP, 1 mM EGTA,
11 mM dithiothreitol, 25 imidazole and 10 mM 2-[[1,3-dihydroxy-2-
(hydroxymethyl)propan-2-yl]amino]ethanesulfonic acid (pH 7.1),
followed by washing with digitonin-free ILS. ILS osmolality was attenuated
by decreasing KCl concentration to 70mM(ILS-hypo, ~224mOsm)
and increased by adding 200 mM mannitol (ILS-hyper, ~504 mOsm).
The values of mediumosmolality were calculated as for ideal solutions.
As verified by trypan blue staining, ~90% of A549 cells were permeabilized
by such treatment. In separate experiments, by including
trypan blue at different time points after digitonin treatment, we
found that ~70% of cells remained permeabilized for at least 30 min,
long enough to study the properties of such permeabilized cells.
Because some cells re-sealed their plasma membranes during the 30–
40 min period, trypan blue staining was always undertaken at the end
of each experiment, to verify that they remained permeabilized
throughout the experiment. Cells that failed this test were rejected
from analysis.
3D reconstruction of cell shape was achieved with 2 conventional
microscopy cell images acquired in 2 perpendicular directions. Vertical
mounting of the coverslip permitted visualization of the lateral shape
of the cell of interest close to the lower edge via a ×20 phase contrast
objective. In addition, top-view images of the same cell were recorded
via a second microscope objective (×10) attached to a phototube and
mounted on a mechanical micromanipulator (MX 100; Newport Instruments,
Mississauga, Canada) perpendicularly to the first objective. Sideand
top-view cell images were acquired simultaneously at 10- to 60-s
intervals prior to osmolality challenge and at 5- to 30-s intervals during
the challenge. Images of the cell side-view profile and top view of the
cell base were recorded for 100 ms with two independent miniature
charge-coupled device cameras (Moticam 350; Motic Instruments,
Richmond, BC, Canada) and Motic software at 0.14-lm/pixel and 0.18-
lm/pixel resolutions for side-view and top-view images, respectively.
The images were saved on a hard disk and analyzed off-line by DISUR
technique [22]. This technique generates a set of topographical curves
of the cell surface fromits digitized profile and base outline. Cell volume,
surface and height were calculated fromsuch a reconstructed cell topographical
model. All calculations were made entirely with Mat Lab
(MathWorks, Natick, MA). To visualize the reconstructed cell model in
3D perspective, data obtained with the help of the DISUR technique
were used to generate a 2D matrix containing approximate z coordinates
of points on the membrane surface. The 3D perspective of the
model cellwas then plottedwithMat Lab or ORIGIN(Microcal Software,
Northampton, MA).
Intracellular water volume in cells seeded in 12-well plates was
measured as [14C]-urea available space according to a previouslydescribed
protocol [28] and calculated as V = Ac / Amm, where Ac was
the radioactivity of the cells after incubation with 2 μCi/ml [14C]-urea
(dpm), Am was the radioactivity of the incubation medium (dmp/μl),
and m was protein content in the cell lysate (mg).
To determine cell membrane K+ permeability, 86Rb uptake was
measured in cells growing in 24-well plates, washed twice with
2 ml of medium containing 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2
and 10 mM HEPES-tris buffer (pH 7.4, room temperature) and incubated
for 30 min at 37 °C in 1 ml of B-iso medium. The preincubation
mediumwas then replaced by 0.5ml of the samemediumcontaining
0.5–1 μCi/ml 86RbCl, 10 μM ouabain, 10 μM bumetanide or 1 mM
BaCl2. The osmolality of this medium was decreased by reducing
NaCl concentration. Preliminary experiments demonstrated that
86Rb uptake was linear up to 20 min. This considered, isotope uptake
was terminated in 5min by adding 2 ml of ice-cold medium containing
100 mM MgCl2 and 10 mM HEPES-tris buffer (pH 7.4). The cells
were then transferred on ice, washed 4 times with 2 ml of the same
ice-coldmedium and lysed with 1 ml of 1% SDS/4 mMEDTA mixture.
Radioactivity of the cell lysate was measured with a liquid scintillation
analyzer, and ion uptake was calculated as V = A / amt, where
A was radioactivity in the sample (cpm), a was the specific radioactivity of 86Rb (K+) in the incubation medium, m was protein
content in the sample (mg) and t was incubation time (min).
Na+,K+,2Cl− cotransport activity was quantified as the ouabainresistant,
bumetanide-sensitive component of the 86Rb influx rate.
Previously, we reported that, side-by-side with K+ channels, Ba2+
dose-dependently inhibited Na+,K+,2Cl− cotransport [29]. With
these data in mind, the activity of K+ channels was estimated as
(ouabain + bumetanide)-resistant, Ba2+-sensitive 86Rb influx.
