Dongxiang County, Jiangxi Province,

Dongxiang County, Jiangxi Province, China in November 2013.
All samples were stored in an icebox and immediately brought
to the laboratory. The tissues of the samples were screened for
endophytic fungi within 24 h.
Isolation of endophytic fungi
Plant materials were thoroughly washed with running tap water,
and the healthy leaves, stems, and roots were cut into
small pieces (3 cme5 cm) under sterile conditions. Surface
sterilisation of roots, seeds, stems, and leaves were conducted
with 1 % sodium hypochlorite for 4 mine5 min and then with
2.5 % sodium thiosulfate for 10 min (to remove the residual sodium
hypochlorite). Prior to treatment with 75 % alcohol for
1 min, traces of sodium hypochlorite were removed by washing
with sterile distilled water. The tissues were dried under
sterile laminar air flow, cut into small segments (about
0.5 cm each) and then transferred to Petri dishes (9 cm diameter)
containing potato dextrose agar (PDA) medium
(amended with 50 mg mL1 chloramphenicol). The Petri dishes
were incubated at 28 C in darkness and monitored daily to assess
the growth of endophytic fungal hyphae emerging from
segments. Individual hyphal tips of various fungi were removed
from the agar plates, placed on new PDA medium,
and incubated at 28 C for at least 10 d. Each fungal culture
was checked for purity and transferred to another PDA plate
by the hyphal tip method (Strobel et al. 1996). To ensure that
surface sterilisation had removed all hyphae and chlamydospores
externally adhering to the segments, the surfacesterilized
segments were imprinted simultaneously in PDA
agar plates and incubated under the same conditions (Kusari
et al. 2013). Only segments that were negative in this test
were used for endophyte isolation. The fungal isolates were
numbered and stored on the surface of PDA plate at 4 C or
as spores and mycelia in 15 % (v/v) glycerol at 70 C.
All fungal isolates were tentatively grouped and dereplicated
by observing their morphological and cultural characteristics,
including the characteristics of colonies on plates
and slants, the presence of aerial mycelia and substrate mycelia,
spore mass color, distinctive reverse colony color, diffusible
pigment, and sporophore and spore chain morphology
(Wang et al. 2011). Some isolates sporulated readily on PDA
media after 1 week of inoculation in darkness at 28 C. Many
colonies that were similar in color, shape, and size were observed
for hyphal length and structure under a light microscope,
allowing them to be segregated into distinct isolates.
Remaining sterile fungal isolates were subjected to a molecular
method of identification. Based on the preliminary grouping,
24 morphotypes were selected for further molecular
identification and phylogenetic analysis.
Total genomic DNA extraction, PCR amplification and
phylogenetic analysis
Each endophytic fungus was cultured in PD broth at 28 C with
constant shaking for 7 d. The fungal mycelia were freezedried,
and the genomic DNA was then extracted by the cetyltrimethylammonium
bromide method (Zhang et al. 2006). The
DNA was subjected to PCR amplification using the primers
ITS1 and ITS4 (White et al. 1990). The amplified fragment
consisted of ITS1, 5.8S and ITS4 regions of the rDNA. The
PCR reaction was performed in 50 mL of reaction mixture containing
25 mL of 2  Taq PCR Mastermix (Tiangen Biotechnol
Beijin Company Ltd, China), 2 mL of forward primer (10 mM),
2 mL of reverse primer (10 mM), 2 mL of template DNA and
19 mL of sterile double-distilled water. The PCR cycling protocol
consisted of an initial denaturation at 94 C for 3 min, 30
cycles of denaturation, annealing and elongation at 94 C for
30 s, 60 C for 30 s, and 72 C for 1 min. This protocol was followed
by a final elongation step of 72 C for 5 min. As a negative
control, the template DNA was replaced by sterile doubledistilled
water. The PCR amplified products were analysed by
gel electrophoresis at approximately 500 bpe800 bp. Purification
and sequencing of the PCR products was performed by
Shanghai Invitrogen Company Ltd (Shanghai, China). The
fragment of the ITS region was sequenced in both directions
using an ABI 377 automated DNA sequencer.
For strain identification, the fungal rDNA-ITS sequences
were matched against the nucleotide database using the Basic
Local Alignment Search Tool of the US National Centre
for Biotechnology Information (NCBI) for the final identification
of the endophytic fungi. The sequences were aligned using
ClustalW-Pairwise Sequence Alignment of the EMBL
Nucleotide Sequence Database. The most appropriate relative
sequences were selected based on maximum identity
and substrate in the NCBI database and imported into
MEGA 4.0 (Tamura et al. 2007). To reveal the genetic distances
between different fungal strains intuitively, we constructed
a rooted phylogenetic tree by using the neighbour-joining
method combined with bootstrap analysis with 1000
replicates.
In vitro antagonistic activity of endophytic fungi against
Oryza sativa phytopathogens
The in vitro antagonistic behaviour of those 24 representative
endophytic fungal morphotypes strains were tested against
the Oryza sativa common phytopathogens Thanatephorus cucumeris
FJXA3313 and Xanthomonas oryzae BJXA3313. Both phytopathogens
were obtained from the College of Agronomy in
Jiangxi Agriculture University, Nanchang, China. The antagonistic
behaviour against T. cucumeris FJXA3313 was detected by
using the dual-culture plate antagonism assay (Kusari et al.
2013). Plugs (5 mm) of each endophytic fungus and phytopathogen
were co-cultured in the PDA previously mentioned and
incubated at 28 C. The plugs were then placed at the two opposite
edges of the Petri dishes facing each other. Phytopathogen
alone was inoculated as controls. The growth diameters
of both endophytic fungi and phytopathogen were monitored
and recorded daily. All control and test plates were run in
triplicate.
To detect the antagonistic behaviour against X. oryzae
BJXA3313, we cultured the fungal isolates in PD broth at
28 C and 180 rpm for 10 de15 d. Mycelial mixture was centrifuged
at 10 000 g for 5 min and the mycelial deposit was discarded.
The fermentation broth was then filtered aseptically.
The sterile culture filter (200 mL) of each isolate was transferred
into one Oxford cup, and double-layer plate method
was used to accomplish the antimicrobial test in triplicate
(Alford & Ste

