To determine that a given OX40 รีเซ

To determine that a given OX40 รีเซปเตอร์ binding agent binds specifically to the ฮิวเมน OX40 protein, total cellular protein is extracted from mammalian cells that do not express the OX40 antigen, such as a
non-ลิมโฟไซต์ cell (e.g., a COS cell or a CHO cell), transformed with a nucleic 30 acid molecule encoding OX40. As a negative control, total cellular protein is also
extracted from corresponding non-transformed cells. These protein preparations
are then electrophorezed on a non-denaturing or denaturing polyacrylamide gel
(PAGE). Thereafter, the proteins are transferred to a membrane (for example, nitrocellulose) by Western blotting, and the agent to be tested is incubated with the membrane. After washing the membrane to remove non-specifically bound agent, the presence of bound agent is detected by the use of an antibody raised against the
test agent conjugated to a detection agent, such as the enzyme alkaline
5 phosphatase; application of the substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl
phosphate/nitro blue tetrazolium results in the production of a dense blue
compound by immuno-localized alkaline phosphatase. Agents which bind
specifically to ฮิวเมน OX40 will, by this technique, be shown to bind to the ฮิวเมน
OX40 band (which will be localized at a given position on the gel determined by its 10 molecular mass) in the extract from OX40 transformed cells, whereas little or no
binding will be observed in the extract from non-transformed cells. Non-specific
binding of the agent to other proteins may occur and may be detectable as a weak
signal on the Western blots. The nonspecific nature of this binding will be
recognized by one skilled in the art by the weak signal obtained on the Western 15 blot relative to the strong primary signal arising from the specific agent/ฮิวเมน
OX40 protein binding. Ideally, an OX40 รีเซปเตอร์ binding agent would not bind to
the proteins extracted from the non-transformed cells. In addition to binding
assays using extracted proteins, putative OX40 รีเซปเตอร์ binding agents may be
tested to confirm their ability to bind substantially only OX40 รีเซปเตอร์ in vivo by 20 conjugating the agent to a fluorescent tag (such as FITC) and analyzing its binding
to antigen activated CD4+ T-เซลล์ and non-activated T-เซลล์ populations by
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). An agent which binds substantially
only the OX40 รีเซปเตอร์ will stain only activated CD4+ T-เซลล์s.
The term "vector" refers to a nucleic acid molecule capable of transporting 25 another nucleic acid molecule in a host cell. Examples of vectors รวมถึง plasmids,
viral vectors, cosmid or phage vectors, and naked DNA or RNA expression vectors.
Some vectors are capable of autonomous replication in a host cell into which they
are introduced. Some vectors can be integrated into the genome of a host cell upon
introduction into the host cell, and thereby are replicated along with the host
30 genome. Certain vectors are capable of directing the expression of genes to which
they are operatively linked, and therefore may be referred to as "expression
vectors."
As used herein, the twenty conventional amino acids and their abbreviations follow conventional usage.
The การประดิษฐ์ provides an isolated antibody that binds ฮิวเมน CD134
ซึ่งประกอบรวมด้วย a บริเวณ แปรผัน สายเบา (VL) ของ SEQ ID NO: 100 and a บริเวณ แปรผัน สายหนัก (VH) ซึ่งประกอบรวมด้วย heavy chain complementarity determining regions (HCDR)s HCDR1, HCDR2 and HCDR3, optionally having 1, 2 or 3 amino acid
substitutions in the VL ของ SEQ ID NO: 100.

ในบาง รูปลักษณะ described herein, the isolated antibody ประกอบรวมด้วย the VH ซึ่งประกอบรวมด้วย the amino acid sequence ของ SEQ ID NO: 152, optionally having 1, 2 or 3 amino acid substitutions in the VH ของ SEQ ID NO: 152.

ในบาง รูปลักษณะ described herein, the isolated antibody ประกอบรวมด้วย the VH ซึ่งประกอบรวมด้วย the amino acid sequence ของ SEQ ID NO: 99, optionally having 1, 2 or 3 amino acid substitutions in the VH ของ SEQ ID NO: 99.
ในบาง รูปลักษณะ described herein, the isolated antibody ประกอบรวมด้วย the VL ของ SEQ ID NO: 100 and the VH ของ SEQ ID NO: 152.
15 ในบาง รูปลักษณะ described herein, the isolated antibody ประกอบรวมด้วย the
HCDR3 ซึ่งประกอบรวมด้วย the amino acid sequence ของ SEQ ID NOs: 16, 144 or 145.
ในบาง รูปลักษณะ described herein, the isolated antibody ประกอบรวมด้วย the HCDR2 ซึ่งประกอบรวมด้วย the amino acid sequence ของ SEQ ID NOs: 15, 141, 142 or 143. ในบาง รูปลักษณะ described herein, the isolated antibody ประกอบรวมด้วย the
20 HCDR1 ซึ่งประกอบรวมด้วย the amino acid sequence ของ SEQ ID NO: 14.
ในบาง รูปลักษณะ described herein, the isolated antibody ประกอบรวมด้วย
a) the VL ซึ่งประกอบรวมด้วย the amino acid sequence ของ SEQ ID NOs: 67 or 68; and
the VH ซึ่งประกอบรวมด้วย the amino acid sequence ของ SEQ ID NOs: 69, 70, 71, 119,
120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 146, 147 or
25 148, optionally having 1, 2 or 3 amino acid substitutions at the VH linear amino
acid residue positions 11, 55 or 99; or
b) the VL and the VH ซึ่งประกอบรวมด้วย the amino acid sequences of
ในบาง รูปลักษณะ described herein, the isolated antibody ประกอบรวมด้วย the
VL and the VH ของ SEQ ID NOs: 67 and 119, 67 and 120, 67 and 121, 67 and 122, 67
and 123, 67 and 124, 67 and 125, 67 and 126, 67 and 127, 67 and 128, 67 and 129, 5 67 and 130, 67 and 131, 67 and 132, 67 and 133, 67 and 146, 67 and 147. 67 and
148, 68 and 119, 68 and 120, 68 and 121, 68 and 122, 68 and 123, 68 and 124, 68
and 125, 68 and 126, 68 and 127, 68 and 128, 68 and 129, 68 and 130, 68 and 131,
68 and 132, 68 and 133, 68 and 146, 68 and 147 or 68 and 148, ตามลำดับ.
ในบาง รูปลักษณะ described herein, the antibody is an อะโกนิสต์ of CD134.
10 ในบาง รูปลักษณะ described herein, the antibody ประกอบรวมด้วย a
substitution in an Fc region.
ในบาง รูปลักษณะ described herein, the substitution ประกอบรวมด้วย a
S267E/L328F substitution, an E233D/G237D/H268D/P271G/A330R substitution, a
V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S substitution, or a
15 M252Y/S254T/T256E substitution, โดยที่ residue numbering is according to the
EU Index.
Antibodies whose heavy chain, light chain, VH or VL amino acid sequences differ insubstantially from those described herein are encompassed within the
scope of the การประดิษฐ์. Insubstantial differences are substitutions of 1, 2, 3, 4, 5, 6,
20 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15 amino acids in an antibody variable region sequence
that do not adversely affect antibody properties. Amino acid sequences
substantially identical to the variable region sequences disclosed herein are within
the scope of the การประดิษฐ์. ในบาง รูปลักษณะ, the sequence identity can be
about 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or higher. Percent
25 identity can be determined for example by pairwise alignment using the default
settings of the AlignX module of Vector NTI v.9.0.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA).
The protein sequences of the การประดิษฐ์นี้ can be used as a query sequence to
perform a search against public or patent databases to, for example, identify
related sequences. Exemplary programs used to perform such searches are the
30 XBLAST or BLASTP programs (http//www_ncbi_nlm/nih_gov), or the
GenomeQuestTM (GenomeQuest, Westborough, MA) suite using the default
settings.







21
Typically, this involves one or more conservative amino acid substitutions with an amino acid having similar charge, hydrophobic, or stereo chemical
characteristics in the antigen-binding site or in the framework without adversely altering the properties of the antibody. Conservative substitutions may also be
5 made to improve antibody properties, for example stability or affinity. 1, 2, 3, 4, 5,
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15 amino acid substitutions can be made to the VH