Chemicals were procured from Gibco BRL (Gaithersburg, MO),
Calbiochem (La Jolla, CA), Sigma (St. Louis, MO) and Anachemia (Montreal,
QC, Canada). 86RbCl and [14C]-urea were obtained from
PerkinElmer (Waltham, MA, USA) and Isotope (St. Petersburg

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ปรับเปลี่ยนปอดมนุษย์ carcinoma A549 เซลล์เติบโตในของดุลเบกโกกลางของอีเกิ้ลเสริม ด้วย 10% ครรภ์วัวซีรั่ม2 มม. L glutamine, 50 U/ml ยาเพนนิซิลลิน และ streptomycin μg 100 mlCytoskeleton นี้มี visualized โดยย้อมสีคู่ของแอกติน filamentsและ microtubules สั้น ๆ seeded บน coverslips เซลล์ถูกล้างด้วยน้ำเกลือฟอสเฟต buffered (PBS: 150 มม. NaCl, 5 mM Naphosphateบัฟเฟอร์ pH 7.4), ถาวรกับฟอร์มาลดีไฮด์ 4% ใน PBS สำหรับ10 นาที ล้าง ด้วย PBS, permeabilized ใน 1 นาทีด้วย PBS ประกอบด้วยไตรตั้น 0.5% X 100 ล้าง ด้วย PBS และ incubated สำหรับ h 1 กับโมโนแอนติบอดีต่อต้านอัลฟา tubulin (DM1A) (Aldrich ซิก St. LouisMO) ใน PBS ประกอบด้วย 1% วัว serum albumin (บีเอสเอ) เซลล์ได้แล้วล้าง ด้วย PBS และ microtubules มีสีด้วยFITC กลวงป้องกัน-mouse-IgG แอนติบอดีใน PBS ประกอบด้วย 1% บีเอสเอเซลล์มีสีเห็นภาพ microfilaments และนิวเคลียสAlexa Fluo488 phalloidin และ 4′, 6-diamidino-2-phenylindole ตามลำดับตามที่อธิบายไว้ในรายละเอียดอื่น ๆ [25-27] แอกติน filamentsและ microtubules อยู่ระหว่างสองวัน โดยการรักษา 20-30 นาทีด้วย20 μM cytochalasin B และ vinblastine 10 μM ตามลำดับปริมาตรเซลล์ถูกวัดในแนบพื้นผิวเซลล์ด้วยการปรับปรุงรุ่น DISUR เทคนิคอธิบายในรายละเอียดก่อนหน้านี้[23] เซลล์ seeded ใน coverslips ถูกติดตั้งในการประกอบอาชีพไหลผ่านภาพหอการค้า และ perfused ระหว่าง ~ 25 นาทีที่ 1 –2ml/minwith HEPES buffered isotonicmediumB (B-iso) ที่ 37 องศาเซลเซียส Isosmoticขนาดกลาง (B-iso ~ 310 mOsm) ประกอบด้วย NaCl, 135 มม.5 มม. KCl, MgSO4 มม. 1.2, 1.3 มม. CaCl2, Na2HPO4 1.2 mM, 10mMDglucose10 มม. 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonicกรด (HEPES); ปรับ pH 7.4 กับ NaOH การทำให้เกิดบวม เซลล์incubated ใน hyposmotic B (hypo ภูมิ B, mOsm ~ 180) ใน[NaCl] ที่ถูกลดลงไป 70 มม. การหดตัวของเซลล์ที่เกิดจากของการกำซาบ ด้วยสื่อ hyperosmotic B (B-ไฮเปอร์ 510 mOsm)ประกอบด้วย mannitol 200 mMการประเมินผลกระทบต่อญาติของผู้ผูกกับเมมเบรนและ biogel cytoplasmic ในการปรับระดับ มี permeabilized เซลล์ A5495 μg/ml (~ 4 μM) ของ digitonin (ซิก-ตาม ~ 2 นาทีAldrich) ใน intracellular เช่นโซลูชัน (ILS ~ 304 mOsm) ประกอบด้วย10 มม. NaCl, 110 mM KCl, MgCl2 5 มม. ATP นาการ 1 mM, 1 mM EGTAdithiothreitol 11 มม. การ 25 อิมิดาโซล และ 10 มม. 2- [[1,3-dihydroxy - 2 -(hydroxymethyl) propan-2-yl] อะมิโน] ethanesulfonic กรด (pH 7.1),ตาม ด้วยการล้างกับ ILS digitonin ฟรี ILS osmolality มีไฟฟ้าเคร...โดยการลดความเข้มข้นของ KCl 70 มม. (ILS-hypo ภูมิ, ~ 224mOsm)และเพิ่มขึ้น โดยเพิ่ม mannitol 200 mM (ILS-ไฮเปอร์ mOsm ~ 504)มีคำนวณค่าของ mediumosmolality สำหรับโซลูชั่นที่เหมาะตรวจสอบ โดยการย้อมสี trypan blue, ~ 90% ของเซลล์ A549 ถูก permeabilizedโดยการรักษาดังกล่าว ในการทดลองแยก โดยรวมtrypan blue ณจุดเวลาต่าง ๆ หลังการรักษา digitonin เราพบว่า ยังคงมี ~ 70% ของเซลล์ permeabilized สำหรับอย่างน้อย 30 นาทีนานพอที่จะศึกษาคุณสมบัติของเซลล์เช่น permeabilizedเนื่องจากเซลล์บางปิดผนึกเยื่อหุ้มพลาสมาของพวกเขาอีกครั้งในระหว่าง 30 –ระยะเวลา 40 นาที ย้อมสี trypan blue เสมอดำเนินในตอนท้ายของแต่ละการทดลอง การตรวจสอบว่า พวกเขายังคง permeabilizedทดลอง เซลล์ที่ล้มเหลวในการทดสอบนี้ถูกปฏิเสธจากการวิเคราะห์3D ฟื้นฟูเซลล์รูปร่างสำเร็จ มี 2 แบบภาพเซลล์ microscopy ที่มาในทิศทางตั้งฉาก 2 แนวตั้งติดตั้งของ coverslip สามารถแสดงสถานะของรูปด้านข้างของเซลล์ที่น่าสนใจใกล้กับขอบด้านล่างผ่านการลอก 