For the partial purification of lys

For the partial purification of lysozyme, egg whites,
carefully separated from the egg yolks, were diluted 3- or
3.3-fold with 0.05 M NaCl solution. To precipitate the egg
white proteins other than lysozyme, the pH of this
mixture was set to 4.0 by carefully adding several drops
of 1 N acetic acid and it was diluted with an equal volume
of 40%, 60%, or 80% (v/v) ethanol. After 0-, 2-, 4-, 6-
, 7-, or 8-h incubation at room temperature in the
presence of different concentrations of ethanol, the
mixtures were centrifuged at 15,000 x g for 15 min at 4
°C; then the precipitates were discarded. The
supernatants were analyzed for their lysozyme activity
and protein content to determine the effects of different
procedures on the efficiency of partial purification.
Dialysis and lyophilization of partially purified
lysozyme
The lyophilized lysozymes were obtained by using
supernatants from centrifugation of ethanol-treated
(40%, 60%, or 80%) and 6-h (or 7-h) incubated
samples. Before lyophilization, the supernatants
containing lysozyme were dialyzed for 21 h at 4 °C by 3
changes of 2000 ml of distilled water. Lyophilization was
applied by a freeze drier (Labconco, FreeZone, 6 liter,
Kansas City, MO, USA) with –44 to –47 °C collector
temperature, and 50 x 10-3 and 100 x 10-3 mbar vacuum.
The sample container volume was 2-3 times the sample
volume. The lyophilized enzymes were kept at –18 °C
until they were used in different studies.
Protein content and enzyme activity of lyophilized
partially purified lysozymes
The protein content and residual enzyme activity of
lyophilized enzymes were determined by dissolving 20
mg of lyophilized preparation in 10 ml of distilled water.
After centrifugation at 15 000 x g for 15 min at 4 °C, the
residual lysozyme activity and protein content of the
enzyme preparations were determined by the methods
given below. Protein content was expressed as mg
protein per mg of powder, while enzyme activity was
expressed as U per mg of powder or protein.
Thermal stability of lyophilized partially purified
lysozyme
Thermal inactivation studies were conducted at 60,
70, 80, and 90 °C with thermal inactivation time (TIT)
tubes (i.d.: 9 mm; wall thickness: 1 mm). To minimize
the lag phase, TIT tubes were heated to inactivation
temperature. Then, 0.2 ml of the enzyme solution was
prepared by dissolving lyophilized lysozyme in 0.05 M
Na-phosphate buffer (pH 7.0), which was then pipetted
into the TIT tubes. After heating for a given period the
tubes were cooled in an ice water bath and their contents
were immediately assayed for residual lysozyme activity.