or VL sequence. ในบาง รูปลักษณะ, 1, 2 or 3 substitutions are made to the VH
or the VL of the antibody described herein. Exemplary conservative amino acid
substitutions are shown in Table 1. Furthermore, any native residue in the
10 โพลีเปปไทด์ may also be substituted with alanine, as has been previously described
for alanine scanning mutagenesis (MacLennan et al (1998) Act Physiol. Scand.
Suppl 643:55-67; Sasaki et al (1998) Adv. Biopsy's. 35:1-24).
แอนติ-CD134 antibodies described herein that are modified to improve their stability, selectivity, cross-reactivity, affinity, immunogenicity or other desirable
15 biological or biophysical property are within the scope of the การประดิษฐ์. Stability of
an antibody is influenced by a number of factors, ที่รวมถึง (1) core packing of
individual domains that affects their intrinsic stability, (2) protein/protein interface
interactions that have impact upon the HC and LC pairing, (3) burial of polar and
charged residues, (4) H-bonding network for polar and charged residues; and (5) 20 surface charge and polar residue distribution among other intra- and inter-
molecular forces (Worn et al, J. Mol. Biol., 305:989-1010, 2001).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เพื่อตรวจสอบว่า ตัวกำหนด OX40 รีเซปเตอร์ผูกแทน binds โดยเฉพาะกับโปรตีน OX40 ฮิวเมน สกัดโปรตีนรวมโทรศัพท์มือถือจากเซลล์ mammalian เป็นไม่ตรวจหา OX40 เช่น การ ลิมโฟไซต์ไม่ใช่เซลล์ (เช่น COS เซลล์หรือเซลล์ช่อ), แตกต่างเป็นโมเลกุลกรด nucleic 30 รหัส OX40 เป็นตัวควบคุมค่าลบ โปรตีนรวมโทรศัพท์มือถือยังเป็น สกัดจากเซลล์ไม่ใช่แปลงที่เกี่ยวข้อง เตรียมโปรตีนเหล่านี้ มี electrophorezed บนไม่ denaturing หรือ denaturing polyacrylamide เจแล้ว (หน้า) หลังจากนั้น โปรตีนที่โอน (เช่น nitrocellulose) เมมเบรน blotting วิธีตะวันตก และแทนที่จะทดสอบคือ incubated กับเมมเบรน หลังจากล้างเมมเบรนเอาตัวแทนไม่ใช่เฉพาะผูก ของตัวแทนเขตตรวจพบ โดยการใช้แอนติบอดีที่ขึ้นกับการกลวงทดสอบแทนการเป็นตัวแทนตรวจสอบ เช่นเอนไซม์อัลคาไลน์ฟอสฟาเตส 5 แอพลิเคชันของพื้นผิว 5-bromo-4-chloro-3-indolylผลผลิตสีฟ้าหนาแน่น tetrazolium ฟอสเฟต/nitro สีน้ำเงินผสม โดยเป็นภาษาท้องถิ่น immuno ฟอสฟาเตสด่าง ตัวแทนที่ผูกโดยเฉพาะกับฮิวเมน OX40 จะ โดยเทคนิคนี้ แสดงการผูกกับฮิวเมน วง OX40 (ซึ่งจะมีภาษาท้องถิ่นที่ตำแหน่งที่กำหนดบนเจตามมวลโมเลกุลของ 10) ในการดึงข้อมูลจาก OX40 เปลี่ยนเซลล์ ในขณะที่น้อย หรือไม่มี จะถูกดำเนินการผูกในสารสกัดจากเซลล์ไม่เปลี่ยน ไม่ใช่เฉพาะ ผูกตัวแทนกับโปรตีนอื่น ๆ อาจเกิดขึ้น และอาจตรวจเป็นความอ่อนแอ สัญญาณบนกันบล็อทตะวันตก ลักษณะเจาะจงของผูกนี้จะ รับรู้โดยผู้เชี่ยวชาญในศิลปะ โดยสัญญาณอ่อนรับในคืนใน 15 เวสตาสัมพันธ์กับสัญญาณหลักที่แข็งแกร่งเกิดขึ้นจากตัวแทน/ฮิวเมนเฉพาะ OX40 โปรตีนรวม แห่ง ตัว OX40 รีเซปเตอร์ผูกแทนจะไม่ผูกกับ โปรตีนที่สกัดจากเซลล์ไม่เปลี่ยน นอกจากผูก ใช้แยกโปรตีน assays, putative OX40 รีเซปเตอร์ประสานอาจ ทดสอบเพื่อยืนยันความสามารถในการผูก OX40 มากเฉพาะในสัตว์ทดลอง โดย 20 conjugating แทนการป้ายเรืองแสง (เช่น FITC) และวิเคราะห์ความผูกรีเซปเตอร์ การตรวจหาเรียก CD4 + T เซลล์และไม่เรียก T เซลล์ประชากรโดย Fluorescence เรียกเซลล์ที่เรียงลำดับ (FACS) ตัวแทนที่ binds มาก เฉพาะ OX40 รีเซปเตอร์จะติดเรียกใช้เฉพาะ CD4 + T-เซลล์sคำว่า "เวกเตอร์" หมายถึงโมเลกุลกรดนิวคลีอิกสามารถขนส่ง 25 อีกโมเลกุลกรดนิวคลีอิกในเซลล์โฮสต์ ตัวอย่างของเวกเตอร์รวมถึง plasmids ไวรัสเวกเตอร์ เวกเตอร์ cosmid หรือ phage