20 ระยะความคมชัดวัตถุประสงค์ นอกจากนี้ บันทึกรูปภาพด้านบนของเซลล์เดียวกันทางที่สอง วัตถุประสงค์กล้องจุลทรรศน์ (ตาราง 10) กับ phototube การ และติดตั้งบน micromanipulator กล (MX 100 เครื่องมือนิวพอร์ทMississauga แคนาดา) perpendicularly เพื่อวัตถุประสงค์แรก Sideandภาพด้านบนเซลล์ที่มาพร้อมกันที่ 10 - การ 60-sช่วง ก่อนท้าทาย osmolality และ ในช่วง 5 - การ 30-s ระหว่างความท้าทาย รูปโปรไฟล์เซลล์ด้านข้างและมุมมองด้านบนของใบบันทึกสำหรับ ms 100 พร้อมอิสระสองเซลล์พื้นฐานค่าธรรมเนียม–จุอุปกรณ์กล้อง (Moticam 350 เครื่องมือ moticริชมอนด์ BC แคนาดา) และซอฟต์แวร์ Motic 0.14-lm/พิก เซลและ 0.18 -lm/พิก เซลความละเอียดสำหรับมุม มองด้านข้าง และด้านบนภาพ ตามลำดับภาพถูกบันทึกไว้บนฮาร์ดดิสก์ และวิเคราะห์ off-line โดย DISURเทคนิค [22] เทคนิคนี้สร้างชุดของเส้นโค้ง topographicalของเซลล์ ผิว fromits รูปดิจิทัลโปรไฟล์และเค้าร่างฐาน ปริมาตรเซลล์พื้นผิวและความสูงคำนวณได้ fromsuch เซลล์สร้างขึ้นใหม่ topographicalแบบจำลอง คำนวณทั้งหมดที่ทำทั้งหมดกับแล็บพรม(MathWorks, Natick, MA) เห็นภาพรูปแบบเซลล์ที่สร้างขึ้นใหม่ในมุมมอง 3D ข้อมูลที่ได้ โดยใช้เทคนิค DISURใช้ในการสร้างเมตริกซ์ 2 มิติที่ประกอบด้วยพิกัด z โดยประมาณของจุดบนพื้นผิวเมมเบรน มุมมอง 3 มิติของการรุ่น cellwas แล้ว plottedwithMat Lab หรือจุดเริ่มต้น (Microcal ซอฟต์แวร์ณ MA)มีปริมาณน้ำ intracellular ในเซลล์ seeded ในดี 12 แผ่นวัดเป็น [14C] -urea เนื้อที่ตาม previouslydescribedโพรโทคอล [28] และคำนวณเป็น V = Ac / Amm ที่มี Acradioactivity ของเซลล์หลังจากบ่มกับ μCi 2 ml [14C] -ยูเรีย(dpm), กำลังถูก radioactivity กลางคณะทันตแพทยศาสตร์ (dmp/μl),และ m เป็นโปรตีนในการเซลล์ lysate (มิลลิกรัม)กำหนดเซลล์เมมเบรน K + permeability ถูกดูดซับ 86Rbในเซลล์ที่เติบโตในดี 24 แผ่น ล้างสองครั้งด้วย2 ml ของกลางประกอบด้วย 150 มม. NaCl, 1 mM MgCl2, CaCl2 1 มม.และ 10 มม.ทริสเรทติ้ง HEPES บัฟเฟอร์ (pH 7.4 อุณหภูมิห้อง) incubatedใน 30 นาทีที่ 37 ° C ใน 1 มิลลิลิตรของตัวกลาง B-iso Preincubation ที่แล้ว แทนที่ ด้วย 0.5ml ของ samemediumcontaining mediumwas0.5 – 1 86RbCl μCi/ml, 10 μM ouabain, 10 μM บูมีทาไนด์ หรือ 1 mMBaCl2 Osmolality ของกลางนี้ถูกลดลง โดยการลดความเข้มข้นของ NaCl สาธิตทดลองเบื้องต้นที่ดูดซับ 86Rb เส้นขึ้นไป 20 นาทีได้ นี้ถือว่า ดูดซับไอโซโทปถูกยกเลิกใน 5 นาที โดยเพิ่มฉ่ำขนาดบรรจุ 2 mlMgCl2 100 มม.และ 10 มม.ทริสเรทติ้ง HEPES บัฟเฟอร์ (pH 7.4) เซลล์มีการถ่ายโอนแล้วบนน้ำแข็ง ล้าง 4 ครั้ง ด้วย ml 2 ของเดียวกันน้ำแข็ง coldmedium และ lysed กับ ml 1 ส่วนผสม 1% SDS/4 mMEDTARadioactivity เซลล์ lysate ถูกวัด ด้วย scintillation เหลววิเคราะห์ และดูดซับไอออนถูกคำนวณเป็น V = A / amt ที่A ถูก radioactivity ในตัวอย่าง (cpm), การมี radioactivity เฉพาะของ 86Rb (K +) ในการบ่มเพาะวิสาหกิจ m มีโปรตีนเนื้อหาตัวอย่าง (mg) และ t เวลาบ่ม (นาที)Na + K + 2Cl− cotransport กิจกรรมถูก quantified เป็น ouabainresistantส่วนประกอบสำคัญบูมีทาไนด์อัตราอีก 86Rbก่อนหน้านี้ เรารายงานว่า --เคียงข้างพร้อม K + Ba2 +ยา dependently ห้าม Na + K + 2Cl− cotransport [29] มีข้อมูลเหล่านี้ในจิตใจ การ K + ช่องถูกประเมินเป็น(ouabain + บูมีทาไนด์) -ทน Ba2 + -86Rb ที่สำคัญอีกด้วยสารเคมีถูกค้นหาจาก Gibco BRL (Gaithersburg, MO),Calbiochem (La Jolla, CA), ซิก (St. Louis, MO) และ Anachemia (มอนทรีออลQC แคนาดา) 86RbCl และ [14C] -ยูเรียได้รับมาจากPerkinElmer (Waltham, MA สหรัฐอเมริกา) และไอโซโทป (เซนต์ปีเตอร์สเบิร์ก

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

มะเร็งปอดของมนุษย์เซลล์ A549 ถูกปลูกใน Dulbecco
ของการปรับเปลี่ยนขนาดกลางอินทรีเสริมด้วย10% ของทารกในครรภ์ซีรั่มวัว
2 มิลลิ L-glutamine 50 U / ยาปฏิชีวนะมล. และ 100 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร streptomycin.