The calculation of heat inactivation parameters of
lysozyme was conducted by applying the standard
methods that explain enzyme and microbial inactivation
kinetics by a first order reaction (Holdsworth, 1997).
The heat inactivation curves were formed by plotting log
of percent remaining activity vs. heating time (min). The
inactivation rate constants (k min-1) were calculated by
multiplying the slope of the heat inactivation curves by
the factor of 2.303. The half-lives (t1/2, min), which refer
to the heating time at constant temperature to achieve
50% inactivation of the enzyme, were calculated from
the formula t1/2 = ln (0.5) k-1. The decimal reduction
times (D, min), which refer to the heating time at
constant temperature to achieve 90% inactivation of the
enzyme, were calculated from the negative reciprocals of
the slopes of the heat inactivation curves. The z values
(°C) that show the temperature dependency of heat
inactivation was calculated from the equation z = T2-
T1/log (D1/D2), where T is temperature (°C).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การทำให้บริสุทธิ์บางส่วนของ lysozyme ไข่ขาวอย่างแยกออกจากไข่แดง ถูกแตกออก 3 - หรือ3.3-fold ด้วย 0.05 M NaCl โซลูชัน การ precipitate ไข่โปรตีนสีขาวไม่ใช่ lysozyme, pH นี้ส่วนผสมถูกตั้งค่าให้ 4.0 เพิ่มหลายหยดอย่างระมัดระวัง1 N กรดอะซิติกและถูกผสม ด้วยปริมาณเท่ากัน40%, 60% หรือเอทานอล 80% (v/v) หลังจาก 0- 2- 4- 6-, 7 หรือ 8 h บ่มที่อุณหภูมิห้องในของความเข้มข้นแตกต่างกันของเอทานอล การมี centrifuged ที่ 15000 x g สำหรับ 15 นาทีส่วนผสมที่ 4° C แล้ว precipitates ถูกละทิ้ง ที่supernatants ได้วิเคราะห์กิจกรรมของ lysozymeและโปรตีนเพื่อกำหนดผลกระทบของการแตกต่างกันกระบวนการกับประสิทธิภาพของการทำให้บริสุทธิ์บางส่วนหน่วยและ lyophilization ของบางส่วนบริสุทธิ์lysozymeLyophilized lysozymes ได้รับ โดยใช้supernatants จาก centrifugation ของถือว่าเอทานอล(40%, 60% หรือ 80%) และ 6-h (หรือ 7 h) incubatedตัวอย่างการ ก่อน lyophilization, supernatantsประกอบด้วย lysozyme มี dialyzed สำหรับ h 21 ที่ 4 ° C 3การเปลี่ยนแปลงของ 2000 ml ของน้ำกลั่น Lyophilization ถูกใช้ โดยการแช่แข็งแห้ง (Labconco, FreeZone, 6 ลิตรแคนซัสซิตี้ MO สหรัฐอเมริกา) กับ –44 เพื่อรวบรวม –47 ° Cอุณหภูมิ และเครื่องดูดฝุ่น mbar 50 x 10-3 และ 100 x 10-3ปริมาตรเก็บตัวอย่างได้ 2 - 3 ครั้งตัวอย่างไดรฟ์ข้อมูล เอนไซม์ lyophilized ที่ถูกเก็บไว้ที่ –18 ° Cจนกว่าจะถูกใช้ในการศึกษาแตกต่างกันโปรตีนเอนไซม์และเนื้อหากิจกรรมของ lyophilizedlysozymes บริสุทธิ์บางส่วนกิจกรรมเนื้อหา และเหลือเอนไซม์โปรตีนของเอนไซม์ lyophilized ถูกกำหนด โดยยุบ 20มก.