และเปลือยดีเอ็นเอหรืออาร์เอ็นเอนิพจน์เวกเตอร์ Some vectors are capable of autonomous replication in a host cell into which they are introduced. Some vectors can be integrated into the genome of a host cell upon introduction into the host cell, and thereby are replicated along with the host 30 genome. Certain vectors are capable of directing the expression of genes to which they are operatively linked, and therefore may be referred to as "expression vectors."As used herein, the twenty conventional amino acids and their abbreviations follow conventional usage.The การประดิษฐ์ provides an isolated antibody that binds ฮิวเมน CD134ซึ่งประกอบรวมด้วย a บริเวณ แปรผัน สายเบา (VL) ของ SEQ ID NO: 100 and a บริเวณ แปรผัน สายหนัก (VH) ซึ่งประกอบรวมด้วย heavy chain complementarity determining regions (HCDR)s HCDR1, HCDR2 and HCDR3, optionally having 1, 2 or 3 amino acid substitutions in the VL ของ SEQ ID NO: 100.ในบาง รูปลักษณะ described herein, the isolated antibody ประกอบรวมด้วย the VH ซึ่งประกอบรวมด้วย the amino acid sequence ของ SEQ ID NO: 152, optionally having 1, 2 or 3 amino acid substitutions in the VH ของ SEQ ID NO: 152.ในบาง รูปลักษณะ described herein, the isolated antibody ประกอบรวมด้วย the VH ซึ่งประกอบรวมด้วย the amino acid sequence ของ SEQ ID NO: 99, optionally having 1, 2 or 3 amino acid substitutions in the VH ของ SEQ ID NO: 99. ในบาง รูปลักษณะ described herein, the isolated antibody ประกอบรวมด้วย the VL ของ SEQ ID NO: 100 and the VH ของ SEQ ID NO: 152.15 ในบาง รูปลักษณะ described herein, the isolated antibody ประกอบรวมด้วย theHCDR3 ซึ่งประกอบรวมด้วย the amino acid sequence ของ SEQ ID NOs: 16, 144 or 145.ในบาง รูปลักษณะ described herein, the isolated antibody ประกอบรวมด้วย the HCDR2 ซึ่งประกอบรวมด้วย the amino acid sequence ของ SEQ ID NOs: 15, 141, 142 or 143. ในบาง รูปลักษณะ described herein, the isolated antibody ประกอบรวมด้วย the20 HCDR1 ซึ่งประกอบรวมด้วย the amino acid sequence ของ SEQ ID NO: 14.ในบาง รูปลักษณะ described herein, the isolated antibody ประกอบรวมด้วยa) the VL ซึ่งประกอบรวมด้วย the amino acid sequence ของ SEQ ID NOs: 67 or 68; andthe VH ซึ่งประกอบรวมด้วย the amino acid sequence ของ SEQ ID NOs: 69, 70, 71, 119,120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 146, 147 or25 148, optionally having 1, 2 or 3 amino acid substitutions at the VH linear aminoacid residue positions 11, 55 or 99; orb) the VL and the VH ซึ่งประกอบรวมด้วย the amino acid sequences ofในบาง รูปลักษณะ described herein, the isolated antibody ประกอบรวมด้วย the VL and the VH ของ SEQ ID NOs: 67 and 119, 67 and 120, 67 and 121, 67 and 122, 67 and 123, 67 and 124, 67 and 125, 67 and 126, 67 and 127, 67 and 128, 67 and 129, 5 67 and 130, 67 and 131, 67 and 132, 67 and 133, 67 and 146, 67 and 147. 67 and 148, 68 and 119, 68 and 120, 68 and 121, 68 and 122, 68 and 123, 68 and 124, 68 and 125, 68 and 126, 68 and 127, 68 and 128, 68 and 129, 68 and 130, 68 and 131,68 and 132, 68 and 133, 68 and 146, 68 and 147 or 68 and 148, ตามลำดับ.ในบาง รูปลักษณะ described herein, the antibody is an อะโกนิสต์ of CD134.10 ในบาง รูปลักษณะ described herein, the antibody ประกอบรวมด้วย asubstitution in an Fc region.