โครงร่างของเซลล์ได้รับการมองเห็นโดยการย้อมสีสองเท่าของเส้นใยโปรตีนและ microtubules .
สั้น ๆ , เซลล์เมล็ดใน coverslips
ถูกล้างด้วยน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์(พีบีเอส: 150 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ 5 มิลลิ Naphosphate
บัฟเฟอร์ pH 7.4) การแก้ไขด้วยดีไฮด์ 4% ในพีบีเอส
10 นาทีล้างด้วยพีบีเอส permeabilized เวลา 1 นาทีกับพีบีเอส ที่มี
0.5% triton X-100, ล้างด้วยพีบีเอสและบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงกับโมโนโคลนอล
tubulin ต่อต้านอัลฟา (DM1A) แอนติบอดี (Sigma-Aldrich เซนต์หลุยส์
MO) ในพีบีเอสที่มี 1% ซีรั่มอัลบูมิวัว (BSA) เซลล์ที่ถูกล้างแล้วกับพีบีเอสและ microtubules ถูกย้อมด้วยสี FITC-ผันต่อต้านเมาส์ IgG แอนติบอดีในพีบีเอสที่มี 1% BSA. เพื่อให้เห็นภาพ microfilaments และนิวเคลียสเซลล์มีการย้อมด้วยphalloidin Alexa Fluo488 และ 4 ', 6 diamidino-2-phenylindole ตามลำดับตามที่อธิบายไว้ในรายละเอียดอื่นๆ [25-27] เส้นใยโปรตีนและ microtubules กระจัดกระจายโดยการรักษาประมาณ 20-30 นาทีกับ 20 ไมครอน cytochalasin B และ 10 ไมครอน vinblastine ตามลำดับ. ปริมาณเซลล์วัดในเซลล์ตั้งต้นที่แนบมาพร้อมกับการปรับปรุงรุ่นของเทคนิค DISUR ที่อธิบายไว้ในรายละเอียดก่อนหน้านี้ [23] เซลล์ในเมล็ด coverslips ถูกติดตั้งในที่กำหนดเองทำห้องถ่ายภาพการไหลผ่านและperfused ~ ในช่วง 25 นาทีที่ 1- 2ml / minwith HEPES บัฟเฟอร์ isotonicmediumB (B-ISO) ที่ 37 ° C Isosmotic กลาง (B-ISO, ~ 310 mOsm) ประกอบด้วย 135 มิลลิโซเดียมคลอไรด์, 5 มิลลิ KCl 1.2 มิลลิ MgSO4 1.3 มิลลิ CaCl2 1.2 มิลลิ Na2HPO4, 10mMDglucose, 10 มิลลิ 2- [4 (2-hydroxyethyl) piperazin- 1-YL] ethanesulfonic กรด (HEPES); ค่า pH 7.4 ปรับได้ด้วย NaOH ที่จะเรียกบวมเซลล์ถูกบ่มใน hyposmotic กลาง B (B-สำหรับผู้ที่ ~ 180 mOsm) ในที่[โซเดียมคลอไรด์] ลดลงถึง 70 มิลลิ การหดตัวของเซลล์ที่เกิดจากเลือดไปเลี้ยงของพวกเขาที่มีขนาดกลาง B hyperosmotic (B-ไฮเปอร์ 510 mOsm) ที่มีอยู่ 200 มิลลิแมนนิทอล. เพื่อประเมินผลกระทบต่อความสัมพันธ์ของการขนส่งที่ถูกผูกไว้เยื่อและ biogel นิวเคลียสในการปรับระดับเสียงเซลล์ A549 ถูก permeabilized โดย ~ 2 นาที การสัมผัสกับ 5 ไมโครกรัม / มล. (~ 4 ไมครอน) ของ digitonin (Sigma- ดิช) ในการแก้ปัญหาภายในเซลล์เหมือน (ILS ~ 304 mOsm) ที่มี10 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ 110 มิลลิ KCl 5 มิลลิ MgCl2 1 มิลลินาเอทีพี 1 มิลลิ EGTA, 11 มิลลิ dithiothreitol 25 imidazole และ 10 มิลลิ 2 - [[1,3-dihydroxy-2- (hydroxymethyl) โพรเพน-2-YL] อะมิโน] ethanesulfonic กรด (pH 7.1) ตามด้วยการล้างด้วย digitonin ฟรี ILS . ILS osmolality ถูกยับยั้งโดยการลดความเข้มข้นของโพแทสเซียมคลอไรด์เพื่อ70mm (ILS-สำหรับผู้ ~ 224mOsm) และเพิ่มขึ้นโดยการเพิ่ม mannitol มิลลิ 200 (ILS-ไฮเปอร์ ~ 504 