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เขต Dongxiang มณฑลเจียงซี จีนในเดือนพฤศจิกายนปี 2013ตัวอย่างทั้งหมดถูกเก็บไว้ใน icebox การ และนำมาทันทีการปฏิบัติการ เนื้อเยื่อของตัวอย่างถูกฉายในเชื้อราที่ endophytic ภายใน 24 ชมแยกเชื้อรา endophyticวัสดุโรงงานสะอาดถูกล้าง ด้วยการใช้น้ำประปาและสุขภาพใบ ลำต้น และรากถูกตัดเป็นชิ้นเล็ก ๆ (3 cme5 cm) ภายใต้เงื่อนไขกอซ พื้นผิวsterilisation ราก เมล็ดพืช ลำต้น และใบไม้ได้ดำเนินกับ 1% ฟอก 4 mine5 นาทีแล้วด้วย2.5% โซเดียม thiosulfate ใน 10 นาที (เพื่อเอาโซเดียมเหลือไฮโป) ก่อนที่จะบำบัดด้วยแอลกอฮอล์ 75% สำหรับ1 นาที ร่องรอยของการฟอกถูกลบ โดยการซักผ้าด้วยน้ำกลั่นฆ่าเชื้อ เนื้อเยื่อที่แห้งภายใต้กระแสอากาศ laminar กอซ ตัดเป็นกลุ่มขนาดเล็ก (เกี่ยวกับ0.5 ซม.แต่ละ) และจากนั้น โอนย้ายไปจาน Petri (เส้นผ่าศูนย์กลาง 9 ซม)ประกอบด้วยมันฝรั่งขึ้น agar (PDA) ปานกลาง(แก้ไข ด้วย 50 mg mL1 chloramphenicol) จาน Petriincubated ที่ 28 C ในที่มืด และตรวจสอบทุกวันเพื่อประเมินการเติบโตของ endophytic hyphae เชื้อราเกิดขึ้นจากเซ็กเมนต์ เคล็ดลับ hyphal ละเชื้อราต่าง ๆ ถูกเอาออกจากแผ่น agar วางบนกลาง PDA ใหม่และ incubated ที่ 28 C สำหรับน้อย 10 d วัฒนธรรมแต่ละเชื้อราตรวจสอบความบริสุทธิ์ และโอนย้ายไปยัง PDA อีกจานโดยวิธีการเคล็ดลับ hyphal (Strobel et al. 1996) มั่นใจได้ว่ามีเอาผิว sterilisation hyphae และ chlamydospores ทั้งหมดภายนอกยึดมั่นในเซ็กเมนต์ การ surfacesterilizedเซกเมนต์ถูกติดตราพร้อมใน PDAagar แผ่น และ incubated ภายใต้เงื่อนไขเดียวกัน (Kusariร้อยเอ็ด al. 2013) เฉพาะส่วนที่เป็นค่าลบในการทดสอบนี้ใช้สำหรับแยก endophyte แยกเชื้อราได้หมายเลข และเก็บไว้บนพื้นผิวของแผ่น PDA ที่ 4 C หรือเพาะเฟิร์นและ mycelia ในกลีเซอร 15% (v/v) ที่ค. 70แยกเชื้อราทุกอย่างไม่แน่นอนจัด และ dereplicatedโดยการสังเกตลักษณะสัณฐาน และวัฒนธรรมรวมทั้งลักษณะของอาณานิคมบนแผ่นและ slants สถานะ mycelia ทางอากาศและพื้นผิว myceliaสีโดยรวมสปอร์ อาณานิคมกลับโดดเด่นสี diffusibleเม็ดสี และ sporophore และสปอร์สัณฐานวิทยาโซ่(Wang et al. 2011) บางแยก sporulated พร้อมบน PDAสื่อหลังจาก 1 สัปดาห์ของ inoculation ในความมืดที่ 28 C. มากสุภัคอาณานิคมที่คล้ายกัน ในสี รูปร่าง ขนาดความยาว hyphal และโครงสร้างภายใต้กล้องจุลทรรศน์แสงทำให้สามารถแยกเป็นแยกความแตกต่างที่เหลือใส่เชื้อราที่แยกได้ถูกต้องเป็นโมเลกุลวิธีการระบุ ตามการจัดกลุ่มเบื้องต้น24 morphotypes ถูกเลือกในระดับโมเลกุลต่อไประบุและวิเคราะห์ phylogeneticรวม genomic DNA สกัด PCR ขยาย และวิเคราะห์ phylogeneticเห็ดราแต่ละ endophytic ถูกอ่างในซุป PD ที่ 28 C ด้วยคงสั่นสำหรับ 7 d Mycelia เชื้อราถูก freezedriedและ genomic DNA ถูกสกัด ด้วยการ cetyltrimethylammonium แล้ววิธีโบรไมด์ (Zhang et al. 2006) ที่ดีเอ็นเออยู่ภายใต้การขยาย PCR ที่ใช้ไพรเมอร์ที่ITS1 และ ITS4 (สีขาวและ al. 1990) ส่วนเอาต์ประกอบด้วย ITS1, 5.8S และ ITS4 ภูมิภาคของ rDNA ที่ทำปฏิกิริยา PCR ใน 50 mL บรรจุส่วนผสมของปฏิกิริยา25 mL ของ Taq PCR 2 Mastermix (Tiangen Biotechnolบริษัท Beijin จำกัด จีน), mL 2 พื้นไปข้างหน้า (10 mM),2 mL กลับพื้น (10 mM), 2 mL ของดีเอ็นเอแม่แบบ และmL 19 น้ำกลั่นห้องฆ่าเชื้อ โพรโทคอลขี่จักรยานของ PCRประกอบด้วยการ denaturation เริ่มที่ C 94 สำหรับ 3 min, 30วงจรการ denaturation การอบเหนียว และ elongation ที่ 94 C สำหรับs, C 60 สำหรับ 30 30 s และ C 72 ใน 1 นาที โพรโทคอลนี้ถูกตามตอนสุดท้าย elongation ของ 72 C สำหรับ 5 นาที เป็นการลบควบคุม แม่แบบดีเอ็นเอถูกแทนที่ ด้วย doubledistilled ใส่น้ำ ผลิตภัณฑ์ PCR ที่ขยายได้ analysed ด้วยเจ electrophoresis ในประมาณ 500 bpe800 bp. ฟอกและทำการจัดลำดับผลิตภัณฑ์ PCR โดยเซี่ยงไฮ้ Invitrogen บริษัท จำกัด (เซี่ยงไฮ้ จีน) ที่ส่วนภาคของถูกเรียงลำดับในทั้งสองทิศทางใช้ 377 ABI อัตโนมัติ DNA sequencerต้องใช้รหัส ลำดับ rDNA เป็นเชื้อราถูกจับคู่กับฐานข้อมูลของนิวคลีโอไทด์โดยใช้พื้นฐานเครื่องมือค้นหาภายในตำแหน่งของศูนย์แห่งชาติของสหรัฐอเมริกาสำหรับเทคโนโลยีชีวภาพข้อมูล (NCBI) สำหรับรหัสสุดท้ายของเชื้อรา endophytic มีจัดลำดับที่โดยใช้จัดตำแหน่งแพร์ไวส์ ClustalW ลำดับ EMBLฐานข้อมูลลำดับของนิวคลีโอไทด์ ญาติที่เหมาะสมที่สุดเลือกลำดับตามรหัสประจำตัวสูงสุดและพื้นผิวในฐานข้อมูล NCBI และนำเข้าเมก้า 4.0 (Tamura et al. 2007) ให้เหมาะกับระยะทางพันธุกรรมระหว่างต่างสายพันธุ์เชื้อราสังหรณ์ใจ เราสร้างต้นไม้ phylogenetic rooted โดยเพื่อนบ้านรวมรวมวิธีการกับการเริ่มต้นระบบวิเคราะห์ 1000เหมือนกับการกิจกรรมต่อต้านการเพาะเลี้ยงของเชื้อ endophytic รากับOryza ซา phytopathogensพฤติกรรมต่อต้านในของตัวแทนที่ 24ทดสอบกับสายพันธุ์เชื้อรา morphotypes endophyticการ Oryza ซาทั่วไป phytopathogens Thanatephorus cucumerisFJXA3313 และอ้อยแห้งระดับต่าง ๆ BJXA3313 Phytopathogens ทั้งสองได้รับจากวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ในมหาวิทยาลัยเกษตรมณฑลเจียงซี หนาน จีน การต่อต้านพฤติกรรมกับต. cucumeris FJXA3313 พบใช้ทดสอบ antagonism ของวัฒนธรรมจากสองจาน (Kusari et al2013) . ปลั๊ก (5 mm) ของแต่ละเชื้อ endophytic ราและ phytopathogenได้ร่วมอ่างใน PDA ที่กล่าวถึงก่อนหน้านี้ และincubated ที่ c. 28 ปลั๊กมีอยู่ที่ตรงข้ามสองขอบของจาน Petri หัน Phytopathogenคนเดียวมี inoculated เป็นตัวควบคุม สมมาตรเจริญเติบโตเชื้อรา endophytic และ phytopathogen ถูกตรวจสอบและบันทึกไว้ทุกวัน ควบคุมและทดสอบแผ่นทั้งหมดถูกเรียกใช้ในtriplicateสืบพฤติกรรมต่อต้านกับ x. อัพแห้งระดับต่าง ๆBJXA3313 เรา cultured แยกเชื้อราในซุป PD ที่28 C และ 180 รอบต่อนาทีสำหรับ 10 de15 d. Mycelial ผสมถูก centrifugedที่ g 10 000 5 นาทีและฝาก mycelial ถูกละทิ้งซุปหมักถูกแล้วกรอง asepticallyกรองใส่วัฒนธรรม (200 มล.) ของแต่ละแยกมีการโอนย้ายหนึ่งถ้วยออกซ์ฟอร์ด และแผ่นชั้นสองวิธีใช้ในการทำการทดสอบจุลินทรีย์ใน triplicate(Alford แอนด์สวีท