ในบาง รูปลักษณะ described herein, the substitution ประกอบรวมด้วย aS267E/L328F แทน แทนที่ E233D/G237D/H268D/P271G/A330R การ แทนที่ V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S หรือ ทดแทน 15 M252Y/S254T/T256E โดยที่เลขตกค้างตามการ ดัชนีใน EUแอนตี้หนักโซ่ สายไฟ VH หรือ VL กรดอะมิโนลำดับแตกต่าง insubstantially จากที่อธิบายนี้จะผ่านภายใน ขอบเขตของการการประดิษฐ์ ความแตกต่าง insubstantial จะแทน 1, 2, 3, 4, 5, 620 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 หรือ 15 กรดอะมิโนในลำดับตัวแปรภูมิภาคแอนติบอดีที่ไม่กระทบคุณสมบัติแอนติบอดี ลำดับกรดอะมิโนเหมือนกันมากเพื่อให้ตัวแปรลำดับที่เปิดเผยนี้อยู่ ขอบเขตของการการประดิษฐ์ ในบางรูปลักษณะ ลำดับรหัสประจำตัวได้ ประมาณ 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% หรือสูงกว่า เปอร์เซ็นต์ สามารถระบุตัว 25 ตัวอย่าง โดยจัดตำแหน่งแพร์ไวส์ที่ใช้เริ่มต้น การตั้งค่าโมดู AlignX v.9.0.0 เวกเตอร์ NTI (Invitrogen คาร์ลส CA) ลำดับโปรตีนของการประดิษฐ์นี้สามารถใช้เป็นแบบสอบถามลำดับการ ทำการค้นหาจากฐานข้อมูลสาธารณะ หรือสิทธิการ เช่น ระบุ ลำดับที่เกี่ยวข้อง ระบุโปรแกรมที่ใช้ทำการค้นหาเช่นการ โปรแกรม XBLAST หรือ BLASTP 30 (http / / www_ncbi_nlm/nih_gov), หรือ GenomeQuestTM (GenomeQuest, Westborough, MA) suite using the default settings. 21Typically, this involves one or more conservative amino acid substitutions with an amino acid having similar charge, hydrophobic, or stereo chemical characteristics in the antigen-binding site or in the framework without adversely altering the properties of the antibody. Conservative substitutions may also be5 made to improve antibody properties, for example stability or affinity. 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15 amino acid substitutions can be made to the VHor VL sequence. ในบาง รูปลักษณะ, 1, 2 or 3 substitutions are made to the VH or the VL of the antibody described herein. Exemplary conservative amino acid substitutions are shown in Table 1. Furthermore, any native residue in the 10 โพลีเปปไทด์ may also be substituted with alanine, as has been previously described for alanine scanning mutagenesis (MacLennan et al (1998) Act Physiol. Scand. Suppl 643:55-67; Sasaki et al (1998) Adv. Biopsy's. 35:1-24).แอนติ-CD134 antibodies described herein that are modified to improve their stability, selectivity, cross-reactivity, affinity, immunogenicity or other desirable15 biological or biophysical property are within the scope of the การประดิษฐ์. Stability ofan antibody is influenced by a number of factors, ที่รวมถึง (1) core packing ofindividual domains that affects their intrinsic stability, (2) protein/protein interface interactions that have impact upon the HC and LC pairing, (3) burial of polar and charged residues, (4) H-bonding network for polar and charged residues; and (5) 20 surface charge and polar residue distribution among other intra- and inter- molecular forces (Worn et al, J. Mol. Biol., 305:989-1010, 2001).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เพื่อตรวจสอบว่าได้รับ OX40 รีเซปเตอร์ที่มีผลผูกพันเฉพาะตัวแทนผูกกับฮิวเมนโปรตีน OX40 โปรตีนโทรศัพท์มือถือรวมสกัดจากเซลล์สัตว์ที่ไม่ได้แสดงแอนติเจน OX40
เช่นไม่ใช่ลิมโฟไซต์เซลล์(เช่น เซลล์ COS หรือเซลล์ CHO) เปลี่ยนกับนิวคลีอิก 30 โมเลกุลกรดเข้ารหัส OX40