mOsm). ค่าของ mediumosmolality ถูกคำนวณเป็นโซลูชั่นที่เหมาะ. ในฐานะที่ตรวจสอบโดย Trypan การย้อมสีฟ้า ~ 90% ของเซลล์ A549 ถูก permeabilized โดยการรักษาดังกล่าว ในการทดลองที่แยกจากกันโดยรวมทั้งสีฟ้า Trypan ที่จุดเวลาที่แตกต่างกันหลังจาก digitonin รักษาเราพบว่า~ 70% ของเซลล์ยังคง permeabilized เวลาอย่างน้อย 30 นาทีนานพอที่จะศึกษาคุณสมบัติของเซลล์permeabilized ดังกล่าว. เพราะบางเซลล์ใหม่ที่ปิดสนิทของพวกเขา เยื่อหุ้มพลาสม่าในช่วง 30- 40 นาทีระยะเวลาที่ย้อมสีฟ้า Trypan ได้ดำเนินการเสมอในตอนท้ายของการทดสอบแต่ละครั้งเพื่อตรวจสอบว่าพวกเขายังคงpermeabilized ตลอดการทดลอง เซลล์ที่ล้มเหลวในการทดสอบนี้ถูกปฏิเสธจากการวิเคราะห์. ฟื้นฟู 3 มิติของรูปทรงมือถือก็ประสบความสำเร็จกับการชุมนุม 2 ภาพเซลล์กล้องจุลทรรศน์มาใน 2 ทิศทางตั้งฉาก แนวตั้งติดตั้งของ coverslip ที่ได้รับอนุญาตภาพของรูปทรงด้านข้างของมือถือที่น่าสนใจใกล้เคียงกับขอบล่างผ่าน× 20 ระยะทางตรงกันข้ามวัตถุประสงค์ นอกจากนี้ภาพมุมมองด้านบนของเซลล์เดียวกันถูกบันทึกไว้ผ่านทางกล้องจุลทรรศน์วัตถุประสงค์ที่สอง (× 10) ที่แนบมากับ phototube และติดตั้งอยู่บนmicromanipulator กล (MX 100 นิวพอร์ตเครื่องดนตรี, Mississauga, แคนาดา) ตั้งฉากกับวัตถุประสงค์แรก Sideand ภาพเซลล์มุมมองด้านบนที่ได้มาพร้อมกันที่ 10- 60 วินาทีช่วงเวลาก่อนที่จะมีความท้าทายและosmolality ที่ 5 เพื่อช่วงเวลา 30 วินาทีในช่วงที่ท้าทาย ภาพรายละเอียดด้านข้างมือถือและมุมมองด้านบนของฐานมือถือที่ถูกบันทึกไว้ 100 มิลลิวินาทีที่มีสองขนาดเล็กที่เป็นอิสระเสียค่าใช้จ่ายควบคู่กล้องอุปกรณ์(Moticam 350; MOTIC เครื่องมือ, Richmond, BC, แคนาดา) และซอฟต์แวร์ MOTIC ที่ 0.14-LM / พิกเซลและ 0.18- LM / มติพิกเซลสำหรับด้านข้างและภาพมุมมองด้านบนตามลำดับ. ภาพที่ถูกบันทึกไว้บนฮาร์ดดิสก์และวิเคราะห์แบบ off-line โดย DISUR เทคนิค [22] เทคนิคนี้จะสร้างชุดของเส้นโค้งภูมิประเทศของเซลล์ผิว fromits รายละเอียดดิจิตอลและร่างฐาน ปริมาณเซลล์ผิวและความสูงจะถูกคำนวณ fromsuch เซลล์ใหม่ภูมิประเทศรูปแบบ การคำนวณทั้งหมดถูกสร้างขึ้นทั้งหมดด้วยจ้าแล็บ(MathWorks, เนติ, MA) เพื่อให้มองเห็นรูปแบบมือถือใหม่ในมุมมอง 3 มิติข้อมูลที่ได้ด้วยความช่วยเหลือของเทคนิค DISUR ที่ถูกนำมาใช้ในการสร้างเมทริกซ์2D ที่มีประมาณพิกัดซีของจุดบนพื้นผิวเมมเบรน มุมมอง 3 มิติของรูปแบบcellwas แล้ว plottedwithMat Lab หรือ ORIGIN (Microcal ซอฟท์แวNorthampton, MA). ปริมาณน้ำภายในเซลล์ในเซลล์เมล็ดในแผ่น 12 ดีได้รับการวัด[14C] -urea พื้นที่ว่างตาม previouslydescribed โปรโตคอล [28] และคำนวณเป็น V = Ac / Amm ที่ Ac เป็นกัมมันตภาพรังสีของเซลล์หลังจากบ่ม2 μCi / ml [14C] -urea (DPM) Am เป็นกัมมันตภาพรังสีของสื่อการบ่ม (DMP / ไมโครลิตร) และ m เป็น ปริมาณโปรตีนใน lysate เซลล์ (มก.) เพื่อตรวจสอบเซลล์เมมเบรนซึมผ่าน K + การดูดซึม 86Rb ถูกวัดในเซลล์ที่เพิ่มขึ้นในแผ่น24 หลุมล้างครั้งที่สองมี2 