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

Dongxiang มณฑลเจียงซีประเทศจีนในเดือนพฤศจิกายนปี 2013
กลุ่มตัวอย่างทั้งหมดถูกเก็บไว้ใน icebox
ทันทีและนำไปยังห้องปฏิบัติการ เนื้อเยื่อของตัวอย่างที่ถูกคัดกรองเชื้อราเอนโดไฟท์ภายใน 24 ชม. การแยกเชื้อราเอนโดไฟท์วัสดุพืชถูกล้างให้สะอาดด้วยการใช้น้ำประปาและใบมีสุขภาพดีลำต้นและรากถูกตัดเป็นชิ้นเล็กๆ (3 cme5 ซม.) ภายใต้สภาพปลอดเชื้อ . พื้นผิวการฆ่าเชื้อของรากเมล็ดลำต้นและใบได้ดำเนินการกับโซเดียมไฮโปคลอไรต์1% เป็นเวลา 4 นาที mine5 แล้วด้วยโซเดียมไธโอซัลเฟต 2.5% นาน 10 นาที (เพื่อเอาที่เหลือโซเดียมไฮโปคลอไรต์) ก่อนที่จะมีการรักษาด้วยเครื่องดื่มแอลกอฮอล์ 75% สำหรับ1 นาที, ร่องรอยของโซเดียมไฮโปคลอไรต์ถูกถอดออกโดยการล้างด้วยน้ำกลั่นผ่านการฆ่าเชื้อ เนื้อเยื่อแห้งภายใต้การไหลของอากาศที่ผ่านการฆ่าเชื้อราบเรียบหั่นเป็นกลุ่มขนาดเล็ก (ประมาณ 0.5 ซม.) และจากนั้นก็ย้ายไปยังจานเลี้ยงเชื้อ (9 ซม. เส้นผ่าศูนย์กลาง) ที่มีวุ้นเดกซ์โทรสมันฝรั่ง (PDA) กลาง(แก้ไขเพิ่มเติม 50 มก. chloramphenicol ML1) อาหารเลี้ยงเชื้อบ่มที่ 28 องศาเซลเซียสในความมืดและตรวจสอบทุกวันเพื่อประเมินการเจริญเติบโตของเส้นใยเชื้อราเอนโดไฟท์โผล่ออกมาจากกลุ่ม เคล็ดลับ hyphal ส่วนบุคคลของเชื้อราต่างๆได้ถูกตัดออกจากแผ่นวุ้นที่วางไว้บนสื่อใหม่PDA, และบ่มที่ 28 องศาเซลเซียสเป็นเวลาอย่างน้อย 10 วัน แต่ละวัฒนธรรมเชื้อราได้รับการตรวจสอบเพื่อความบริสุทธิ์และโอนไปยังอีกแผ่น PDA โดยวิธีปลาย hyphal (Strobel et al. 1996) เพื่อให้แน่ใจว่าการฆ่าเชื้อที่พื้นผิวได้ออกทั้งหมดและเส้นใย chlamydospores ภายนอกยึดมั่นในส่วนที่ surfacesterilized ส่วนถูกตราตรึงใจไปพร้อม ๆ กันใน PDA แผ่นวุ้นและบ่มภายใต้เงื่อนไขเดียวกัน (Kusari et al. 2013) กลุ่มเดียวที่เป็นลบในการทดสอบนี้ถูกนำมาใช้ในการแยก endophyte เชื้อเชื้อราได้รับหมายเลขและเก็บไว้บนพื้นผิวของแผ่นพีดีเอที่ 4 C หรือเป็นสปอร์และเส้นใย15% (v / v) กลีเซอรีนที่ 70 องศาเซลเซียสทุกสายพันธุ์ของเชื้อราถูกแบ่งคร่าวและdereplicated โดยการสังเกตลักษณะทางสัณฐานวิทยาและวัฒนธรรมของพวกเขารวมทั้งลักษณะของโคโลนีบนจานและ slants การปรากฏตัวของเส้นใยทางอากาศและพื้นผิวเส้นใย, สปอร์สีมวลสีอาณานิคมที่โดดเด่นกลับแพร่เม็ดสีและ sporophore และสัณฐานวิทยาห่วงโซ่ของสปอร์ (Wang et al. 2011) บางสายพันธุ์ sporulated ได้อย่างง่ายดายบน PDA สื่อหลังวันที่ 1 สัปดาห์ของการฉีดวัคซีนในความมืดวันที่ 28 องศาเซลเซียสหลายอาณานิคมที่มีความคล้ายคลึงกันในสีรูปร่างและขนาดที่ถูกตั้งข้อสังเกตสำหรับความยาวhyphal และโครงสร้างภายใต้กล้องจุลทรรศน์แสงช่วยให้พวกเขาที่จะแยกเป็นสายพันธุ์ที่แตกต่างกัน. ที่เหลือสายพันธุ์เชื้อราหมันถูกยัดเยียดให้โมเลกุลวิธีการของประชาชน ขึ้นอยู่กับการจัดกลุ่มเบื้องต้น24 morphotypes ถูกเลือกสำหรับโมเลกุลต่อประชาชนและการวิเคราะห์สายวิวัฒนาการ. รวมสกัดดีเอ็นเอจีโนมขยาย PCR และการวิเคราะห์สายวิวัฒนาการแต่ละเชื้อราเอนโดไฟท์เป็นที่เลี้ยงในน้ำซุปพีวันที่28 C ที่มีอย่างต่อเนื่องสั่น7 วัน เส้นใยเชื้อราถูก freezedried, และดีเอ็นเอถูกสกัดแล้วโดย cetyltrimethylammonium วิธีโบรไมด์ (Zhang et al. 2006) ดีเอ็นเอได้ภายใต้การขยาย PCR โดยใช้ไพรเมอร์ITS1 และ ITS4 (สีขาว et al. 1990) ส่วนขยายประกอบด้วย ITS1, 5.8S และภูมิภาค ITS4 ของ rDNA ปฏิกิริยา PCR ได้ดำเนินการใน 50 มิลลิลิตรผสมปฏิกิริยาที่มี25 มิลลิลิตร 2? Taq PCR Mastermix (Tiangen Biotechnol Beijin จำกัด บริษัท จีน) 2 มิลลิลิตรไพรเมอร์ไปข้างหน้า (10 มิลลิเมตร) 2 มิลลิลิตรไพรเมอร์กลับ (10 มิลลิเมตร) 2 มิลลิลิตรดีเอ็นเอแม่แบบและ19 มิลลิลิตรน้ำสองครั้งที่กลั่นผ่านการฆ่าเชื้อ โปรโตคอลการขี่จักรยาน PCR ประกอบไปด้วย denaturation เริ่มต้นที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 นาที 30 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติ, การอบและการยืดตัวที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา30 วินาที 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที โปรโตคอลนี้ตามด้วยขั้นตอนสุดท้ายของการยืดตัว 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที ในฐานะที่เป็นเชิงลบควบคุมดีเอ็นเอแม่แบบก็ถูกแทนที่ด้วย doubledistilled ผ่านการฆ่าเชื้อน้ำ ผลิตภัณฑ์ขยาย PCR วิเคราะห์ข่าวคราวที่ประมาณ500 bp bpe800 การทำให้บริสุทธิ์และลำดับของผลิตภัณฑ์ PCR ได้ดำเนินการโดยเซี่ยงไฮ้Invitrogen บริษัท จำกัด (เซี่ยงไฮ้) ส่วนของภูมิภาค ITS ได้ติดใจในทั้งสองทิศทางใช้ABI 377 ซีเควนดีเอ็นเออัตโนมัติ. สำหรับการระบุสายพันธุ์ที่เชื้อรา rDNA-ITS