Samples were stained according to a

Samples were stained according to an established protocol
(Alonso et al., 2012b, 2013c). Samples from cultures were accordingly
harvested by centrifugation at 16,000g for 5 min. Before
staining, cells were washed twice in phosphate-buffered saline
(PBS, pH 7.4, sterile and filtered at 0.22 lm). Propidium iodide
(PI, Invitrogen), bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol
(bis-oxonol, DiBAC4(3), Invitrogen) and carboxyfluorescein diacetate
(cFDA, Invitrogen) were used as fluorescent dyes in a double
dual-staining procedure (DiBAC4(3)/PI and cFDA/PI) in order to
evaluate cell physiological status (metabolic activity, membrane
integrity and membrane polarization were evaluated through
cFDA, PI and DiBAC4(3) staining, respectively). Staining procedures
were conducted as previously reported by Alonso et al. (2012b).
Flow cytometry measurements were performed using a
Cytomics FC 500 flow cytometer (Beckman Coulter) equipped with
a 488 and 633 nm excitation light source from an argon ion laser.
Green fluorescence from samples (corresponding to DiBAC4(3) and
cFDA-stained cells) was collected on the FL1 channel (530 nm),
whereas PI fluorescence was registered on the FL3 channel
(610 nm). Each analysis was performed in duplicate at a low flow
rate setting (4000 events/s). Data acquisition was carried out using
Cytomics RXP software (Beckman Coulter). Gates and quadrants
were established according to staining controls. For DiBAC4(3)/PI
and cFDA/PI dual-parameter flow cytometric analysis, data respectively
collected from 150,000 and 100,000 events were analyzed
using Summit v4.3 software (DakoCytomation, Colorado, USA).
.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ตัวอย่างมีสีตามโพรโทคอลการกำหนดขึ้น(Alonso et al., 2012b, 2013c) ตัวอย่างจากวัฒนธรรมก็ตามเก็บเกี่ยว โดย centrifugation ที่ 16000 g สำหรับ 5 นาทีก่อนย้อมสี เซลล์ถูกล้างในน้ำเกลือฟอสเฟต buffered ครั้ง(PBS, pH 7.4 กรอง และฆ่าเชื้อที่$ 0.22 lm) ไอโอไดด์ Propidium(PI, Invitrogen), bis- (1,3-dibutylbarbituric กรด) oxonol trimethine(bis-oxonol, DiBAC4(3), Invitrogen) และ carboxyfluorescein diacetate(cFDA, Invitrogen) ใช้เป็นสีเรืองแสงใน doubleขั้นตอนการย้อมสีคู่ (DiBAC4 (3) /PI และ cFDA/PI) เพื่อประเมินสถานะสรีรวิทยาเซลล์ (กิจกรรมเผาผลาญ เมมเบรนสมบูรณ์และเมมเบรนโพลาไรซ์ได้ประเมินผ่านcFDA, PI และ DiBAC4(3) ย้อมสี ตามลำดับ) ขั้นตอนการย้อมสีได้ดำเนินการก่อนหน้านี้ที่ รายงานโดย Alonso et al. (2012b)ดำเนินขั้นตอนการวัดเซลล์โดยใช้การCytomics FC 500 กระแส cytometer (Beckman Coulter) พร้อม488 และ 633 nm ในการกระตุ้นแสงจากเลเซอร์เป็นไอออนอาร์กอนสีเขียว fluorescence จากตัวอย่าง (ที่สอดคล้องกับ DiBAC4(3) และเซลล์สี cFDA) ถูกรวบรวมในช่อง FL1 (530 nm),ในขณะที่ปี่ fluorescence ถูกลงทะเบียนในช่อง FL3(610 nm) ทำการวิเคราะห์แต่ละสำเนาที่กระแสต่ำราคาตั้ง (เหตุการณ์ 4000 s) ข้อมูลการได้รับการดำเนินการใช้ซอฟต์แวร์ Cytomics RXP (Beckman Coulter) ประตูและ quadrantsได้ก่อตั้งตามควบคุมการย้อมสี สำหรับ DiBAC4 (3) /PIและ cFDA/PI สองพารามิเตอร์วิเคราะห์ไหล cytometric ข้อมูลตามลำดับรวบรวมจาก 150, 000 และ 100000 ได้วิเคราะห์เหตุการณ์ใช้ซอฟต์แวร์ v4.3 ซัม (DakoCytomation โคโลราโด สหรัฐอเมริกา).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ตัวอย่างสีตามโปรโตคอลที่จัดตั้งขึ้น
(อลอนโซ่ et al., 2012b, 2013c) ตัวอย่างจากวัฒนธรรมที่ถูกตามเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 16,000g เป็นเวลา 5 นาที ก่อนที่จะย้อมสีเซลล์ถูกล้างครั้งที่สองในน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์(พีบีเอสพีเอช 7.4 ผ่านการฆ่าเชื้อและกรองที่ 0.22 LM) ไอโอไดด์ Propidium (PI, Invitrogen) bis- (1,3-dibutylbarbituric กรด) trimethine oxonol (ทวิ oxonol, DiBAC4 (3), Invitrogen) และ carboxyfluorescein diacetate (CFDA, Invitrogen) ถูกนำมาใช้เป็นสีย้อมเรืองแสงในสองdual- ขั้นตอนการย้อมสี (DiBAC4 (3) / PI และ CFDA / PI) เพื่อประเมินสถานะทางสรีรวิทยาของเซลล์(กิจกรรมการเผาผลาญเมมเบรนความซื่อสัตย์และโพลาไรซ์เมมเบรนได้รับการประเมินผ่านCFDA, PI DiBAC4 และ (3) การย้อมสีตามลำดับ) ขั้นตอนการย้อมสีได้ดำเนินการตามที่รายงานก่อนหน้านี้โดยอลอนโซ่, et al (2012b). cytometry วัดได้ดำเนินการไหลโดยใช้Cytomics เอฟซีไหล cytometer 500 (Beckman Coulter) พร้อมกับ488 และ 633 นาโนเมตรแหล่งกำเนิดแสงกระตุ้นจากไอออนอาร์กอนเลเซอร์. เรืองแสงสีเขียวจากตัวอย่าง (ตรงกับ DiBAC4 (3) และcFDA- เซลล์สี) ที่ถูกเก็บรวบรวมในช่อง FL1 (530 นาโนเมตร) ในขณะที่ PI เรืองแสงได้รับการจดทะเบียนในช่อง FL3 (610 นาโนเมตร) การวิเคราะห์แต่ละคนได้ดำเนินการในที่ซ้ำกันในการไหลต่ำการตั้งค่าอัตรา (4000 เหตุการณ์ / s) เก็บข้อมูลได้รับการดำเนินการโดยใช้ซอฟแวร์ Cytomics RXP (Beckman Coulter) เกตส์และแนวทางที่ถูกจัดตั้งขึ้นตามการควบคุมการย้อมสี สำหรับ DiBAC4 (3) / PI และ CFDA / PI ไหลแบบ dual-พารามิเตอร์ cytometric วิเคราะห์ข้อมูลตามลำดับเก็บรวบรวมจาก150,000 และ 100,000 วิเคราะห์เหตุการณ์ที่เกิดขึ้นโดยใช้ซอฟต์แวร์การประชุมสุดยอดv4.3 (DakoCytomation โคโลราโดสหรัฐอเมริกา).