มิลลิลิตรของกลางที่มี 150 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ 1 มิลลิ MgCl2 1 มิลลิ CaCl2 และ 10 มิลลิบัฟเฟอร์ HEPES-tris (pH 7.4 อุณหภูมิห้อง) และบ่มเป็นเวลา30 นาทีที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสใน 1 มิลลิลิตรของกลาง B-ISO preincubation mediumwas แทนที่ด้วย 0.5ml ของ samemediumcontaining 0.5-1 μCi / ml 86RbCl 10 ไมครอน ouabain 10 ไมครอน bumetanide หรือ 1 มิลลิBaCl2 osmolality ของสื่อนี้ลดลงโดยการลดความเข้มข้นของโซเดียมคลอไรด์ การทดลองเบื้องต้นแสดงให้เห็นว่าการดูดซึม 86Rb เชิงเส้นได้ถึง 20 นาที นี้พิจารณาการดูดซึมไอโซโทปถูกยกเลิกใน 5 นาทีโดยการเพิ่ม 2 มิลลิลิตรของกลางเย็นที่มี 100 มิลลิ MgCl2 และ 10 มิลลิบัฟเฟอร์ HEPES-tris (pH 7.4) เซลล์ที่ได้รับการโอนแล้วบนน้ำแข็งล้างครั้งที่ 4 มี 2 มิลลิลิตรเดียวกันน้ำแข็งcoldmedium และ lysed 1 มิลลิลิตร 1% SDS / 4 ส่วนผสม mMEDTA. กัมมันตภาพรังสีของ lysate เซลล์วัดด้วยประกายของเหลววิเคราะห์และการดูดซึมไอออนที่คำนวณได้เป็น V = A / amt ที่ถูกกัมมันตภาพรังสีในตัวอย่าง (CPM) ซึ่งเป็นเป็นกัมมันตภาพรังสีที่เฉพาะเจาะจงของ 86Rb (K +) ในสื่อบ่มเมตรเป็นโปรตีนเนื้อหาในตัวอย่าง(มก.) และเสื้อถูกเวลาฟักตัว (นาที). Na + K + 2Cl- กิจกรรม cotransport ถูกวัดเป็น ouabainresistant ที่องค์ประกอบbumetanide ที่มีความอ่อนไหวของอัตราการไหลบ่าเข้ามา 86Rb. ก่อนหน้านี้เรามีรายงานว่าด้านข้างกับ K + ช่อง Ba2 + ยา dependently ยับยั้ง Na + K + 2Cl- cotransport [29] ด้วยข้อมูลเหล่านี้ในใจการทำงานของ K ช่อง + ถูกประมาณ (ouabain + bumetanide) -resistant, Ba2 + -sensitive ไหลบ่าเข้ามา 86Rb. สารเคมีที่ถูกจัดหาจาก Gibco BRL (Gaithersburg, MO) Calbiochem (La Jolla, CA) ซิกม่า ( เซนต์หลุยส์) และ Anachemia (Montreal, QC, Canada) 86RbCl และ [14C] -urea ที่ได้รับจากPerkinElmer (วอลแทม, MA, USA) และไอโซโทป (เซนต์ปีเตอร์เบิร์ก

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

a549 เซลล์มะเร็งปอดของมนุษย์เติบโตในดัลเบโค่การ
นกอินทรีเติม 10% fetal bovine serum , Glutamine
2 mm , 50 U / ml เพนนิซิลินและ 100 μ g / ml สเตรปโตมัยซิน .
ขาดตอนเป็นภาพคู่และการย้อมสีของเครื่องปรับ
เส้นใย . สั้น ๆ , เซลล์เมล็ดใน coverslips ถูกล้างด้วยน้ำเกลือ ( ฟอสเฟตบัฟเฟอร์
PBS : 150 mM NaCl และบัฟเฟอร์ naphosphate
5 มิลลิเมตรpH 7.4 ) , แก้ไขด้วย 4% ฟอร์มาลดีไฮด์ใน PBS สำหรับ
10 นาที ล้างด้วย permeabilized พีบีเอส 1 นาทีกับ PBS ที่มี
0.5% Triton X-100 , ล้างด้วย pbs บ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมง กับโมโนโคลนอล
ทูบูลินต่อต้านอัลฟ่า ( dm1a ) แอนติบอดี ( ซิกม่า Aldrich เซนต์หลุยส์ ,
โม ) ในช่องที่มี ซีรั่มอัลบูมิวัว 1 % ( BSA ) เซลล์
) จากนั้นล้างด้วย pbs , และเส้นใยถูกย้อมด้วย
fitc แอนติบอดี IgG conjugated ป้องกันเมาส์ในช่องที่ 1 % BSA .
