As shown in รูป 17 (ค่าเฉลี่ย ± SD)

As shown in รูป 17 (ค่าเฉลี่ย ± SD), the combination of ไคเมริก ฮิวเมน
IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 (hu20E5) at 2.5 and 25 Rg/mL (or at lower concentrations; data not shown) with ฮิวเมน OX4OL at 0.1 and 1.0 gg/mL (or at lower concentrations; data not shown) did not demonstrate any reciprocal (i.e.,
synergistic หรือ additive, หรือ even inhibitory) effects on การเพิ่มจำนวน in PHA-
stimulated T ลิมโฟไซต์ ที่แสดงออก ฮิวเมน CD134 .
(c). การเพิ่มจำนวน of แอนติ-ฮิวเมน CD3/แอนติ-ฮิวเมน CD28 antibody stimulator beads-
5 stimulated T ลิมโฟไซต์ ที่แสดงออก ฮิวเมน CD134 after treatment with ไคเมริก
ฮิวเมน IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 20E5
ฮิวเมน peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy donors
(informed consent) were isolated by density centrifugation on Lymphoprep (1.077
g/mL; Nycomed). Subsequently, PBMC were seeded at 0.1x106cells/100 p.L/well
10 (i.e., 1x106 cells/mL) in 96-wells flat-bottom plates (Corning) in RPMI-1640 culture
medium (Gibco) containing 10% fetal calf serum (Bodinco) and 50 lig/mL
เจนทาไมซิน (Gibco), and were stimulated with mouse แอนติ-ฮิวเมน CD3/mouse แอนติ-
ฮิวเมน CD28 antibody stimulator beads (CD3/CD28 beads; Invitrogen) at 1 bead/2
cells in the absence หรือ presence of 25 U/mL รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน อินเตอร์ลิวคิน-2
15 (PeproTech) at 37°C/5% CO2. After 1 day หรือ after 2 days, these (minus and plus
อินเตอร์ลิวคิน-2) CD3/CD28 beads-stimulated ฮิวเมน CD134 expressing T
ลิมโฟไซต์ were exposed to 25.0 p.g/mL ไคเมริก ฮิวเมน IgG4k. แอนติ-ฮิวเมน
CD134 antibody clone 20E5 หรือ to 1.0 gg/mL โพลีฮิสทิดีน-tagged รีคอมบิแนนต์
ฮิวเมน OX4OL (in the presence of 1:5 molar ratio mouse แอนติ-polyhistithne
20 antibody; R&D Systems) at 37°C/5% CO2 for 6 days หรือ for 5 days, ตามลำดับ.
Cells, which were initially stimulated with combination of CD3/CD28 beads plus
รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน อินเตอร์ลิวคิน-2, were re-stimulated 1 day prior to cell
การเพิ่มจำนวน measurements with 25 U/mL of รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน อินเตอร์ลิวคิน-2.
After 6 days หรือ after 5 days exposure to ไคเมริก ฮิวเมน IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 25 antibody clone 20E5 หรือ to ฮิวเมน OX4OL, cell การเพิ่มจำนวน was measured using the
colorimetric (BrdU incorporation) Cell การเพิ่มจำนวน ELISATM (Roche) and an
ELISATMreader (BioRad) at A450 nm.
As shown in รูป 18 (ค่าเฉลี่ย ± SD, n=3 using one donor), although
CD3/CD28 stimulator beads alone induced considerable การเพิ่มจำนวน in ฮิวเมน
30 CD134 expressing T ลิมโฟไซต์ (i.e., medium), ไคเมริก ฮิวเมน IgG4k แอนติ-
ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 (hu20E5) and ฮิวเมน OX40L induced
additional การเพิ่มจำนวน in CD3/CD28 beads-stimulated T ลิมโฟไซต์ ที่แสดงออก ฮิวเมน CD134 . Addition of อินเตอร์ลิวคิน-2 only seemed to enhance basal (i.e., medium)
การเพิ่มจำนวน in CD3/CD28 beads-stimulated T ลิมโฟไซต์ ที่แสดงออก ฮิวเมน CD134 .


(d). Immunostimulatory responses in rhesus macaque monkeys after
5 treatment with ฮิวเมน (ไคเมริก) แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibodies clones 12H3 and
20E5
Non-ฮิวเมน primates rhesus macaque monkeys may be immunized with the simian immunodeficiency virus protein, gp130, as described by Weinberg et al. (J Immunother 2006; 29: 575-585).
10 The draining lymph nodes from immunized monkeys treated with with
ฮิวเมน (e.g., ไคเมริก หรือ ฮิวเมไนซ์ หรือ deimmunized; e.g., subclass ฮิวเมน IgG1 หรือ IgG4) แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibodies clones 12H3 and 20E5 are expected to show enlarged lymph nodes compared with control immunized monkeys. Animals
treated with mouse หรือ ฮิวเมไนซ์ 12H3 หรือ 20E5 antibodies are expected to show 15 increased gp130-specific antibody titres, and increased long-lived T-เซลล์ responses,
compared with controls. There should be no overt signs of toxicity in the treated
monkeys.