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

จำนวนที่เปื้อนตามการสร้างโปรโตคอล
( อลอนโซ่ et al . , 2012b 2013c , ) ตัวอย่างจากวัฒนธรรมตามข้อมูลการเก็บเกี่ยวโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 16000g

5 นาทีก่อนการย้อมสีเซลล์ถูกล้างสองครั้งในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (
( PBS , pH 7.4 , ฆ่าเชื้อและกรองที่ 0.22 LM ) propidium ไอโอไดด์
( พี , Invitrogen ) bis - ( 1,3-dibutylbarbituric acid ) trimethine oxonol
( oxonol ทวิ ,dibac4 ( 3 ) Invitrogen ) และ carboxyfluorescein ได ซิเตท
( CFDA Invitrogen , ) ถูกใช้เป็นหลอดสีในคู่สองขั้นตอน (
. dibac4 ( 3 ) / พี และ CFDA / PI ) เพื่อประเมินสถานภาพเซลล์สรีรวิทยา
( กิจกรรมการเผาผลาญเยื่อเมมเบรนประเมินความสมบูรณ์และโพลาไรเซชัน

CFDA ผ่าน , ปี่ และ ( 3 ) การ dibac4 ตามลำดับ ) ขั้นตอน
.การทดลองก่อนหน้านี้ที่รายงานโดยอลอนโซ่ et al . ( 2012b )
( การไหลวัดได้ใช้
cytomics FC 500 การใช้โมโน ( เบคแมน คูลเตอร์ ) พร้อมกับการแล้ว 633 nm แสงกระตุ้นที่มาจากอาร์กอนไอออนเลเซอร์ สีเขียวเรืองแสงจากตัวอย่าง
( ตรงกับ dibac4 ( 3 )
CFDA เปื้อนเซลล์ ) คือเก็บในช่อง fl1 ( 530 nm )
ส่วนไพเรืองจดทะเบียนใน fl3 ช่อง
( 610 nm ) การวิเคราะห์ในแต่ละซ้ำในอัตราการไหล
ต่ำ ( 4000 เหตุการณ์ / s ) ข้อมูล มีการใช้ซอฟต์แวร์ rxp
cytomics ( Beckman Coulter ) ประตู และเขต
ก่อตั้งขึ้นตามวิธีการควบคุม สำหรับ dibac4 ( 3 ) / pi
CFDA / PI และการวิเคราะห์ลักษณะการไหลแบบสองตัวแปรข้อมูลตามลำดับ
จำนวน 150 , 000 100000 เหตุการณ์และวิเคราะห์
โดยใช้ซอฟต์แวร์ v4.3 สุดยอด ( dakocytomation , Colorado , USA )