Macrogen. Data were analyzed by Gen

Macrogen. Data were analyzed by GeneScan software (Applied Biosystem,
Carlsbad, CA, USA).
Functional analysis of the p.X537A mutation
For glucocerebrosidase activity analysis, RNA of normal controls and patient 5
was extracted from peripheral blood leukocytes with QIAamp RNA blood mini
kit (Qiagen), then reverse-transcribed and amplified by PCR using primers
GBA-XhoI-F and GBA-EcoRI-R (Table 2) to add the XhoI and EcoRI sites at
the 50 and 30 ends, respectively. The amplified cDNA was cloned into the
pGEM-T Easy Vector System (Promega) and subsequently into the pcDNA3.1
expression vector (Invitrogen), and sequenced. These constructs were transiently
transfected into COS-7 (fibroblast) cells, using Lipofectamine 2000
(Invitrogen). After 24-hr transfection, cells were centrifuged and sonicated in
dH2O. Protein concentration was determined by BCA protein assay (Micro
BCA Protein Assay Kit, PIERCE, Rockford, IL, USA) and the glucocerebrosidase
activity was measured by fluorimetric assay using 4-methyl-umbelliferone-
b-D-glucopyranoside.
For protein expression analysis, the p.N409S (N370S) mutation, a positive
control for the enzyme mislocalization to the endoplasmic reticulum (ER),4
was generated using QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La
Jolla, CA, USA). The GBA clones were confirmed by direct sequencing. Cells
transfected with the wild-type, p.X537A and p.N409S (N370S) GBA were
immunoblotted to measure the level of glucocerebrosidase. Protein extracts
were prepared from cell pellets harvested in lysis buffer with freshly added
protease inhibitors, subjected to 10% polyacrylamide gel electrophoresis and

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Macrogen มีวิเคราะห์ข้อมูล โดยซอฟต์แวร์ GeneScan (ใช้ Biosystemคาร์ลบาด CA สหรัฐอเมริกา)งานวิเคราะห์การกลายพันธุ์ p.X537AGlucocerebrosidase กิจกรรมวิเคราะห์ RNA ปกติและผู้ป่วย 5ถูกแยกจากเลือดหญิงกับ QIAamp RNA เลือดมินิชุด (Qiagen), ทับ ศัพท์กลับ แล้วขยาย โดย PCR ที่ใช้ไพรเมอร์GBA-XhoI-F และ GBA EcoRI R (ตาราง 2) การเพิ่ม XhoI และ EcoRI ไซต์ที่50 และ 30 จบ ตามลำดับ ถูกโคลน cDNA ภาคขยายในตัวT pGEM ง่ายเวกเตอร์ระบบ (Promega) ในเวลาต่อ มา pcDNA3.1นิพจน์เวกเตอร์ (Invitrogen), และเรียงลำดับ โครงสร้างเหล่านี้ถูก transientlytransfected เป็น COS-7 (fibroblast) เซลล์ ใช้ Lipofectamine 2000(Invitrogen) หลังจาก 24 ชั่วโมง transfection เซลล์เหวี่ยง และ sonicated ในdH2O กำหนดความเข้มข้นของโปรตีน โดยทดสอบโปรตีน BCA (ไมโครชุดทดสอบโปรตีน BCA เพียร์ซ ร็อคฟอร์ด IL สหรัฐอเมริกา) และ glucocerebrosidaseกิจกรรมโดยวัดจากการทดสอบ fluorimetric ที่ใช้ 4-เมธิล-umbelliferone -b-D-glucopyranosideสำหรับวิเคราะห์การแสดงโปรตีน บวก การกลายพันธุ์ p.N409S (N370S)ควบคุม mislocalization เอนไซม์เพื่อการกเร (ER), 4สร้างโดยใช้ QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene ลาJolla, CA สหรัฐอเมริกา) โคลนที่ GBA ได้รับการยืนยัน โดยลำดับโดยตรง เซลล์transfected ป่าชนิด p.X537A และ p.N409S (N370S) มี GBAimmunoblotted การวัดระดับของ glucocerebrosidase สารสกัดจากโปรตีนเตรียมได้จากเซลล์เม็ดที่เก็บเกี่ยวในบัฟเฟอร์ lysis ด้วยสดเพิ่มรตีเอส ผ่านอิ polyacrylamide เจล 10% และ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

Macrogen วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ซอฟแวร์ Genescan (Applied Biosystem,
Carlsbad, CA, USA).
การวิเคราะห์การทำงานของการกลายพันธุ์ p.X537A
สำหรับการวิเคราะห์กิจกรรม glucocerebrosidase, อาร์เอ็นเอของการควบคุมและผู้ป่วย 5 ปกติ
ถูกสกัดจากเม็ดเลือดขาวกับ QIAamp อาร์เอ็นเอมินิเลือด
Kit ( Qiagen) แล้วย้อนกลับคัดลอกและขยายโดยวิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์
GBA-XhoI-F และ GBA-EcoRI-R (ตารางที่ 2) เพื่อเพิ่ม XhoI และ EcoRI เว็บไซต์ที่
50 และ 30 ปลายตามลำดับ ซึ่งแปลเป็นโคลนขยายเข้าไปใน
pGEM-T ระบบเวกเตอร์ง่าย (Promega) และต่อมาเข้าสู่ pcDNA3.1
แสดงออกเวกเตอร์ (Invitrogen) และลำดับขั้นตอน โครงสร้างเหล่านี้ถูก transiently
transfected เข้า COS-7 (fibroblast) เซลล์โดยใช้ Lipofectamine 2000
(Invitrogen) หลังจากที่ตลอด 24 ชั่วโมง transfection เซลล์ถูกปั่นและ sonicated ใน
dH2O ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดโดยการทดสอบโปรตีน BCA (Micro
BCA โปรตีน Assay Kit, เพียร์ซฟอร์ด, อิลลินอยส์, สหรัฐอเมริกา) และ glucocerebrosidase
กิจกรรมโดยวัดจากการทดสอบโดยใช้ fluorimetric 4-methyl-umbelliferone-
BD-glucopyranoside.
สำหรับการวิเคราะห์การแสดงออกของโปรตีนพี .N409S (N370S) การกลายพันธุ์เป็นบวก
การควบคุมสำหรับ mislocalization เอนไซม์กับร่างแหเอนโดพลาซึม (ER) 4
ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ QuikChange เว็บไซต์กำกับกลายพันธุ์ Kit (Stratagene, La
Jolla, CA, USA) โคลน GBA ได้รับการยืนยันโดยลำดับโดยตรง เซลล์
transfected กับ wild-type p.X537A และ p.N409S (N370S) GBA ถูก
immunoblotted ในการวัดระดับของ glucocerebrosidase สารสกัดจากโปรตีน
ที่เตรียมจากเม็ดเซลล์เก็บเกี่ยวในบัฟเฟอร์สลายกับการเพิ่มความสดใหม่
น้ำย่อยโปรตีนภายใต้ถึง 10% polyacrylamide gel electrophoresis และ