Example 8. Characterization of ฮิวเมน CD134 domains and เอพิโทป recognized 20 by mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clones 12H3 and 20E5

(a). Binding of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibodies clones 12H3 and 20E5 with non-reduced and reduced รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy fusion protein (western blotting).
25 Thirteen hundred หรือ 650 ng/lane (for Coomassie brilliant blue staining) or
250 ng/lane (for western blotting) รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy (IgG1) fusion protein (R&D Systems) was electrophorized using 4-12% Tris-Bis gels and MOPS running buffer (Invitrogen) under a variety of non-reducing and reducing
conditions (see รูป 19-A) in pre cast LDS-PAGE denaturing electrophoresis
30 NuPage® Novex® system. Then, รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy fusion
protein was either stained with Coomassie brilliant blue (BioRad) หรือ electro-blotted onto a polyvinylidene fluoride (PDVF) transfer membrane (Millipore). After
blocking with PBS/0.05% Tween 20/1% BSA fraction V (Roche) for 20 min at RT,
PDVF membranes were incubated with 100 ng/mL mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134
โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 หรือ 20E5 for 1 hour at RT. In parallel, 100 ng/mL
mouse IgGlx ไอโซไทป์ control antibody (BD Biosciences) was used as a เนกาทีฟ
5 control. After extensive washing in PBS/0.05% Tween 20, binding of mouse แอนติ-
ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 หรือ 20E5 was determined with
1:5000 diluted horseradish peroxidase-conjugated goat แอนติ-mouse Fcy-specific
antibodies (Jackson ImmunoResearch) for 1 hour at RT, followed by a ready-to-use
สารละลาย of TMB substrate (Sigma) for colorimetric detection.
10 As shown in รูป 19-B, รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy fusion
protein under non reducing (and LDS denaturing without and with heat
denaturing, condition a and b, ตามลำดับ) conditions demonstrated a molecular
mass of 7z130-140 kDa. Non-reduction without heating (condition a) showed two
bands at close proximity, which suggested that a fraction of รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน 15 CD134:ฮิวเมน Fcy fusion protein was incompletely denatured/unfolded. Non-
reduction with heating (condition b) showed one band, which suggested that
รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy fusion protein was completely
denatured/unfolded. รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy fusion protein under
reducing (and LDS denaturing without and with heat denaturing, condition c and 20 d, ตามลำดับ) conditions resulted in bands at 7410 kDa (condition c) and at �60-
65 kDa (condition d). Former observation suggested incomplete reduction of
รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy fusion protein, and latter observation suggested complete reduction/breakage of disulfide bridges joining two ฮิวเมน IgGl-derived Fey-fragments within each รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy
25 fusion protein molecule.
As shown in รูป 19-C, both mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibodies clone 12H3 and clone 20E5 recognized รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy fusion protein under non-reducing (and LDS denaturing without and with heat
denaturing, condition a and b, ตามลำดับ) conditions at predominantly 2130 kDa. 30 In contrast, mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 showed only a slight
binding with รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy fusion protein under reducing
(and LDS denaturing without and with heat denaturing, condition c and d,
ตามลำดับ) conditions, whereas mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 showed a strong binding to รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy fusion protein under reducing (and LDS denaturing without and with heat denaturing, condition c and d, ตามลำดับ) conditions.
These results demonstrated that mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibodies clone 5 12H3 and clone 20E5 specifically recognized ฮิวเมน CD134. Furthermore, these
results demonstrated that mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibodies clone 12H3 and
clone 20E5 seemed to recognize dissimilar ฮิวเมน CD134 เอพิโทป, which คือ
evidenced by respective slight binding (clone 12H3) vs. strong binding (clone 20E5)
with รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy fusion protein under reducing (and 10 LDS denaturing with and without heat denaturing) conditions. These results
suggested that mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 recognized an
เอพิโทป on ฮิวเมน CD134, which คือ not sensitive to denaturation (LDS and heat
treatment) and sensitive to reduction (i.e., breakage of disulphide bridge(s) - most
likely, ซิสเทอีน-rich domains (CRD)-related - by DTT). These results suggested that 15 mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 recognized an เอพิโทป on ฮิวเมน
CD134, which คือ not sensitive to denaturation (LDS and heat treatment) and not
sensitive to reduction (i.e., breakage of disulphide bridge(s) - most likely, CRD-
related - by DTT).