เตรียม lyophilized ใน 10 ml ของน้ำกลั่นหลังจาก centrifugation ที่ 15 000 x g สำหรับที่ 4 ° C, 15 นาทีเนื้อหากิจกรรมและโปรตีนของ lysozyme เหลือของเตรียมเอนไซม์ถูกกำหนด โดยวิธีการกำหนดให้ด้านล่าง โปรตีนถูกแสดงเป็นมิลลิกรัมโปรตีนต่อมิลลิกรัมของผง ในขณะเอนไซม์แสดงเป็น U ต่อมิลลิกรัมของผงหรือโปรตีนความมั่นคงความร้อนของ lyophilized บริสุทธิ์บางส่วนlysozymeได้ดำเนินการศึกษายกเลิกการเรียกความร้อนที่ 6070, 80 และ 90 ° C เวลายกเลิกการเรียกความร้อน (TIT)หลอด (ประชาชน: 9 มม. ความหนา: 1 mm) เพื่อลดขั้นตอนความล่าช้า TIT หลอดถูกความร้อนเพื่อยกเลิกการเรียกอุณหภูมิ แล้ว 0.2 ml ของเอนไซม์ถูกโดยยุบ lyophilized lysozyme ใน 0.05 Mนาฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7.0), ซึ่งเป็น pipetted แล้วเป็นหลอด TIT หลังจากเครื่องทำความร้อนสำหรับรอบระยะเวลาที่กำหนดในท่อระบายความร้อนด้วยน้ำเป็นน้ำแข็งและเนื้อหานอกจากนี้ได้ทันที assayed lysozyme เหลือกิจกรรมการคำนวณพารามิเตอร์การยกเลิกการเรียกความร้อนของlysozyme ถูกดำเนินการ โดยใช้มาตรฐานวิธีการที่อธิบายการยกเลิกการเรียกจุลินทรีย์และเอนไซม์จลนพลศาสตร์ โดยที่ปฏิกิริยาลำดับแรก (Holdsworth, 1997)เส้นโค้งการยกเลิกการเรียกความร้อนเกิดขึ้นจากการพล็อตล็อกเปอร์เซ็นต์คงเหลือ กิจกรรมเปรียบเทียบกับความร้อนเวลา (นาที) ที่ยกเลิกการเรียกค่าคงที่อัตรา (k min-1) คำนวณได้โดยความชันของเส้นโค้งการยกเลิกการเรียกความร้อนโดยการคูณตัว 2.303 ครึ่งชีวิต (t1/2 นาที), ซึ่งอ้างอิงเวลาทำความร้อนที่อุณหภูมิคงที่เพื่อให้บรรลุ50% ยกเลิกการเรียกของเอนไซม์ คำนวณได้จากt1/2 สูตร = ln (0.5) k-1 การลดทศนิยมเวลา (D นาที), ซึ่งหมายถึงเวลาทำความร้อนที่อุณหภูมิคงที่เพื่อให้ยกเลิกการเรียก 90% ของการเอนไซม์ คำนวณได้คือค่าลบของลาดของเส้นโค้งการยกเลิกการเรียกความร้อน ค่า z(° C) ที่แสดงอ้างอิงอุณหภูมิความร้อนยกเลิกการเรียกคำนวณจากสมการ z = T2 -T1/ล็อก (ง 1/D2), โดยที่ T คือ อุณหภูมิ (° C)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สำหรับการทำให้บริสุทธิ์บางส่วนของไลโซไซม์, ไข่ขาว,
แยกออกจากกันอย่างระมัดระวังจากไข่แดงที่ถูกปรับลด 3 หรือ
3.3 เท่ากับ 0.05 M NaCl การแก้ปัญหา เพื่อให้เกิดการตกตะกอนไข่โปรตีนสีขาวอื่น ๆ นอกเหนือจากไลโซไซม์ค่า pH นี้ส่วนผสมถูกกำหนดให้4.0 โดยระมัดระวังเพิ่มหลายหยดของ1 N กรดอะซิติกและมันก็เจือจางด้วยปริมาณเท่ากับ40%, 60% หรือ 80% (v / โวลต์) เอทานอล หลังจาก 0-, 2, 4, 6, 7, 8 ชั่วโมงบ่มที่อุณหภูมิห้องในการปรากฏตัวของความเข้มข้นแตกต่างกันของเอทานอลที่ผสมถูกหมุนเหวี่ยงที่15,000 XG 15 นาทีที่ 4 ° C; แล้วตกตะกอนที่ถูกทิ้ง supernatants วิเคราะห์กิจกรรมไลโซไซม์ของพวกเขาและมีปริมาณโปรตีนเพื่อตรวจสอบผลกระทบของการที่แตกต่างกันวิธีการที่มีต่อประสิทธิภาพของการทำให้บริสุทธิ์บางส่วน. ไตและ lyophilization ของบริสุทธิ์บางส่วนlysozyme lysozymes แห้งที่ได้รับโดยใช้supernatants จากการหมุนเหวี่ยงของเอทานอลที่ได้รับ(40% 60% หรือ 80%) และ 6 ชั่วโมง (หรือ 7 ชั่วโมง) บ่มตัวอย่าง ก่อน lyophilization, supernatants มี lysozyme ถูก dialyzed 21 ชั่วโมงที่ 4 ° C 3 การเปลี่ยนแปลงของปี 2000 มล. น้ำกลั่น lyophilization ถูกนำมาใช้โดยการแช่แข็งแห้ง(Labconco, FreeZone, 6 ลิตร, แคนซัสซิตี, สหรัฐอเมริกา) ด้วยเพื่อ -44 -47 ° C เก็บอุณหภูมิและ50 