เป็นตัวควบคุมเชิงลบโปรตีนรวมโทรศัพท์มือถือนอกจากนี้ยังมีสารสกัดจากเซลล์ที่สอดคล้องกันที่ไม่ได้เปลี่ยน การเตรียมโปรตีนเหล่านี้จะ electrophorezed นั้นไม่เสียสภาพหรือ denaturing เจลอะคริเลต (หน้า) หลังจากนั้นโปรตีนจะถูกโอนไปเมมเบรน (เช่นไนโตรเซลลูโลส) โดยซับตะวันตกและตัวแทนจะได้รับการทดสอบบ่มกับเมมเบรน หลังจากล้างเมมเบรนที่จะเอาตัวแทนที่ไม่ถูกผูกไว้โดยเฉพาะการปรากฏตัวของตัวแทนที่ถูกผูกไว้จะถูกตรวจพบโดยการใช้แอนติบอดียกกับตัวแทนการทดสอบผันกับตัวแทนการตรวจสอบเช่นอัลคาไลน์เอนไซม์5 phosphatase; แอพลิเคชันของพื้นผิว 5 โบรโม-4-chloro-3-indolyl ฟอสเฟต / ผล tetrazolium สีฟ้าไนโตรในการผลิตสีฟ้าหนาแน่นสารอัลคาไลน์ฟอสฟาโดยภูมิคุ้มกันที่มีการแปล ตัวแทนที่ผูกเฉพาะเพื่อฮิวเมน OX40 จะโดยเทคนิคนี้จะแสดงให้ผูกกับฮิวเมน OX40 วง (ซึ่งจะได้รับการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นในตำแหน่งที่ได้รับในเจลที่กำหนดโดย 10 มวลโมเลกุลของมัน) ในสารสกัดจาก OX40 เปลี่ยนเซลล์ในขณะที่เพียงเล็กน้อยหรือไม่มีผลผูกพันจะได้รับการตั้งข้อสังเกตในสารสกัดจากเซลล์ที่ไม่เปลี่ยน ไม่เฉพาะเจาะจงที่มีผลผูกพันของตัวแทนกับโปรตีนอื่น ๆ ที่อาจเกิดขึ้นและอาจมีการตรวจพบว่าเป็นที่อ่อนแอสัญญาณในblots ตะวันตก เชิญชมธรรมชาติของการเชื่อมโยงนี้จะถูกได้รับการยอมรับโดยหนึ่งที่มีฝีมือในงานศิลปะโดยสัญญาณอ่อนแอได้ในเวสเทิร์ blot 15 เมื่อเทียบกับสัญญาณหลักที่แข็งแกร่งที่เกิดขึ้นจากตัวแทนที่เฉพาะเจาะจง / ฮิวเมน OX40 โปรตีน จะเป็นการดีที่ OX40 รีเซปเตอร์ผูกพันตัวแทนจะไม่ผูกกับโปรตีนที่สกัดจากเซลล์ที่ไม่เปลี่ยน นอกจากนี้จะมีผลผูกพันการตรวจโดยใช้โปรตีนสกัด OX40 สมมุติรีเซปเตอร์ผูกพันตัวแทนอาจจะผ่านการทดสอบเพื่อยืนยันความสามารถในการผูกอย่างมากเพียงOX40 รีเซปเตอร์ในร่างกาย 20 conjugating ตัวแทนในการแท็กเรืองแสง (เช่น FITC) และ การวิเคราะห์ผลผูกพันของการเปิดใช้งานแอนติเจนCD4 + T- เซลล์และไม่เปิดใช้งานประชากร T- เซลล์โดยเซลล์เรืองแสงที่เปิดใช้งานการเรียงลำดับ(FACS) ตัวแทนที่ผูกอย่างมากเพียง OX40 รีเซปเตอร์จะเปื้อนเปิดใช้งานเพียง CD4 + T- เซลล์ s. คำว่า "เวกเตอร์" หมายถึงโมเลกุลของกรดนิวคลีอิกที่มีความสามารถในการขนส่ง 25 โมเลกุลกรดนิวคลีอิกอื่นในเซลล์โฮสต์ ตัวอย่างของเวกเตอร์รวมถึงพลาสมิด, พาหะไวรัส cosmid พาหะหรือทำลายจุลินทรีย์และดีเอ็นเออาร์เอ็นเอหรือเปล่าเวกเตอร์แสดงออก. เวกเตอร์บางคนที่มีความสามารถของการจำลองแบบอิสระในเซลล์โฮสต์ลงไปในสิ่งที่พวกเขาได้รับการแนะนำให้รู้จัก เวกเตอร์บางคนสามารถนำไปรวมในจีโนมของเซลล์โฮสต์อยู่กับการแนะนำเข้าสู่เซลล์โฮสต์และจึงถูกจำลองแบบพร้อมกับโฮสต์30 จีโนม เวกเตอร์บางอย่างมีความสามารถในการกำกับการแสดงออกของยีนที่มีการเชื่อมโยงผ่าตัดและดังนั้นจึงอาจจะเรียกว่า"การแสดงออกเวกเตอร์." ในฐานะที่ใช้ในที่นี้ที่ยี่สิบกรดอะมิโนธรรมดาและตัวย่อที่พวกเขาปฏิบัติตามการใช้งานทั่วไป. การประดิษฐ์ให้ แอนติบอดีแยกที่ผูกฮิวเมน CD134 ซึ่งประกอบรวมด้วยบริเวณแปรผันสายเบา (VL) ของ SEQ ID NO: 100 และบริเวณแปรผันสายหนัก (VH) ซึ่งประกอบรวมด้วย complementarity ห่วงโซ่หนักกำหนดภูมิภาค (HCDR) s HCDR1, HCDR2 HCDR3 และทางเลือกที่มี 1, 2 หรือ 3 กรดอะมิโนแทนในVL ของ SEQ ID NO: 100 ในบางรูปลักษณะที่อธิบายไว้ในที่นี้แอนติบอดีที่แยกประกอบรวมด้วย VH ซึ่งประกอบรวมด้วยกรดอะมิโนลำดับของ ID SEQ NO: 152, เลือกที่มี 1, 2 หรือ 3 แทนกรดอะมิโนใน VH ของ SEQ ID NO: 152 ในบางรูปลักษณะที่อธิบายไว้ในที่นี้แอนติบอดีที่แยกประกอบรวมด้วย VH ซึ่งประกอบรวมด้วยกรดอะมิโนลำดับของ ID SEQ NO: 99 ทางเลือกที่มี 1, 2 หรือ 3 แทนกรดอะมิโนใน VH ของ SEQ ID NO: 99 ในบางรูปลักษณะที่อธิบายไว้ในที่นี้แอนติบอดีที่แยกประกอบรวมด้วย VL ของ SEQ ID NO: 100 และ VH ของ SEQ ID NO: 152 15 ในบางรูปลักษณะที่อธิบายไว้ในที่นี้แอนติบอดีที่แยกประกอบรวมด้วยHCDR3 ซึ่งประกอบรวมด้วยกรดอะมิโนลำดับของ SEQ ID NOS: 16, 144 หรือ 145 ในบางรูปลักษณะที่อธิบายไว้ในที่นี้แอนติบอดีแยก ประกอบรวมด้วย HCDR2 ซึ่งประกอบรวมด้วยกรดอะมิโนลำดับของ SEQ ID NOS: 15, 141, 142 หรือ 143 ในบางรูปลักษณะที่อธิบายไว้ในที่นี้แอนติบอดีที่แยกประกอบรวมด้วย20 