20 (b). Binding of mouse แอนต

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ดังแสดงในรูปที่ 17 (ค่าเฉลี่ย± SD), ชุดไคเมริกฮิวเมนIgG4K แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 (hu20E5) ที่ 2.5 และ 25 Rg/mL (หรือที่ความเข้มข้นต่ำ ข้อมูลไม่แสดง) กับฮิวเมน OX4OL ที่ 0.1 และ gg 1.0 mL (หรือที่ความเข้มข้นต่ำ ข้อมูลไม่แสดง) ได้ไม่แสดงใด ๆ ซึ่งกันและกัน (เช่นพลังหรือ additive หรือแม้แต่ลิปกลอสไข) ผลการเพิ่มจำนวนในพระ -T ลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมนถูกกระตุ้น CD134(ค) . การเพิ่มจำนวนแอนติฮิวเมน CD28 CD3 แอนติ-ฮิวเมนแอนติบอดีเครื่องกระตุ้นเม็ด-5 ถูกกระตุ้น T ลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน CD134 หลังจากรักษาด้วยไคเมริก ฮิวเมน IgG4k แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5อุปกรณ์ต่อพ่วงฮิวเมนเลือดเซลล์ mononuclear (PBMC) จากผู้บริจาคมีสุขภาพดี (แจ้งความยินยอม) ได้แบ่งแยก centrifugation ความหนาแน่นบน Lymphoprep (1.077 g/mL Nycomed) ในเวลาต่อมา ถูก seeded PBMC ที่ p.L/well 0.1x106cells/100 10 (เช่น 1 x 106 เซลล์/มล.) ในบ่อ 96 ล่างแบนแผ่น (คอร์นทำ) ใน RPMI 1640 วัฒนธรรม ปานกลาง (Gibco) ประกอบด้วย 10% ลูกครรภ์เซรั่ม (Bodinco) และ lig 50 mL เจนทาไมซิน (Gibco), และขาวกระตุ้นกับเมาส์แอนติฮิวเมน CD3/เมาส์ แอนติ - เครื่องกระตุ้นแอนติบอดี CD28 ฮิวเมนลูกปัด (ลูกปัด CD3/CD28 Invitrogen) ที่ลูกปัด 1/2 เซลล์ในสถานะหรือขาด 25 U/mL รีคอมบิแนนต์ฮิวเมนอินเตอร์ลิวคิน-2 15 (PeproTech) ที่ 37°C/5% CO2 หลังจาก 1 วันหรือหลัง 2 วัน เหล่านี้ (ลบ และ บวก อินเตอร์ลิวคิน-2) CD3/CD28 ถูกกระตุ้นประคำฮิวเมน CD134 แสดง T ลิมโฟไซต์ถูกสัมผัสกับ 25.0 p.g/mL ไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีหรือโคลน 20E5 กับ gg/mL แท็กโพลีฮิสทิดีนรีคอมบิแนนต์ 1.0 ฮิวเมน OX4OL (ในต่อหน้าของเมาส์ 1:5 อัตราส่วนสบแอนติ-polyhistithne แอนติบอดีที่ 20 R & D ระบบ) ที่ 37°C/5% CO2 สำหรับ 6 วันหรือ 5 วัน ตามลำดับ เซลล์ ซึ่งได้เริ่มถูกกระตุ้น ด้วยชุดของลูกปัด CD3/CD28 บวก รีคอมบิแนนต์ฮิวเมนอินเตอร์ลิวคิน-2 ได้ถูกกระตุ้นอีก 1 วันก่อนเซลล์ การเพิ่มจำนวนการประเมินกับ 25 U mL รีคอมบิแนนต์ฮิวเมนอินเตอร์ลิวคิน-2 หลังจาก 6 วันหรือหลังจาก 5 วันสัมผัสกับไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติฮิวเมน CD134 25 แอนติบอดีโคลน 20E5 หรือการฮิวเมน OX4OL การเพิ่มจำนวนเซลล์ถูกวัดโดยใช้การ เทียบเคียง (BrdU ประสาน) เซลล์การเพิ่มจำนวน ELISATM (Roche) และ ELISATMreader (BioRad) ที่ A450 nmดังแสดงในรูปที่ 18 (ค่าเฉลี่ย± SD, n = 3 ใช้ผู้บริจาคหนึ่ง), แม้ว่าเครื่องกระตุ้น CD3/CD28 เม็ดเดียวทำให้เกิดการเพิ่มจำนวนมากในฮิวเมน30 CD134 แสดง T ลิมโฟไซต์ (เช่น ปานกลาง), ไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติ -ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 (hu20E5) และทำให้เกิด OX40L ฮิวเมนการเพิ่มจำนวนเพิ่มเติมใน CD3/CD28 ถูกกระตุ้นประคำ T ลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน CD134 เพิ่มอินเตอร์ลิวคิน-2 เท่านั้นที่ดูเหมือนจะ เพิ่มโรค (เช่น กลาง)การเพิ่มจำนวนใน CD3/CD28 ถูกกระตุ้นประคำ T ลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน CD134(d) การตอบสนอง Immunostimulatory ใน rhesus macaque ตัวลิงหลังจาก12H 3 clones 5 รักษา ด้วยแอนตี้ CD134 แอนติ-ฮิวเมนฮิวเมน (ไคเมริก) และ20E5ไม่ฮิวเมน primates rhesus macaque ตัวลิงอาจ immunized กับโปรตีนไวรัสเอชไอวีสิมิลัน gp130 ตามที่อธิบายไว้โดย al. et Weinberg (เจ Immunother 2006; 29:575 585)10 รับ draining น้ำเหลืองโหนจาก immunized ลิงด้วยฮิวเมน (เช่น ไคเมริกหรือฮิวเมไนซ์หรือ deimmunized เช่น ย่อยฮิวเมน IgG1 หรือ IgG4) แอนตี้ CD134 แอนติ-ฮิวเมน clones 12H 3 และ 20E5 ต้องแสดงโหนน้ำเหลืองขนาดใหญ่เมื่อเทียบกับ immunized ควบคุมลิง สัตว์รับกับเมาส์หรือฮิวเมไนซ์ 12H 3 หรือ แอนตี้ 20E5 ต้องแสดง titres แอนติบอดีเฉพาะ gp130 เพิ่มขึ้น 15 และการตอบสนอง T เซลล์ long-lived เพิ่ม เมื่อเทียบกับตัวควบคุม ควรมีเครื่องหมายไม่แจ่มแจ้งของความเป็นพิษในการบำบัด ลิงตัวอย่างที่ 8 รู้จักจำแนกโดเมน CD134 ฮิวเมนและเอพิโทป 20 โดยเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดี clones 12H 3 และ 20E5(ก) การผูกของเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนตี้ clones 12H 3 และ 20E5 กับรีคอมบิแนนต์ไม่ได้ลดลง และลดฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy อาหารโปรตีน (blotting วิธีตะวันตก)25 13 ร้อยหรือ 650 ng/เลน (สำหรับ Coomassie brilliant สีน้ำเงินย้อมสี) หรือ250 ng/lane (for western blotting) รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy (IgG1) fusion protein (R&D Systems) was electrophorized using 4-12% Tris-Bis gels and MOPS running buffer (Invitrogen) under a variety of non-reducing and reducingconditions (see รูป 19-A) in pre cast LDS-PAGE denaturing electrophoresis30 NuPage® Novex® system. Then, รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy fusionprotein was either stained with Coomassie brilliant blue (BioRad) หรือ electro-blotted onto a polyvinylidene fluoride (PDVF) transfer membrane (Millipore). Afterblocking with