x 10-3 และ 100 x 10-3 สูญญากาศเอ็มบาร์. ตัวอย่าง ปริมาณของภาชนะบรรจุเป็น 2-3 ครั้งตัวอย่างปริมาณ เอนไซม์แห้งถูกเก็บไว้ที่ -18 องศาเซลเซียสจนกว่าพวกเขาจะถูกนำมาใช้ในการศึกษาที่แตกต่างกัน. ปริมาณโปรตีนและเอนไซม์ของแห้งlysozymes บริสุทธิ์บางส่วนปริมาณโปรตีนและเอนไซม์ที่เหลือของเอนไซม์แห้งได้รับการพิจารณาโดยการละลาย20 มก. ในการจัดทำแห้งใน 10 มล. น้ำกลั่น. หลังจากการหมุนเหวี่ยงที่ 15 000 XG นาน 15 นาทีที่ 4 ° C, กิจกรรม lysozyme คงเหลือและปริมาณโปรตีนของการเตรียมเอนไซม์ถูกกำหนดโดยวิธีการที่ได้รับด้านล่าง ปริมาณโปรตีนที่ถูกแสดงเป็นมิลลิกรัมโปรตีนต่อมิลลิกรัมของผงในขณะที่กิจกรรมของเอนไซม์ถูกแสดงเป็นยูต่อมิลลิกรัมของผงโปรตีน. ความมั่นคงทางความร้อนของแห้งบริสุทธิ์บางส่วนlysozyme ศึกษาพลังความร้อนได้รับการดำเนินการที่ 60, 70, 80 และ 90 องศาเซลเซียสด้วย เวลาการใช้งานความร้อน (TIT) ท่อ (ID: 9 มมความหนาของผนัง: 1 มิลลิเมตร) เพื่อลดขั้นตอนการล่าช้าหลอด TIT ถูกความร้อนการใช้งานที่อุณหภูมิ แล้ว 0.2 มล. ของการแก้ปัญหาการทำงานของเอนไซม์ที่ถูกจัดทำขึ้นโดยการละลายในไลโซไซม์แห้ง0.05 M บัฟเฟอร์นาฟอสเฟต (pH 7.0) ซึ่งได้รับการปิเปตแล้วลงในหลอดTIT หลังจากที่ความร้อนในช่วงเวลาที่กำหนดหลอดถูกระบายความร้อนในอ่างน้ำน้ำแข็งและเนื้อหาของพวกเขาถูกassayed ได้ทันทีสำหรับกิจกรรมไลโซไซม์ที่เหลือ. การคำนวณของพารามิเตอร์พลังความร้อนของไลโซไซม์ได้ดำเนินการโดยใช้มาตรฐานวิธีการที่อธิบายการทำงานของเอนไซม์และยับยั้งจุลินทรีย์จลนศาสตร์โดยปฏิกิริยาสั่งซื้อครั้งแรก (Holdsworth, 1997). โค้งพลังความร้อนที่ถูกสร้างขึ้นโดยการวางแผนการเข้าสู่ระบบของกิจกรรมที่เหลืออีกร้อยละเมื่อเทียบกับความร้อนเวลา (นาที) ค่าคงที่อัตราการใช้งาน (k-1 นาที) จะถูกคำนวณโดยการคูณความชันของเส้นโค้งพลังความร้อนจากปัจจัยของ2.303 ชีวิตครึ่ง (t1 / 2 นาที) ซึ่งหมายถึงเวลาที่ความร้อนที่อุณหภูมิคงที่เพื่อให้เกิดการใช้งาน50% ของเอนไซม์จะถูกคำนวณจากสูตรt1 / 2 = LN (0.5) k-1 การลดทศนิยมครั้ง (d นาที) ซึ่งหมายถึงเวลาที่ความร้อนที่อุณหภูมิคงที่เพื่อให้เกิดการใช้งาน90% ของเอนไซม์จะถูกคำนวณจากส่วนกลับเชิงลบของความลาดชันของเส้นโค้งพลังความร้อน ค่าซี(° C) ที่แสดงให้เห็นการพึ่งพาอุณหภูมิของความร้อนที่ใช้งานที่คำนวณได้จากสมซี= T2- T1 / เข้าสู่ระบบ (D1 / D2) ที่ T คืออุณหภูมิ (° C)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สำหรับการทำให้บริสุทธิ์บางส่วนของไลโซไซม์ , ไข่ขาว
อย่างระมัดระวัง แยกออกจากไข่แดง ลด 3 - หรือ
3.3-fold กับ 0.05 M NaCl สารละลาย ตกตะกอนโปรตีนไข่สีขาว
นอกจากไลโซไซม์ , pH ของส่วนผสมนี้
ตั้งไว้ที่ 4.0 โดยรอบคอบเพิ่มหลายหยด
1 N กรดอะซิติกและเจือจางด้วย
ขนาดเท่ากัน 40% , 60% หรือ 80% ( v / v ) เอทานอล หลังจาก 0 - 2 - 4 - 6 -
,หรือประมาณ 7 , บ่มที่อุณหภูมิห้องใน
ตนของระดับความเข้มข้นของเอทานอลผสมอยู่ที่ระดับ 12 , 000
x G สำหรับ 15 นาทีที่ 4
/ C ; จากนั้นตะกอนถูกละทิ้ง .
supernatants วิเคราะห์กิจกรรมของไลโซไซม์
และโปรตีน เพื่อศึกษาผลของวิธีการที่แตกต่างกันในประสิทธิภาพของการฟอก