HCDR1 ซึ่งประกอบรวมด้วยลำดับกรดอะมิโน ของ SEQ ID NO: 14. ในบางรูปลักษณะที่อธิบายไว้ในที่นี้แอนติบอดีที่แยกประกอบรวมด้วยก) VL ซึ่งประกอบรวมด้วยกรดอะมิโนลำดับของ SEQ ID NOS: 67 หรือ 68; และVH ซึ่งประกอบรวมด้วยกรดอะมิโนลำดับของ SEQ ID NOS: 69, 70, 71, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 146, 147 หรือ25 148 ทางเลือกที่มี 1, 2 หรือ 3 แทนกรดอะมิโนที่อะมิโนเชิงเส้น VH ตกค้างกรดตำแหน่ง 11, 55 หรือ 99; หรือข) VL และ VH ซึ่งประกอบรวมด้วยลำดับกรดอะมิโนในบางรูปลักษณะที่อธิบายไว้ในที่นี้แอนติบอดีที่แยกประกอบรวมด้วยVL และ VH ของ SEQ ID NOS: 67 และ 119, 67 และ 120, 67 และ 121, 67 และ 122, 67 และ 123, 67 และ 124, 67 และ 125, 67 และ 126, 67 และ 127, 67 และ 128, 67 และ 129, 5 67 และ 130, 67 และ 131, 67 และ 132, 67 และ 133 67 และ 146, 67 และ 67 147 และ148, 68 และ 119, 68 และ 120, 68 และ 121, 68 และ 122, 68 และ 123, 68 และ 124, 68 และ 125, 68 และ 126, 68 และ 127, 68 และ 128, 68 และ 129, 68 และ 130, 68 และ 131, 68 และ 132, 68 และ 133, 68 และ 146, 68 และ 147 หรือ 68 และ 148 ตามลำดับ. ในบางรูปลักษณะที่อธิบายไว้ในที่นี้แอนติบอดีเป็นอะ โกนิสต์ของ CD134. 10 ในบางรูปลักษณะที่อธิบายไว้ในที่นี้แอนติบอดีประกอบรวมด้วยทดแทนในภูมิภาคFc. ในบางรูปลักษณะที่อธิบายไว้ในที่นี้ทดแทนประกอบรวมด้วยทดแทน S267E / L328F เป็น E233D / G237D / H268D / P271G / ทดแทน A330R เป็น V234A / G237A / P238S / H268A / V309L / เครื่องบิน A-330 / P331S ทดแทนหรือ15 M252Y / S254T / ทดแทน T256E, โดยที่เลขที่เหลือเป็นตามที่สหภาพยุโรปดัชนี. แอนติบอดีที่มีห่วงโซ่หนักเบา โซ่ VH หรือ VL ลำดับกรดอะมิโนที่แตกต่างกัน insubstantially จากที่ระบุไว้ในเอกสารฉบับนี้จะถูกห้อมล้อมภายในขอบเขตของการประดิษฐ์ ความแตกต่างที่ไร้สาระเป็นแทน 1, 2, 3, 4, 5, 6, 20 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, หรือ 15 กรดอะมิโนในลำดับภูมิภาคตัวแปรแอนติบอดีที่ไม่ส่งผลกระทบต่อแอนติบอดีคุณสมบัติ. ลำดับกรดอะมิโนอย่างมากเหมือนกันกับลำดับภูมิภาคตัวแปรเปิดเผยในที่นี้เป็นที่อยู่ในขอบเขตของการที่ประดิษฐ์ ในบางรูปลักษณะตัวตนลำดับสามารถเป็นประมาณ 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% หรือสูงกว่า ร้อยละ25 ตัวตนที่สามารถกำหนดได้เช่นโดยการจัดตำแหน่งจากจำนวนการใช้ค่าเริ่มต้นการตั้งค่าของโมดูลAlignX ของเวกเตอร์ NTI v.9.0.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA). ลำดับโปรตีนของการประดิษฐ์นี้สามารถนำมาใช้เป็นลำดับแบบสอบถาม เพื่อดำเนินการค้นหาฐานข้อมูลสาธารณะหรือสิทธิบัตรที่จะยกตัวอย่างเช่นระบุลำดับที่เกี่ยวข้อง โปรแกรมที่เป็นแบบอย่างที่ใช้ในการดำเนินการค้นหาดังกล่าวเป็น30 XBLAST หรือโปรแกรม BLASTP (http // www_ncbi_nlm / nih_gov) หรือGenomeQuestTM (GenomeQuest, เวสต์โบ, MA) ชุดโดยใช้ค่าเริ่มต้นการตั้งค่า. 21 โดยปกติแล้วจะเกี่ยวข้องกับหนึ่งหรือมากกว่ากรดอะมิโนที่อนุรักษ์นิยม แทนด้วยกรดอะมิโนที่มีค่าใช้จ่ายที่คล้ายกันชอบน้ำหรือสารเคมีสเตอริโอลักษณะในเว็บไซต์แอนติเจนที่มีผลผูกพันหรือในกรอบโดยไม่กระทบต่อการเปลี่ยนแปลงคุณสมบัติของแอนติบอดี แทนอนุรักษ์นิยมก็อาจจะเป็น5 ทำเพื่อปรับปรุงคุณสมบัติของแอนติบอดีเช่นความมั่นคงหรือความสัมพันธ์ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, หรือ 15 แทนกรดอะมิโนที่สามารถทำกับ VH หรือลำดับ VL ในบางรูปลักษณะ, 1, 2 หรือ 3 แทนจะทำกับ VH หรือ VL ของแอนติบอดีบรรยายในที่นี้ กรดอะมิโนที่เป็นแบบอย่างอนุรักษ์นิยมแทนจะแสดงในตารางที่ 1 นอกจากนี้สารตกค้างใด ๆ พื้นเมืองใน 10 โพลีเปปไทด์นอกจากนี้ยังอาจใช้แทนกับอะลานีนที่ได้รับการอธิบายก่อนหน้านี้สำหรับการสแกนฉับอะลานีน(MacLennan, et al (1998) พระราชบัญญัติ Physiol .. Scand Suppl 643: 55-67; ​​ซาซากิ, et