PBS/0.05% Tween 20/1% BSA fraction V (Roche) for 20 min at RT, PDVF membranes were incubated with 100 ng/mL mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 หรือ 20E5 for 1 hour at RT. In parallel, 100 ng/mL mouse IgGlx ไอโซไทป์ control antibody (BD Biosciences) was used as a เนกาทีฟ 5 control. After extensive washing in PBS/0.05% Tween 20, binding of mouse แอนติ- ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 หรือ 20E5 was determined with 1:5000 diluted horseradish peroxidase-conjugated goat แอนติ-mouse Fcy-specific antibodies (Jackson ImmunoResearch) for 1 hour at RT, followed by a ready-to-use สารละลาย of TMB substrate (Sigma) for colorimetric detection.10 As shown in รูป 19-B, รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy fusionprotein under non reducing (and LDS denaturing without and with heatdenaturing, condition a and b, ตามลำดับ) conditions demonstrated a molecular mass of 7z130-140 kDa. Non-reduction without heating (condition a) showed two bands at close proximity, which suggested that a fraction of รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน 15 CD134:ฮิวเมน Fcy fusion protein was incompletely denatured/unfolded. Non- reduction with heating (condition b) showed one band, which suggested that รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy fusion protein was completely denatured/unfolded. รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy fusion protein under reducing (and LDS denaturing without and with heat denaturing, condition c and 20 d, ตามลำดับ) conditions resulted in bands at 7410 kDa (condition c) and at �60-65 kDa (condition d). Former observation suggested incomplete reduction of รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy fusion protein, and latter observation suggested complete reduction/breakage of disulfide bridges joining two ฮิวเมน IgGl-derived Fey-fragments within each รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy25 fusion protein molecule.As shown in รูป 19-C, both mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibodies clone 12H3 and clone 20E5 recognized รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy fusion protein under non-reducing (and LDS denaturing without and with heatdenaturing, condition a and b, ตามลำดับ) conditions at predominantly 2130 kDa. 30 In contrast, mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 showed only a slight binding with รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy fusion protein under reducing (and LDS denaturing without and with heat denaturing, condition c and d, ตามลำดับ) conditions, whereas mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 showed a strong binding to รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy fusion protein under reducing (and LDS denaturing without and with heat denaturing, condition c and d, ตามลำดับ) conditions.These results demonstrated that mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibodies clone 5 12H3 and clone 20E5 specifically recognized ฮิวเมน CD134. Furthermore, these results demonstrated that mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibodies clone 12H3 and clone 20E5 seemed to recognize dissimilar ฮิวเมน CD134 เอพิโทป, which คือ evidenced by respective slight binding (clone 12H3) vs. strong binding (clone 20E5) with รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy fusion protein under reducing (and 10 LDS denaturing with and without heat denaturing) conditions. These resultssuggested that mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 recognized anเอพิโทป on ฮิวเมน CD134, which คือ not sensitive to denaturation (LDS and heat treatment) and sensitive to reduction (i.e., breakage of disulphide bridge(s) - most likely, ซิสเทอีน-rich domains (CRD)-related - by DTT). These results suggested that 15 mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 recognized an เอพิโทป on ฮิวเมน CD134, which คือ not sensitive to denaturation (LDS and heat treatment) and not sensitive to reduction (i.e., breakage of disulphide bridge(s) - most likely, CRD- related - by DTT).20 (b). Binding of mouse แอนต

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ดังแสดงในรูปที่ 17 (ค่าเฉลี่ย± SD) การรวมกันของไคเมริกฮิวเมน
IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 (hu20E5) ที่ 2.5 และ 25 Rg / มิลลิลิตร (หรือที่ระดับความเข้มข้นต่ำกว่าข้อมูล ไม่แสดง) กับฮิวเมน OX4OL ที่ 0.1 และ 1.0 GG / มิลลิลิตร (หรือที่ระดับความเข้มข้นต่ำกว่าไม่ได้แสดงข้อมูล) ไม่ได้แสดงให้เห็นใด ๆ ซึ่งกันและกัน
(เช่นสารเติมแต่งหรือเสริมฤทธิ์กัน, หรือแม้กระทั่งการยับยั้ง) มีผลต่อการเพิ่มจำนวนใน PHA-
กระตุ้น T ลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน CD134.