ลำดับถูกจับคู่กับฐานข้อมูลเบื่อหน่ายโดยใช้พื้นฐานการจัดท้องถิ่นเครื่องมือค้นหาแห่งชาติสหรัฐศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพ(NCBI) สำหรับการระบุขั้นสุดท้ายของเชื้อราเอนโดไฟท์ ลำดับถูกจัดชิดโดยใช้ClustalW-Pairwise การจัดลำดับของ EMBL ฐานข้อมูลลำดับเบส ญาติที่เหมาะสมที่สุดลำดับที่ได้รับการคัดเลือกขึ้นอยู่กับตัวตนที่สูงสุดและสารตั้งต้นในฐานข้อมูลNCBI และนำเข้ามาในMEGA 4.0 (ทามูระ et al. 2007) เผยให้เห็นระยะทางพันธุกรรมระหว่างสายพันธุ์ของเชื้อราที่แตกต่างกันอย่างสังหรณ์ใจเราสร้างต้นไม้สายวิวัฒนาการที่หยั่งรากโดยใช้เพื่อนบ้านเข้าร่วมวิธีการทำงานร่วมกันที่มีการวิเคราะห์บูต1000 ซ้ำ. ในหลอดทดลองกิจกรรมปฏิปักษ์ของเชื้อราเอนโดไฟท์กับOryza sativa phytopathogens ในหลอดทดลองพฤติกรรมปฏิปักษ์ของคนเหล่านั้น ตัวแทน 24 สายพันธุ์ของเชื้อราเอนโดไฟท์ morphotypes ได้มีการทดสอบกับOryza sativa phytopathogens ที่พบบ่อย Thanatephorus cucumeris FJXA3313 และ Xanthomonas oryzae BJXA3313 ทั้งสอง phytopathogens ที่ได้รับจากวิทยาลัยพืชไร่ในมณฑลเจียงซีเกษตรมหาวิทยาลัยหนานฉาง, จีน ปฏิปักษ์พฤติกรรมกับตัน cucumeris FJXA3313 ถูกตรวจพบโดยใช้แผ่นคู่วัฒนธรรมการทดสอบการเป็นปรปักษ์กัน(Kusari et al. 2013) ปลั๊ก (5 มิลลิเมตร) ของแต่ละเชื้อราเอนโดไฟท์และ phytopathogen ถูกร่วมเลี้ยงใน PDA ที่กล่าวมาก่อนหน้านี้และบ่มที่28 องศาเซลเซียสปลั๊กถูกวางไว้แล้วที่สองตรงข้ามขอบของอาหารเลี้ยงเชื้อหันหน้าเข้าหากัน Phytopathogen คนเดียวได้รับเชื้อเป็นตัวควบคุม ขนาดเส้นผ่าศูนย์กลางการเจริญเติบโตของเชื้อราเอนโดไฟท์และ phytopathogen ถูกตรวจสอบและบันทึกประจำวัน การควบคุมทั้งหมดและแผ่นทดสอบวิ่งในเพิ่มขึ้นสามเท่า. เพื่อตรวจสอบพฤติกรรมที่เป็นปฏิปักษ์กับเอ็กซ์ oryzae BJXA3313 เราเพาะเลี้ยงเชื้อราที่แยกได้ในน้ำซุป PD ที่28 C และ 180 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 de15 d ส่วนผสมของเส้นใยถูกหมุนเหวี่ยงที่ 10 000? กรัมเป็นเวลา 5 นาทีและเงินฝากของเส้นใยที่ถูกทิ้ง. น้ำซุปหมักถูกกรองแล้วปลอดเชื้อ. กรองวัฒนธรรมผ่านการฆ่าเชื้อ (200 มิลลิลิตร) แยกแต่ละถูกย้ายลงในถ้วยฟอร์ดหนึ่งและแผ่นสองชั้นวิธีการที่ใช้เพื่อให้บรรลุการทดสอบยาต้านจุลชีพในเพิ่มขึ้นสามเท่า(Alford และเป้ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

