Once spots with differential intens

Once spots with differential intensities were identified a new set of 2DE gels were prepared and stained with Coomassie silver blue (Candiano et al., 2004) to facilitate spot extraction. Gel plugs containing protein spots from all three gels for each treatment were washed briefly with 100 mM ammonium bicarbonate (NH4HCO3) before destaining in 50:50 acetonitrile (ACN)/50 mM
NH4HCO3 (three washes for 10 min per wash). After dehydration in
100% ACN for 5 min, gel plugs were air dried, reduced with 100 mM DTT in 100 mM NH4HCO3 at 56 ◦C for 1 h and alkylated with 55 mM iodoacetamide in 100 mM NH4HCO3 for 45 min at room temperature in the dark. The gel plugs were again washed in 100 mM NH4HCO3 for 5 min then twice with 50:50 ACN/50 mM NH4HCO3 for 5 min and dehydrated as described above. Trypsin digestion was undertaken by adding 30 l trypsin solution (12.5ng/l in 50 mM NH4HCO3, Promega, Sydney, Australia) for 30 min at 4 ◦C, after which proteins were digested overnight at 37 ◦C. Tryptic peptides were extracted by washing gel plugs twice in 50% ACN/2% formic acid for 30 min. The resulting supernatants were reduced to 12 l in a vacuum centrifuge and further centrifuged for 10 min at 14,000 rpm to remove microparticles.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เมื่อจุดที่มีความเข้มที่แตกต่างกันมีการระบุชุดใหม่ของเจล 2DE ได้จัดทำและย้อมด้วยสี Coomassie เงินสีฟ้า (Candiano et al., 2004) เพื่อความสะดวกในการสกัดจุด ปลั๊กเจลที่มีจุดโปรตีนจากทั้งสามเจลสำหรับการรักษาแต่ละถูกล้างในเวลาสั้น ๆ ที่มีไบคาร์บอเนต 100 มิลลิแอมโมเนียม (NH4HCO3) ก่อนที่ใน destaining 50:50 acetonitrile (ACN) / 50 มิลลิ
NH4HCO3 (สามล้างเป็นเวลา 10 นาทีล้างต่อ) หลังจากการคายน้ำใน
100% ACN เป็นเวลา 5 นาทีปลั๊กเจลถูกอากาศแห้งลดลง 100 มิลลิ DTT 100 มิลลิ NH4HCO3 ที่ 56 ◦Cเป็นเวลา 1 ชั่วโมงและ alkylated 55 มิลลิ iodoacetamide 100 มิลลิ NH4HCO3 เวลา 45 นาทีที่อุณหภูมิห้องใน มืด ปลั๊กเจลล้างอีกครั้งใน 100 มิลลิ NH4HCO3 เวลา 5 นาทีจากนั้นครั้งที่สองกับ 50:50 ACN / 50 มิลลิ NH4HCO3 เวลา 5 นาทีและแห้งที่อธิบายข้างต้น การย่อยอาหาร trypsin ได้ดำเนินการแก้ปัญหาโดยการเพิ่ม trypsin 30 ลิตร (12.5ng / ลิตรใน 50 มิลลิ NH4HCO3, Promega, ซิดนีย์, ออสเตรเลีย) เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 ◦Cหลังจากที่ได้รับการย่อยโปรตีนในชั่วข้ามคืนที่ 37 ◦C เปปไทด์ Tryptic ถูกสกัดโดยการล้างปลั๊กเจลสองครั้งใน 50% ACN / 2% กรดเป็นเวลา 30 นาที supernatants ส่งผลให้ถูกลดลงไป 12 ลิตรใน centrifuge สูญญากาศและปั่นต่อไปเป็นเวลา 10 นาทีที่ 14,000 รอบต่อนาทีในการลบไมโคร

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เมื่อจุดที่มีค่าความเข้มที่ถูกระบุว่าเป็นชุดใหม่ของ 2de เจลถูกเตรียมและเต็มไปด้วยเหล่านี้น่าจะเป็นซิลเวอร์บลู ( candiano et al . , 2004 ) เพื่ออำนวยความสะดวกการสกัดจุด เจลจุดปลั๊กที่มีโปรตีนจากเจลรักษาทั้งสามได้ล้างสั้นกับแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต 100 มม. ( nh4hco3 ) ก่อน destaining ใน Acetonitrile ( ACN ) 50 / 50 mm
nh4hco3 ( สามตัว 10 นาทีต่อล้าง ) หลังจากน้ำใน
100% ACN สำหรับ 5 นาที , เจลปลั๊กถูกอากาศแห้ง ขนาด 100 มิลลิเมตร ส่วนใน nh4hco3 100 มม. ที่ 56 ◦ C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง และ alkylated กับ iodoacetamide 55 มม. nh4hco3 100 มม. สำหรับ 45 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ในที่มืด เจลล้างปลั๊กอีกครั้งใน nh4hco3 100 มิลลิเมตร นาน 5 นาที แล้วถึงสองครั้ง ด้วย 50 :50 / 50 มม. ต. nh4hco3 เป็นเวลา 5 นาทีและแห้งตามที่อธิบายไว้ข้างต้น การย่อยอาหารเอนไซม์ถูกดำเนินการ โดยการเพิ่มเอนไซม์ 30 ลิตร สารละลาย ( 12.5ng/l ใน nh4hco3 , 50 มม. promega , ซิดนีย์ , ออสเตรเลีย ) สำหรับ 30 นาทีที่ 4 ◦ C หลังจากที่โปรตีนถูกย่อยอาหารค้างคืนที่ 37 ◦ C เปปไทด์สกัดด้วยเจลล้างปลั๊กสองครั้งใน 50% ACN / 2% กรดฟอร์มิกเป็นเวลา 30 นาทีผล supernatants ลดลงร้อยละ 12 ลิตรและระดับสุญญากาศเครื่องต่อไป 10 นาทีที่ 10 , 000 รอบต่อนาที เอาไมโคร .