al (1998) Adv 35 Biopsy ของ: 1-24)... แอนติ -CD134 แอนติบอดีที่อธิบายไว้ในที่นี้มีการแก้ไขเพื่อปรับปรุงเสถียรภาพของพวกเขาเลือกข้ามปฏิกิริยาสัมพันธ์ที่ใกล้ชิด , ภูมิคุ้มกันหรืออื่น ๆ ที่เป็นที่น่าพอใจ15 สถานที่ให้บริการทางชีวภาพหรือชีวฟิสิกส์อยู่ในขอบเขตของการที่ประดิษฐ์ เสถียรภาพของแอนติบอดีที่ได้รับอิทธิพลจากจำนวนของปัจจัยที่รวมถึง (1) การบรรจุหลักของแต่ละโดเมนที่มีผลต่อความมั่นคงที่แท้จริงของพวกเขา(2) โปรตีน / อินเตอร์เฟซโปรตีนปฏิสัมพันธ์ที่มีผลกระทบกับHC และการจับคู่ LC, (3) ฝังศพของขั้วโลกและสารตกค้างที่เรียกเก็บ(4) เครือข่าย H-พันธะสำหรับตกค้างขั้วโลกและค่าใช้จ่าย; และ (5) ค่าใช้จ่าย 20 พื้นผิวและการจัดจำหน่ายสารตกค้างอื่น ๆ ในหมู่ขั้วโลก intra- และระหว่างกองกำลังโมเลกุล(สวมใส่ et al, เจ Mol Biol 305:.. 989-1010, 2001)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เพื่อตรวจสอบว่าได้รับ ox40 รีเซปเตอร์ผูกตัวแทนโดยเฉพาะเพื่อฮิวเมน ox40 โปรตีน โปรตีนรวม สกัดจากเซลล์ ) เซลล์ที่ไม่แสดง ox40 แอนติเจน เช่น
- ลิมโฟไซต์ของเซลล์ ( เช่น เซลล์หรือเซลล์เป็นคอสโช ) , เปลี่ยนกับกรดนิวคลีอิกกรดโมเลกุล 30 ox40 การเข้ารหัส เป็นชุดควบคุมลบโปรตีนทั้งหมด มือถือยังไม่แปลงที่
สกัดจากเซลล์ เหล่านี้โปรตีนการเตรียม
แล้ว electrophorezed บนโนนี่ หรือ ี่ polyacrylamide gel
( หน้า ) หลังจากนั้น โปรตีนจะถูกโอนไปยังเยื่อ ( ตัวอย่างเช่น ไนโตร ) โดย Western blotting และตัวแทนที่จะทดสอบแยกด้วยเมมเบรนหลังจากล้างเยื่อเอาออกไม่เฉพาะผูกพันตัวแทน , การจำกัดเจ้าหน้าที่ตรวจพบ โดยการใช้แอนติบอดีขึ้นต่อต้าน
ทดสอบตัวแทน conjugated กับตัวแทนการตรวจสอบ เช่น เอนไซม์ alkaline phosphatase
5 ; การใช้พื้นผิว 5-bromo-4-chloro-3-indolyl
ฟอสเฟต / Nitro tetrazolium สีฟ้าผลลัพธ์ในการผลิตหนาแน่น สีฟ้า
มมูโนสารประกอบอัลคาไลน์ ฟอสฟาเตส โดยเฉพาะ ตัวแทนที่ผูก
โดยเฉพาะฮิวเมน ox40 จะ ด้วยเทคนิคนี้ จะแสดงให้ผูกกับฮิวเมน
ox40 วงดนตรี ( ซึ่งจะเป็นถิ่นที่ตำแหน่งที่ระบุบนเจล กําหนด โดย 10 มวลโมเลกุล ) สารสกัดจาก ox40 ลูบหน้าปะจมูก ในขณะที่เพียงเล็กน้อยหรือไม่มีเลย
ผูก จะพบสารสกัดจากไม่ลูบหน้าปะจมูก . ไม่เฉพาะเจาะจง
ผูกพันของตัวแทนกับโปรตีนอื่น ๆที่อาจเกิดขึ้น และอาจจะได้เป็นสัญญาณอ่อนแอ
บน blots ตะวันตก ธรรมชาติของการติดเชื้อนี้จะ
ผูกพันการมีทักษะในศิลปะ โดยสัญญาณอ่อนแอจากตะวันตก 15 blot เทียบกับแรงที่เกิดจากการส่งสัญญาณเฉพาะเจ้าหน้าที่ / ฮิวเมน
ox40 โปรตีน . นึกคิด , ox40 รีเซปเตอร์ผูกตัวแทนจะไม่ผูกกับ
โปรตีนสกัดจากไม่ลูบหน้าปะจมูก . นอกจากการใช้โปรตีนสกัด )
,ซึ่ง ox40 รีเซปเตอร์ปอยผมอาจ
ทดสอบเพื่อยืนยันความสามารถในการผูกอย่างมากเพียง ox40 รีเซปเตอร์โดย 20 conjugating สายลับป้ายเรืองแสง ( เช่น fitc ) และการวิเคราะห์ของการใช้แอนติเจน CD4 ผูกพัน
t - เซลล์และไม่เปิดใช้งาน T - เซลล์ประชากรโดยการกระตุ้นเซลล์เรียง
( facs )ตัวแทนซึ่งผูกอย่างมาก
เพียง ox40 รีเซปเตอร์คราบจะเพียงกระตุ้น CD4 T - เซลล์ S .
คำว่า " เวกเตอร์ " อ้างถึงความสามารถในการขนส่งโมเลกุลกรดนิวคลีอิกกรดนิวคลีอิก 25 อีกโมเลกุลในเซลล์โฮสต์ ตัวอย่างของเวกเตอร์รวมถึงเพื่อ
เวกเตอร์ไวรัสเวกเตอร์ cosmid หรือฟา และ DNA หรือ RNA เปลือยสีหน้าเวกเตอร์
บางเวกเตอร์มีความสามารถของตนเองซ้ำในเซลล์โฮสต์ในการที่พวกเขา
จะแนะนำ บางเวกเตอร์สามารถบูรณาการเข้าไปในจีโนมของเซลล์โฮสต์บน
บทนำเข้าสู่โฮสต์เซลล์และจึงเป็นซ้ำพร้อมกับโฮสต์
30 จีโนม . เวกเตอร์หนึ่งมีความสามารถในการกำกับการแสดงออกของยีนซึ่ง
พวกเขา operatively เชื่อมโยงและดังนั้นจึงอาจจะเรียกว่า " เวกเตอร์การแสดงออก
.
ที่ใช้ในที่นี้ ยี่สิบปกติกรดอะมิโนและคำย่อของพวกเขาตามการใช้งานปกติ การประดิษฐ์
ให้แยกแอนติบอดีที่ผูกฮิวเมน cd134
ซึ่งประกอบรวมด้วยเป็นบริเวณแปรผันสายเบา ( VL ) ของ seq id ไม่ :