(ค) การเพิ่มจำนวนของแอนติ - ฮิวเมน CD3 / แอนติ - ฮิวเมน CD28 กระตุ้นแอนติบอดี beads-
5 กระตุ้น T ลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน CD134
หลังการรักษาด้วยเมริกไคฮิวเมนIgG4k แอน ติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5
ฮิวเมนเซลล์โลหิตโมโนนิวเคลียร์ (PBMC) จากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดี
(ความยินยอม) ที่แยกได้โดยการหมุนเหวี่ยงหนาแน่นใน Lymphoprep (1.077
กรัม / มิลลิลิตร; Nycomed) ต่อมา PBMC เมล็ดที่ 0.1x106cells / 100 PL / ดี
10 (คือ 1x106 เซลล์ / มิลลิลิตร) ใน 96 หลุมจานแบนด้านล่าง (Corning) ในวัฒนธรรม RPMI-1640
ขนาดกลาง (Gibco) ที่มี 10% ซีรั่มของทารกในครรภ์ลูกวัว (Bodinco ) และ 50 lig / mL
เจนทาไมซิน (Gibco) และถูกกระตุ้นด้วยเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD3 / เมาส์แอนติ -
ฮิวเมน CD28 ลูกปัดกระตุ้นแอนติบอดี (CD3 ลูกปัด / CD28; Invitrogen) ที่ ลูกปัด 1/2
เซลล์ในกรณีที่ไม่มีหรือการปรากฏตัวของ 25 U / มิลลิลิตรรีคอมบิแนนต์ฮิวเมนอินเตอร์ลิวคิน -2
15 (PeproTech) ที่ 37 ° C / 5% CO2 หลังจากวันที่ 1 หรือ 2 วันหลังจากที่เหล่านี้
(ลบและบวกอินเตอร์ลิวคิน-2) CD3 / CD28 ลูกปัดกระตุ้นฮิวเมน CD134
แสดงทีลิมโฟไซต์ได้สัมผัสกับ25.0 pg / มิลลิลิตรไคเมริกฮิวเมน IgG4k . แอนติ -
ฮิวเมนแอนติบอดีโคลนCD134 20E5 หรือ 1.0 GG / mL โพลีฮิสทิดีน -tagged
คอมบิรีแนนต์ฮิวเมนOX4OL (ในการปรากฏตัวของ 1: 5 อัตราส่วนโดยโมลเมาส์แอนติ -polyhistithne
20 แอนติบอดี; R & D Systems) ที่ 37 ° C / CO2 5% เป็นเวลา 6 วันหรือ 5 วันตามลำดับ.
เซลล์ที่ถูกกระตุ้นครั้งแรกกับการรวมกันของ CD3 / ลูกปัด CD28
บวกรีคอมบิแนนต์ฮิวเมนอินเตอร์ลิวคิน -2 เป็นอีกครั้งกระตุ้น 1
วันก่อนเซลล์การเพิ่มจำนวนวัดที่มี25 U / มิลลิลิตรรีคอมบิแนนต์ฮิวเมนอินเตอร์ลิวคิน -2.
หลังจาก 6 วันหรือหลังจากได้รับ 5 วัน เพื่อไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติ - ฮิวเมน CD134 25 แอนติบอดีโคลน 20E5 หรือการฮิวเมน OX4OL
เซลล์การเพิ่มจำนวนวัดโดยใช้สี(BrdU รวมตัว) เซลล์การเพิ่มจำนวน ELISATM (Roche) และ
ELISATMreader (BioRad) ที่นาโนเมตร A450.