เห็นไมโครฟิลาเมนท์และนิวเคลียส เซลล์ก็เปื้อน
Alexa fluo488 phalloidin และ 4 นั้น 6-diamidino-2-phenylindole )
, ตามที่อธิบายไว้ในรายละเอียดอื่น ๆ 27 – [ 25 ] เครื่องปรับและถูกรบกวนจากเส้นใย
20 – 30 นาที การรักษาด้วย
20 μ M cytochalasin B 10 วินบลาสทีน , m
μตามลำดับวัดสูงปริมาณเซลล์ต่อเซลล์ที่มีการปรับปรุง
รุ่นของ disur เทคนิคอธิบายไว้ในรายละเอียดก่อนหน้านี้
[ 23 ] เซลล์เมล็ดใน coverslips ติดใน custom-made
flow-through ภาพห้องหนูตอน ~ 25 นาทีที่ 1 –
2ml / minwith ฮีเปสใน isotonicmediumb ( b-iso ) ที่อุณหภูมิ 37 องศา isosmotic
ขนาดกลาง ( b-iso ~ 310 mOsm ) ประกอบด้วยขนาด 135 มม.
5 mM KCl 12 มม. MgSO4 ใ CaCl2 , 1.3 มม. 1.2 มม. na2hpo4 10mmdglucose
, , 10 มิล 2 - [ 4 - ( 2-hydroxyethyl ) piperazin-1-yl ] ethanesulfonic
acid ( ฮีเปส ) ; pH 7.4 ปรับด้วย NaOH กระตุ้นเซลล์บวม มี hyposmotic medium B
) ( b-hypo ~ 180 mOsm )
[ เกลือ ] ซึ่งลดลงถึง 70 มิลลิเมตร การหดตัวที่เกิดจากเซลล์ที่ผ่านการแช่ในวัคซีน
กับ medium B ( b-hyper 510 mOsm )

มี 5 200 mm .การประมาณการผลกระทบของญาติและมีผู้พบใน
ที่มีการปรับระดับเสียง a549 cells , permeabilized
~ 2-min แสง 5 μ g / ml ( ~ 4 μ m ) ของดิจิโทนิน ( ซิกมา - อัลดริช
) ภายใน เช่น โซลูชั่น ( ILS ) 304 mOsm ) ที่มี NaCl KCl 110
10 มิลลิเมตร , อืม ชุด 5 มิล 1 มิลนา เอทีพี หน่วย , 1 มม.
บัตรแข็ง 11 มม. 10 มม. และ 25 อิมิดาโซล 2 - [ [ 1,3-dihydroxy-2 -
( ซี ) propan-2-yl ] ] ethanesulfonic อะมิโนกรด ( pH 7.1 )
ตามด้วยล้างด้วยดิจิโทนินในฟรี ในการลดปริมาณค่าออส
โดยความเข้มข้น 70mm ( ILS ภายใต้ ~
224mosm ) และเพิ่มขึ้น โดยเพิ่ม 200 มม. 5 ( ในไฮเปอร์ ~ 504 mOsm ) .
ค่า mediumosmolality คำนวณที่เหมาะโซลูชั่น .
เป็นตรวจสอบโดยไตรแพนสีฟ้าการย้อมสี~ 90% ของ a549 cells permeabilized
โดยการรักษาดังกล่าว ในการทดลองแยกโดยจุดที่เวลาต่าง ๆรวมทั้ง
ไตรแพนดิจิโทนินสีฟ้าหลังการรักษาพบว่าเรา
~ 70% เซลล์ยังคง permeabilized อย่างน้อย 30 นาที
นานพอที่จะศึกษาคุณสมบัติของ permeabilized เซลล์ เพราะเซลล์บางเซลล์จะปิดผนึก
เมมเบรนพลาสม่าในระหว่าง 30 –
40 นาทีระยะเวลาไตรแพนสีฟ้าย้อมเสมอดำเนินการในที่สุด
ของแต่ละการทดลองเพื่อตรวจสอบว่าพวกเขายังคง permeabilized
ตลอดการทดลอง เซลล์ที่ไม่ผ่านการทดสอบนี้ถูกปฏิเสธ

3D จากการวิเคราะห์ การฟื้นฟูเซลล์รูปร่างเท่ากับ 2 ปกติ
กล้องจุลทรรศน์รูปภาพเซลล์ที่ได้มาใน 2 ทิศทางตั้งฉาก
ตามแนวตั้งการติดตั้งของปิดสไลด์ด้านข้างได้รับอนุญาตการพัฒนารูปร่าง
ของเซลล์ที่น่าสนใจใกล้ขอบล่างผ่าน× 20 สำปั้น
วัตถุประสงค์ นอกจากนี้ มุมมองด้านบนภาพเซลล์เดียวกันได้ถูกบันทึกไว้
ผ่านวัตถุประสงค์กล้องจุลทรรศน์ที่สอง ( × 10 ) ติดกับ phototube และ
ติด micromanipulator กล ( MX 100 ; Newport 2
Mississauga ,แคนาดา ) ดิ่งสู่เป้าหมายแรก sideand
ด้านบนดูรูปภาพเซลล์ได้มาพร้อมกัน 10 - 60-s
ช่วงเวลาก่อนที่จะท้าทายและค่าออสโมลาลิตี้ที่ 5 - 30-s ช่วงเวลาระหว่าง
ท้าทาย ภาพของเซลล์มุมมองโปรไฟล์และมุมมองด้านบนของ
เซลล์ฐานบันทึก 100 ms กับสองอิสระขนาดเล็ก