Dongxiang County , จังหวัดเจียงซี , จีนในเดือนพฤศจิกายน 2013 .
ตัวอย่างทั้งหมดจะถูกเก็บไว้ในช่องแช่แข็งและทันทีที่นำ
เพื่อปฏิบัติการ เนื้อเยื่อของตัวอย่างจากภายใน 24 h .

ราเอนโดไฟต์ที่แยกราเอนโดไฟต์
พืชถูกล้างให้สะอาดด้วย ใช้น้ำก๊อก
และใบ แข็งแรง ลำต้น และรากถูกตัดเป็น
ชิ้นเล็ก ( 3 cme5 ซม. ) ภายใต้สภาวะปลอดเชื้อ sterilisation พื้นผิว
ราก เมล็ด ลำต้น และใบ มีวัตถุประสงค์
1 % โซเดียม ไฮโปคลอไรท์ 4 mine5 มินแล้วกับ
2.5 % โซเดียมไธโอซัลเฟต 10 นาที ( เอาโซเดียมไฮโปคลอไรต์
ตกค้าง ) ก่อนการรักษาด้วยแอลกอฮอล์ 75 %
1 นาที ร่องรอยของโซเดียมไฮโปคลอไรต์ถูกเอาออกโดยการล้างด้วยน้ำกลั่นฆ่าเชื้อ
.เนื้อเยื่อถูกทำแห้งภายใต้
ปลอดเชื้อแบบอากาศไหล , ตัดเป็นส่วนเล็ก ( ประมาณ
0.5 ซม. แต่ละ ) และจากนั้นโอนไปยังจานเลี้ยงเชื้อ ( 9 ซม. )
บรรจุอาหารเลี้ยงเชื้อ potato dextrose agar ( PDA ) (
( แก้ไขเพิ่มเติม 50 มก. ml1 chloramphenicol ) ในจานเพาะเลี้ยง
อุณหภูมิ 28 องศาเซลเซียส ในที่มืด และตรวจสอบทุกวันเพื่อประเมินการเจริญเติบโตของเชื้อราเอนโดไฟท์

) เกิดขึ้นจากกลุ่มแต่ละเส้นใยของเชื้อราต่าง ๆเคล็ดลับถูกลบออก
จากวุ้นแผ่น วางบนอาหาร PDA ใหม่
บ่มที่ 28 องศาเซลเซียส เป็นเวลาอย่างน้อย 10 วัน แต่ละที่มีวัฒนธรรม
ตรวจสอบความบริสุทธิ์และย้ายไปยังอีก
จาน PDA โดยวิธีปลายเส้นใย ( สโตรเบิล et al . 1996 ) เพื่อให้แน่ใจว่า
sterilisation ผิวออกทั้งหมด ) chlamydospores
ภายนอกและยึดมั่นในส่วนการ surfacesterilized

ส่วนจารึกพร้อมกันในจานวุ้น PDA และ บ่มภายใต้เงื่อนไขเดียวกัน ( คุซาริ
et al . 2013 ) เฉพาะส่วนที่เป็นลบในการทดสอบนี้ใช้สำหรับการแยก
endophyte . ส่วนเชื้อราไอโซเลท
เลขและเก็บไว้บนพื้นผิวของ PDA หรือจานที่ 4 C
เป็นสปอร์เส้นใยและ 15 % ( v / v ) กลีเซอรอลที่ 70 C .
ทั้งหมดสามารถจัดกลุ่มและ dereplicated เชื้อราไอโซเลท โดยสังเกตลักษณะทางวัฒนธรรมของ

และคุณลักษณะรวมทั้งลักษณะของโคโลนีบนแผ่น
slants และการปรากฏตัวของเส้นใยและเส้นใยจากวัสดุ , มวล
สปอร์สีโดดเด่นย้อนกลับอาณานิคมสี , สีโดด
และ sporophore สปอร์สัณฐานและโซ่
( Wang et al . 2011 )บางสายพันธุ์สามารถสร้างสปอร์มากใน PDA
สื่อหลังจาก 1 สัปดาห์ของการฉีดวัคซีนในความมืดที่ 28 C มากมาย
อาณานิคมที่คล้ายกันในรูปร่างสีและขนาด พบว่ามีความยาวเส้นใย
และโครงสร้างภายใต้กล้องจุลทรรศน์แสง
อนุญาตให้พวกเขาสามารถแยกได้เป็นแตกต่างแยกเชื้อราไอโซเลต
เหลือเป็นหมันถูกวิธี โมเลกุล
ของประชาชน .ขึ้นอยู่กับการจัดกลุ่มเบื้องต้น
24 morphotypes คัดเลือกเพิ่มเติมโมเลกุล
การจำแนกและการวิเคราะห์ phylogenetic .
รวมการสกัดดีเอ็นเอจีโนมและการวิเคราะห์ phylogenetic

( PCR แต่ละราเชื้อราเลี้ยงใน broth PD ที่ 28 C
คงสั่น 7 D เส้นใยเชื้อราถูกฟรีซดราย
, และดีเอ็นเอแล้ว สกัดจาก cetyltrimethylammonium
วิธีโบรไมด์ ( Zhang et al . 2006 )
ดีเอ็นเอภายใต้การขยาย PCR โดยใช้ primers และ
its1 its4 ( สีขาว et al . 1990 ) ส่วน amplified fragment
ประกอบด้วย its1 5.8s its4 , และภูมิภาคของ rDNA .
PCR ปฏิกิริยาแสดงปฏิกิริยาผสม 50 มิลลิลิตร บรรจุ 25 ml
2  แท็ค PCR mastermix ( บริษัท Beijin tiangen biotechnol
Ltd , China ) , 2 ml ของส่งต่อรองพื้น ( 10 มม. ) ,
ย้อนกลับ 2 มิลลิลิตร สีรองพื้น ( 10 มม. ) , 2 ml ของดีเอ็นเอแม่แบบ
19 ชนิดปลอดเชื้อ คู่ น้ำกลั่น ร่วมจักรยานโปรโตคอล
ประกอบด้วย ( เริ่มต้นที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 นาที 30
รอบ ( annealing และการยืดตัวที่ 94 C
30 , 60 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 วินาที และ 1 นาที 72 C โปรโตคอลนี้ตามมา
โดยขั้นตอนยืดสุดท้ายของ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที เป็น ความไม่ชอบมาพากล
,แม่แบบดีเอ็นเอถูกแทนที่ด้วย doubledistilled
ปราศจากน้ำ การตรวจวิเคราะห์โดยขยายผลิตภัณฑ์
เจลประมาณ 500 bpe800 BP . การจัดลำดับและผลิตภัณฑ์ PCR