ดังแสดงในรูปที่ 18 (ค่าเฉลี่ย± SD, n = 3 โดยใช้หนึ่งในผู้บริจาค) แม้ว่า
CD3 / CD28 ลูกปัดกระตุ้นชักนำคนเดียวมากการเพิ่มจำนวนในฮิวเมน
30 CD134 แสดงทีลิมโฟ ไซต์ (เช่นขนาดกลาง), ไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติ -
ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 (hu20E5) และฮิวเมน OX40L
ชักนำเพิ่มเติมการเพิ่มจำนวนในCD3 / CD28 ลูกปัดกระตุ้น T ลิมโฟไซต์ ที่แสดงออกฮิวเมน CD134 นอกเหนือจากอินเตอร์ลิวคิน -2 เพียงดูเหมือนเพื่อเพิ่มฐาน (เช่นขนาดกลาง)
การเพิ่มจำนวนใน CD3 / CD28 ลูกปัดกระตุ้น T ลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน CD134. (ง) การตอบสนอง immunostimulatory ในลิงแสมลิงชนิดหนึ่งหลังจากที่5 การรักษาด้วยฮิวเมน (ไคเมริก) แอนติ - ฮิวเมน CD134 โคลนแอนติบอดี 12H3 และ20E5 ที่ไม่ใช่ฮิวเมนบิชอพจำพวกลิงแสมอาจรับวัคซีนที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่องเหมือนลิงโปรตีนไวรัส gp130 ตามที่อธิบาย Weinberg et al, (J Immunother 2006; 29: 575-585). 10 ต่อมน้ำเหลืองระบายน้ำจากลิงรับการรักษาด้วยวัคซีนกับฮิวเมน(เช่นไคเมริกหรือฮิวเมไนซ์หรือ deimmunized; เช่นคลาสฮิวเมน IgG1 หรือ IgG4 ) แอนติ - ฮิวเมน CD134 โคลนแอนติบอดี 12H3 20E5 และคาดว่าจะต่อมน้ำเหลืองโตเมื่อเทียบกับลิงวัคซีนควบคุม สัตว์ได้รับการรักษาด้วยเมาส์หรือฮิวเมไนซ์แอนติบอดี้ 12H3 หรือ 20E5 คาดว่าจะเพิ่มขึ้น 15 แอนติบอดีไตเตอร์ gp130 เฉพาะและเพิ่มการตอบสนองระยะยาว T- เซลล์, เมื่อเทียบกับการควบคุม ควรจะมีไม่มีสัญญาณที่ชัดเจนของความเป็นพิษในการรักษาลิง. ตัวอย่าง 8. ลักษณะของฮิวเมน CD134 โดเมนและเอพิโทปได้รับการยอมรับ 20 โดยใช้เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 และ 20E5 ( ก) ผูกเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลโคลนแอนติบอดี 12H3 และ 20E5 ที่ไม่ใช่ลดลงและลดรีคอมบิแนนต์ฮิวเมน CD134:. ฮิวเมนโปรตีนฟิวชั่น FCY (ซับตะวันตก) 25 สิบสาม ร้อยหรือ 650 ng / เลน (สำหรับ Coomassie ย้อมสีฟ้าสดใส) หรือ250 ng / เลน (สำหรับซับตะวันตก) รีคอมบิแนนต์ฮิวเมน CD134: ฮิวเมน FCY (IgG1) โปรตีนฟิวชั่น (R & D Systems) ได้ electrophorized ใช้ 4-12% เจล Tris-Bis และ MOPS ทำงานบัฟเฟอร์ (Invitrogen) ภายใต้ความหลากหลายของการไม่ลดและลดเงื่อนไข(ดูรูป 19-A) ก่อนโยนโบถส์-PAGE อิ denaturing 30 NuPage®ระบบNovex® จากนั้นรีคอมบิแนนต์ฮิวเมน CD134: ฮิวเมนฟิวชั่น FCY โปรตีนทั้งที่มีสีสดใส Coomassie สีฟ้า (BioRad) หรือไฟฟ้าเปื้อนบนฟลูออไร Polyvinylidene (ที่ PDVF) เมมเบรนโอน (ค) หลังจากที่ปิดกั้นกับพีบีเอส / 0.05% Tween 20/1% BSA ส่วน V (Roche) เป็นเวลา 20 นาทีที่ RT, เยื่อ PDVF ถูกบ่มด้วย 100 ng / เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 หรือ 20E5 1 ชั่วโมงที่ RT ในแบบคู่ขนาน 100 ng / เมาส์ IgGlx ไอโซไทป์แอนติบอดีควบคุม (BD ชีววิทยาศาสตร์) ถูกใช้เป็นเนกาทีฟ5 การควบคุม หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / 0.05% Tween 20 ผลผูกพันเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 หรือ 20E5 ถูกกำหนดด้วย1: 5000 มะรุมเจือจางแพะ peroxidase-ผันแอนติ -mouse Fcy- เฉพาะแอนติบอดี(แจ็คสัน ImmunoResearch) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ RT ตามด้วยพร้อมต่อการใช้สารละลายของพื้นผิวทหารไทย(Sigma) สำหรับการตรวจสอบสี. 