บางส่วนการฟอกไตและเอนไซม์ไลโซไซม์ของบริสุทธิ์บางส่วน

lysozymes แห้งได้โดยใช้ supernatants จากเอทานอลการปั่น

( 40% , 60% หรือ 80% ) และ 6-h ( หรือ 7-h ) บ่ม
ตัวอย่าง ก่อนที่ Tool , supernatants
ที่มีไลโซไซม์ได้ผ่าน 21 H 4 ° C 3
เปลี่ยนแปลง 2000 ml ของน้ำกลั่น เอนไซม์คือ
ใช้ โดยตรึงแห้ง ( แล็บคอนโก้ ฟรี โซน 6 ลิตร ,
, Kansas City , โม , USA ) – 44 47 ° C อุณหภูมิสะสมไป )
, 50 x 100 x 10-3 10-3 มิลลิบาร์ สูญญากาศ
ตัวอย่างภาชนะปริมาณ 2-3 ครั้งตัวอย่าง
ปริมาณ เอนไซม์โปรตีนที่ถูกเก็บไว้ที่ - 18 ° C
จนกว่าพวกเขาจะถูกใช้ในการศึกษาที่แตกต่างกัน .
เนื้อหาโปรตีนและเอนไซม์ของโปรตีนบริสุทธิ์บางส่วน lysozymes

ปริมาณโปรตีน และเอนไซม์ของเอนไซม์เป็นโปรตีนตกค้าง
20
มก. เตรียมโดยละลายในน้ำกลั่นแห้ง 10 ml .
หลังการปั่นเหวี่ยงที่ 15 000 x G สำหรับ 15 นาทีที่ 4 ° C ,
3 กิจกรรมไลโซไซม์และปริมาณโปรตีนของเอนไซม์โดยการเตรียมสารละลาย

ได้รับวิธีการ ด้านล่าง โปรตีนจะแสดงเป็นมก
ต่อมิลลิกรัมโปรตีนผง ในขณะที่เอนไซม์คือ
แสดงเป็นคุณต่อมิลลิกรัมโปรตีนผงหรือ .
เสถียรภาพทางความร้อนของโปรตีนบริสุทธิ์บางส่วน

ทำให้การศึกษาไลโซไซม์ความร้อนทดสอบที่ 60
70 , 80 และ 90 ° C กับเวลาเมื่อความร้อน ( ติ๊ด )
9 มม. ท่อไอดี ( ; ความหนา 1 มม. ผนัง ) เพื่อลด
lag phase , หัวนมท่อ คืออุ่นที่อุณหภูมิใช้งาน

แล้ว 02 มิลลิลิตรของสารละลายเอนไซม์ที่เตรียมได้โดยละลาย
ไลโอไลโซไซม์ใน 0.05 M
นา ( ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.0 ) ซึ่งก็ pipetted
เป็นหัวนมท่อ หลังจากเครื่องที่กำหนด
ท่อ คือเย็นในน้ำแข็ง น้ำอาบ และเนื้อหาของพวกเขา
ได้ทันที สำหรับกิจกรรมเอนไซม์ไลโซไซม์ตกค้าง .
การคำนวณความร้อนทำให้ค่า
ไลโซไซม์ ทำการศึกษาโดยการใช้มาตรฐาน
วิธีการอธิบายและเอนไซม์จลนศาสตร์การยับยั้ง
โดยจุลินทรีย์ปฏิกิริยาลำดับแรก ( โฮลด์สเวิร์ท , 1997 ) .
ความร้อนทำให้โค้งขึ้น โดยวางแผนบันทึก
) กิจกรรมและเวลาเหลือความร้อน ( มิน )
เมื่อค่าคงที่ ( K min-1 ) คำนวณด้วย
คูณความชันของเส้นโค้งโดย
เมื่อความร้อนปัจจัยของ 2.303 . ชีวิตครึ่ง ( T1 / 2 นาที ) ซึ่งหมายถึง
กับความร้อนที่อุณหภูมิคงที่เพื่อให้บรรลุ
50% การยับยั้งของเอนไซม์ คำนวณจากสูตร T1
2 = ln ( 0.5 ) K - 1 . เวลาลด
ทศนิยม ( D , มิน ) ซึ่งหมายถึงความร้อนที่อุณหภูมิคงที่เพื่อให้บรรลุ 90%

การยับยั้งของเอนไซม์ คำนวณจาก reciprocals ลบของ
ความร้อนทำให้ความชันของเส้นโค้ง ค่า Z
( ° C ) ที่แสดงอุณหภูมิการความร้อน
เมื่อคำนวณได้จากสมการ y = -
2 T1 / log ( D1 / D2 ) ที่ T คือ อุณหภูมิ ( องศา C )