ชาร์จคู่กล้องอุปกรณ์ ( moticam 350 ;
motic เครื่องมือริชมอนด์ , BC , แคนาดา ) และ motic และซอฟต์แวร์ที่ 0.14-lm/pixel 0.18 -
LM / พิกเซลความละเอียดสำหรับวิวภาพมุมมองด้านบนตามลำดับ
ภาพที่บันทึกไว้บนฮาร์ดดิสก์แบบออฟไลน์โดยใช้เทคนิค disur
[ 22 ] เทคนิคนี้จะสร้างชุดของภูมิประเทศเส้นโค้ง
ของผิวเซลล์ fromits ดิจิทัลโปรไฟล์และเค้าร่างพื้นฐาน
ปริมาณเซลล์พื้นผิวและความสูงได้ fromsuch ทำขึ้นใหม่เซลล์ภูมิประเทศ
นางแบบ การคำนวณทั้งหมดถูกทำทั้งหมดด้วย
แล็บ ( แมธเวิร์คส์ นาติค , เสื่อ , MA ) เห็นภาพที่สร้างเซลล์ในรูปแบบ
มุมมอง 3D , ข้อมูลด้วยความช่วยเหลือของ disur เทคนิค
ถูกใช้เพื่อสร้าง 2D เมตริกซ์ที่มีพิกัดโดยประมาณ Z
ของจุดบนพื้นผิวของเยื่อแผ่น3 มิติมุมมองของ
cellwas แล้ว plottedwithmat Lab หรือรูปแบบของ microcal ซอฟต์แวร์
Northampton , MA ) ปริมาณน้ำภายในเซลล์ในเซลล์เมล็ด

12 ดีจานเป็นวัดเป็น [ 14c ] - ยูเรียที่ว่างจากการ previouslydescribed
โปรโตคอล [ 28 ] และคำนวณเป็น V = AC / AMM , ที่ AC คือ
กัมมันตภาพรังสีของเซลล์หลังจากบ่มด้วย 2 μ CI / ml 14c ] - [ +
( DPM )คือเป็นการบ่มเพาะขนาดกลาง ( DMP / μ L )
และ M คือปริมาณโปรตีนในเซลล์ lysate ( mg )
ศึกษาการซึมผ่านเซลล์เยื่อ 86rb K ,
วัดในการเป็นเซลล์เติบโตใน 24 ด้วยแผ่นล้างสองครั้งกับ
2 มิลลิลิตรของอาหารที่มีเกลือโซเดียมคลอไรด์ 150 มม. ชุด 1 มิลลิเมตร 1 มม. และ 10 มม. ผลิต
ฮีเปสทริสบัฟเฟอร์ ( ห้อง pH 7.4 ที่อุณหภูมิบ่ม
) และ30 นาทีที่ 37 ° C ใน 1 มิลลิลิตร b-iso ปานกลาง ที่พบใน
mediumwas แล้วแทนที่ด้วย 0.5ml ของ samemediumcontaining
0.5 – 1 μ CI / ml 86rbcl 10 μ M การ 10 μ M ลูซิอาโน เบคคิโอ หรือ bacl2 1 มม

ค่าของสื่อประเภทนี้ลดลง โดยการลด
ความเข้มข้นของเกลือ การทดลองเบื้องต้นพบว่า
86rb การดูดซึมเป็นเส้นตรงไป 20 นาที นี้ถือว่าการ
ไอโซโทปถูกยกเลิกใน 5 นาที โดยการเพิ่ม 2 ml เย็นขนาดกลางที่มี 100 มม. และ 10 มม.
ชุดฮีเปสทริสบัฟเฟอร์ pH 7.4 ) เซลล์
แล้วโอนบนน้ำแข็ง ล้าง 4 ครั้ง มี 2 ml ของ coldmedium น้ำแข็งเหมือนกัน
lysed 1 มิลลิลิตร และ 1% SDS / 4 mmedta ส่วนผสม .
กัมมันตภาพรังสีของเซลล์ lysate วัดด้วยประกาย
ของเหลวและการคำนวณ วิเคราะห์ไอออนเป็น V = / คู่ขาที่
พบกัมมันตภาพรังสีในตัวอย่าง ( CPM ) , มีกัมมันตภาพรังสีที่เฉพาะเจาะจงของ 86rb ( K ) ในบ่มกลาง , M คือปริมาณโปรตีน
ในตัวอย่าง ( มก. ) และ t คือเวลาในการบ่ม ( มิน )
Na , K , 2cl −การประกวดความงามกิจกรรมวัดเป็น ouabainresistant
ลูซิอาโน เบคคิโอ , อ่อนไหว ส่วนประกอบ อัตราการไหลของ 86rb .
ก่อนหน้านี้เรารายงานว่า เคียงข้างกับ ba2
K ช่องขนาด dependently ยับยั้ง Na , K , 2cl −การประกวดความงาม [ 29 ] กับ
ข้อมูลเหล่านี้ในใจ , กิจกรรมของ K ช่องประมาณเป็น
( การลูซิอาโน เบคคิโอ ) - ป้องกัน ba2 - อ่อนไหว 86rb การหลั่งไหล .
เคมีถูกจัดหาจาก gibco BRL ( Gaithersburg โม ) ,
calbiochem ( La Jolla , CA ) , Sigma ( St . Louis , MO ) และแคนาดา ( มอนทรีออ
QC , แคนาดา ) 86rbcl และ [ 14c ] - ยูเรียได้จาก
Perkinelmer ( Waltham ,MA , USA ) และไอโซโทป ( เซนต์ปีเตอร์สเบิร์ก