10 ดังแสดงในรูปที่ 19-B รีคอมบิแนนต์ฮิวเมน CD134 : ฮิวเมนฟิวชั่น FCY โปรตีนภายใต้ไม่ลด (และเอสโดยไม่ต้องเสียสภาพและด้วยความร้อนdenaturing สภาพและ b ตามลำดับ) แสดงให้เห็นถึงสภาพโมเลกุลมวลของ7z130-140 กิโลดาลตัน ลดไม่ได้โดยไม่ต้องร้อน (เงื่อนไข) แสดงให้เห็นว่าทั้งสองวงดนตรีที่บริเวณใกล้เคียงกับที่บอกว่าส่วนของรีคอมบิแนนต์ฮิวเมน15 CD134: ฮิวเมนโปรตีน FCY ฟิวชั่นได้รับการแปลงสภาพไม่สมบูรณ์ / กางออก ที่ไม่ใช่การลดลงมีความร้อน (เงื่อนไขข) แสดงให้เห็นว่ากลุ่มหนึ่งซึ่งชี้ให้เห็นว่ารีคอมบิแนนต์ฮิวเมนCD134: ฮิวเมนโปรตีน FCY ฟิวชั่นได้อย่างสมบูรณ์แปลงสภาพ/ กางออก รีคอมบิแนนต์ฮิวเมน CD134: ฮิวเมน FCY โปรตีนฟิวชั่นภายใต้การลด(และเอส denaturing โดยไม่ต้องและมีการเสียสภาพความร้อนสภาพคและ 20 D, ตามลำดับ) เงื่อนไขผลในวงดนตรีที่ 7410 กิโลดาลตัน (เงื่อนไขค) และ ที่ 60- 65 กิโลดาลตัน (เงื่อนไขง) สังเกตอดีตชี้ให้เห็นการลดลงไม่สมบูรณ์ของรีคอมบิแนนต์ฮิวเมน CD134: ฮิวเมนโปรตีนฟิวชั่น FCY และสังเกตหลังแนะนำลดสมบูรณ์ / แตกของสะพานซัลไฟด์ร่วมงานกับสองฮิวเมน IgGl ที่ได้มาจากเศษ-ชอบกลในแต่ละรีคอม บิแนนต์ฮิวเมน CD134: ฮิวเมน FCY. 25 โมเลกุลโปรตีนฟิวชั่นดังแสดงในรูป19-C ทั้งเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H3 และโคลน 20E5 ได้รับการยอมรับรีคอมบิแนนต์ฮิ วเมน CD134: ฮิวเมนโปรตีนฟิวชั่นภายใต้ FCY ไม่ลด (และเอสโดยไม่ต้องเสียสภาพและด้วยความร้อนdenaturing สภาพและ b ตามลำดับ) เงื่อนไขที่ส่วนใหญ่ 2,130 กิโลดาลตัน 30 ในทางตรงกันข้ามเมาส์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 แสดงให้เห็นเพียงเล็กน้อยที่มีผลผูกพันกับรีคอมบิแนนต์ฮิวเมนCD134: ฮิวเมน FCY โปรตีนฟิวชั่นภายใต้การลด(และเอส denaturing โดยไม่ต้องและมีการเสียสภาพความร้อน คสภาพและ D ตามลำดับ) เงื่อนไขในขณะที่เมาส์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 แสดงให้เห็นความแข็งแกร่งที่มีผลผูกพันที่จะรีคอมบิแนนต์ฮิวเมน CD134: ฮิวเมน FCY โปรตีนฟิวชั่นภายใต้การลด (และ . เอสโดยไม่ต้องเสียสภาพและมีการเสียสภาพความร้อนสภาพ C และ D, ตามลำดับ) เงื่อนไขผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นถึงเมาส์ที่แอนติ- ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 5 12H3 และโคลน 20E5 ได้รับการยอมรับโดยเฉพาะฮิวเมน CD134 นอกจากนี้เหล่านี้ผลการแสดงให้เห็นถึงเมาส์ที่แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H3 และโคลน20E5 ดูเหมือนจะรับรู้ที่แตกต่างกันฮิวเมน CD134 เอพิโทปซึ่งคือหลักฐานจากนั้นเล็กน้อยผูกพัน(โคลน 12H3) กับผลผูกพันที่แข็งแกร่ง ( โคลน 20E5) กับรีคอมบิแนนต์ฮิวเมน CD134: ฮิวเมน FCY โปรตีนฟิวชั่นภายใต้การลด (และ 10 เอส denaturing ที่มีและไม่มีเสียสภาพความร้อน) เงื่อนไข ผลการศึกษานี้ชี้ให้เห็นว่าเมาส์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 ได้รับการยอมรับเอพิโทปในฮิวเมนCD134 ซึ่งคือไม่ไวต่อ denaturation (เอสและความร้อนรักษา) และที่สำคัญการลดลง (เช่นการแตกหักของ disulphide สะพาน (s) - ส่วนใหญ่มีแนวโน้มที่ซิสเทอีนที่อุดมไปด้วยโดเมน(CRD) ที่เกี่ยวข้องกับ - โดย DTT) ผลการศึกษานี้ชี้ให้เห็นว่า 15 เมาส์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลน 20E5 ได้รับการยอมรับเอพิโทปในฮิวเมนCD134 ซึ่งคือไม่ไวต่อ denaturation (เอสและการรักษาความร้อน) และไม่ได้มีความไวต่อการลดลง(เช่นความแตกแยก สะพาน disulphide (s) - ส่วนใหญ่ CRD- ที่เกี่ยวข้องกัน -. โดย DTT) 20 (ข) ผูกเมาส์แอนต