ถูกดำเนินการโดยบริษัท Invitrogen จำกัดเซี่ยงไฮ้ ( เซี่ยงไฮ้ , จีน )
ส่วนของภูมิภาคเป็นลำดับในทั้งสองทิศทาง
ใช้ abi 377 อัตโนมัติ DNA sequencer .
สำหรับการระบุสายพันธุ์ของเชื้อราชนิด , ลำดับนิวคลีโอไทด์
ถูกจับคู่กับฐานข้อมูลโดยใช้พื้นฐาน
ท้องถิ่นเครื่องมือค้นหาของเราตั้งศูนย์สารสนเทศเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ
( ncbi ) สุดท้ายตัว
ของราเอนโดไฟท์ที่แยก . ลำดับ ชิดใช้
clustalw คู่ลำดับการเรียงตัวของสัตว
ลำดับนิวคลีโอไทด์ของฐานข้อมูลที่เหมาะสมที่สุดคือ เลือกตามลำดับญาติ

( สูงสุดและเอกลักษณ์ใน ncbi ฐานข้อมูลและนำเข้า
ร็อค 4.0 ( ทามูระ et al . 2007 ) เพื่อแสดงความแตกต่างทางพันธุกรรมระหว่างสายพันธุ์ของเชื้อราที่แตกต่างกัน

ฝังรากสังหรณ์ใจเราสร้าง phylogenetic ต้นไม้โดยใช้เพื่อนบ้านร่วมรวมกับการวิเคราะห์ด้วยวิธีบูตสแตรป


1 ได้แก่ในหลอดทดลองพบกิจกรรมของราเอนโดไฟท์ที่แยกกับ phytopathogens

ข้าวในหลอดทดลองพฤติกรรมของพวกปฏิปักษ์ 24 ตัวแทน
ราสายพันธุ์ทดสอบกับเชื้อรา morphotypes
ข้าวทั่วไป phytopathogens
fjxa3313 Xanthomonas oryzae thanatephorus ในลุ่มแม่น้ำท่าจีน และ bjxa3313 . ทั้ง phytopathogens
ได้มาจากวิทยาลัยพืชไร่ใน
เจียงซีการเกษตรมหาวิทยาลัย Nanchang , จีน พวกปฏิปักษ์
พฤติกรรมกับ ต. ในลุ่มแม่น้ำท่าจีน fjxa3313 ถูกตรวจพบโดยการใช้แผ่นกัน
สองวัฒนธรรม assay ( คุซาริ et al .
2013 ) ปลั๊ก ( 5 มม. ) ของแต่ละราเชื้อราและ phytopathogen
เป็น Co เพาะใน PDA ที่กล่าวถึงก่อนหน้านี้ และบ่มที่อุณหภูมิ 28 องศาเซลเซียส
ปลั๊กแล้ววางที่ 2 ตรงข้าม
ขอบของจานเพาะเลี้ยงซึ่งแต่ละอื่น ๆ phytopathogen
คนเดียวเป็นเชื้อเป็น การควบคุม ขนาดการเจริญเติบโตของเชื้อราเอนโดไฟท์ phytopathogen

และได้ตรวจสอบ และบันทึกประจำวัน การควบคุมและแผ่นทดสอบวิ่งใน
ทำสำเนาสามฉบับ .
ตรวจสอบพฤติกรรมปฏิปักษ์กับ X . oryzae
bjxa3313 เราเลี้ยงการแยกเชื้อราในน้ำซุปที่ PD
28 C 180 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 de15 Dเส้นใยผสมไฟฟ้า
ที่ 10 000  กรัมเป็นเวลา 5 นาทีและเงินฝากจึงถูกทิ้ง แล้วกรองน้ำหมักอยู่

aseptically . กรองวัฒนธรรมเป็นหมัน ( 200 ml ) ของแต่ละแยกโอน
เป็นหนึ่งถ้วยและจานอ๊อก , สร้างวิธี
ใช้บรรลุทดสอบสารต้านจุลชีพทั้งสามใบ
( & Ste ลฟ ์ด