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

แสดง 17 รูป ( ค่าเฉลี่ย± SD ) , การรวมกันของไคเมริกฮิวเมน
igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5 ( hu20e5 ) 2.5 และ 25 RG / ml ( หรือที่ความเข้มข้น ; ลดข้อมูลไม่แสดง ) กับฮิวเมน ox4ol ที่ 0.1 และ 1.0 GG / ml ( หรือที่ความเข้มข้น ; ลดข้อมูลไม่แสดง ) ไม่แสดงใด ๆ ( เช่น เสริมฤทธิ์ซึ่งกันและกัน
ค็อคการบวกค็อคแม้แต่ยับยั้ง ) ต่อการเพิ่มจำนวนในผา --
t การลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน cd134 .
( C ) การเพิ่มจำนวนของแอนติ - ฮิวเมนทันที / แอนติ - ฮิวเมน cd28 แอนติบอดีกระตุ้นลูกปัด -
5 ~ T ลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน cd134 หลังจากการรักษาด้วยไคเมริก
ฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20e5
ฮิวเมนเม็ดเลือดขาวปกติเซลล์ ( 2 ) สุขภาพผู้บริจาค
( ความยินยอม ) แยกตามความหนาแน่นปั่นบน lymphoprep ( 1.077
g / ml ; ) ) ต่อมา 2 ถูก seeded ที่ 0.1x106cells/100 p.l/well
10 ( เช่น1x106 เซลล์ / มิลลิลิตร ) 96 หลุมจานก้นแบน ( คอร์น ) ในวัฒนธรรม
rpmi-1640 ขนาดกลาง ( gibco ) ที่มี 10% เซรั่มของลูกวัว ( bodinco ) และ 50 ลีก / ml
เจนทาไมซิน ( gibco ) และถูกกระตุ้นด้วยเมาส์แอนติ - ฮิวเมนทันที / เมาส์แอนติ -
ฮิวเมน cd28 กระตุ้นแอนติบอดี ( ทันที / ลูกปัด cd28 ลูกปัด ; Invitrogen ) 1 / 2
ลูกปัดเซลล์ในการปรากฏตัวของค็อค 25 U / ml รีคอมบิแนนต์ฮิวเมนอินเตอร์ลิวคิน - 2
( 15 peprotech ) ที่อุณหภูมิ 37 องศา C / 5% CO2 หลังจาก 1 วัน ค็อคหลังจาก 2 วันนี้ ( ลบและบวก
อินเตอร์ลิวคิน - 2 ) ทันที / cd28 ลูกปัดกระตุ้นฮิวเมน cd134 แสดง T
ลิมโฟไซต์เปิดรับ 25.0 p.g/ml ไคเมริกฮิวเมน igg4k .แอนติ - ฮิวเมน
cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5 ค็อคถึง 1.0 GG / ml โพลีฮิสทิดีน - แท็กรีคอมบิแนนต์
ฮิวเมน ox4ol ( ในการแสดงตนของอัตราส่วน 1 : 5 เมาส์แอนติ - polyhistithne
20 ) ; R & D ระบบ ) ที่ 37 ° C / คาร์บอนไดออกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 6 วัน ค็อคเป็นเวลา 5 วัน ตามลำดับ .
เซลล์ ซึ่งครั้งแรกถูกกระตุ้นด้วยการรวมกันของทันที / cd28 ลูกปัดบวก
รีคอมบิแนนต์ฮิวเมนอินเตอร์ลิวคิน - 2 เป็นอีก 1 วัน ก่อนที่จะกระตุ้นเซลล์วัดการเพิ่มจำนวน
25 U / ml ของรีคอมบิแนนต์ฮิวเมนอินเตอร์ลิวคิน - 2
หลังจากที่ 6 วัน ค็อค หลังจาก 5 วันเปิดรับไคเมริกฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 25 แอนติบอดีโคลน 20e5 ค็อคเพื่อฮิวเมน ox4ol เซลล์การเพิ่มจำนวนการวัด
7.4 ( brdu ประสานเซลล์การเพิ่มจำนวน elisatm ( โรช ) และ
elisatmreader ( biorad ) ที่ a450 nm .
ตามที่แสดงใน 18 รูป ( ค่าเฉลี่ย± SD ,