Trypsin purificationTrypsin from th

Trypsin purification
Trypsin from the viscera of S. basilisca was extracted and purified successively by the four-step procedure described in Section 2. In the first step, the crude enzyme extract was fractionated with ammonium sulphate. The precipitate formed at 40–80% (w/v) saturation showed higher specific activity (0.23 U/mg of protein), than the precipitate formed at 0–40% saturation (0.05 U/mg of protein). No activity was detected in the final supernatant. The 40–80% fraction, which gave the highest specific activity, was then subjected to Sephadex G-100 gel filtration. This procedure yielded one peak of protease activity (BAPNA) (Fig. 1a). Fractions showing trypsin activity were pooled and then loaded on a Mono
Q-Sepharose anion-exchange chromatography column that had been equilibrated with buffer C. Binding proteins were eluted with a linear gradient of NaCl (0–0.5 M). BAPNA activity appeared in a single peak (Fig. 1b). Finally the active fractions were concentrated by ultrafiltration. The results of the purification procedure are summarised in Table 1. After the final purification step, the trypsin was purified 4.2-fold, with a recovery of 12% and a specific activity of 0.5 U/mg of protein, using BAPNA as a substrate. The purified enzyme gave a single band on SDS–PAGE and its molecular weight was estimated to be 27 kDa (Fig. 2a), corresponding to that determined by gel filtration. Purity of the enzyme was also evaluated using zymogram activity staining. As shown in Fig. 2a (line 6), a unique clear band of casein hydrolysis was observed in the gel, indicating the homogeneity of the purified protease. Generally, fish trypsins have been reported to have molecular weights in the range of 22–28 kDa (Whitaker, 1994). The molecular weight of S. basilisca trypsin was similar to those from other fish species, such as striped seabream (Lithognathus mormyrus)

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ทริปซินฟอกทริปซินจากศพของ S. basilisca สกัด และบริสุทธิ์ติด ๆ กัน โดยขั้นตอนสี่ขั้นตอนที่อธิบายไว้ในส่วนที่ 2 ในขั้นแรก สารสกัดเอนไซม์ดิบถูกแบ่ง ด้วยแอมโมเนียมซัลเฟต Precipitate เกิดขึ้นที่ความเข้ม 40 – 80% (w/v) แสดงให้เห็นว่ากิจกรรมเฉพาะสูง (0.23 U/มิลลิกรัม โปรตีน), กว่า precipitate เกิดที่ 0-40% ความเข้ม (0.05 U/มิลลิกรัม โปรตีน) กิจกรรมไม่พบใน supernatant ขั้นสุดท้าย 40 – 80% เศษส่วน การให้กิจกรรมสูงสุด แล้วถูกยัดเยียดให้กรองเจ Sephadex G-100 ขั้นตอนนี้หาช่วงหนึ่งของกิจกรรมรติเอส (BAPNA) (Fig. 1a) เศษส่วนที่แสดงกิจกรรมทริปซินทางถูกพูแล้ว โหลดในแบบขาวดำ Q-Sepharose anion exchange chromatography คอลัมน์ที่มีการ equilibrated กับบัฟเฟอร์ C. ผูกโปรตีนถูก eluted กับการไล่ระดับสีแบบเส้นตรงของ NaCl (0 – 0.5 M) BAPNA กิจกรรมปรากฏในยอดเดียว (Fig. 1b) สุดท้าย ส่วนงานเข้มข้น โดย ultrafiltration ผลลัพธ์ของขั้นตอนการฟอกจะ summarised ในตารางที่ 1 หลังจากขั้นตอนสุดท้ายฟอก ทริปซินจะได้บริสุทธิ์ 4.2-fold กู้คืน 12% และกิจกรรมของ 0.5 U/มิลลิกรัม โปรตีน ใช้ BAPNA กับพื้นผิว เอนไซม์บริสุทธิ์ให้วงเดียวหน้า – SDS และน้ำหนักโมเลกุลของมันถูกประมาณ 27 kDa (Fig. 2a), สอดคล้องกันที่กำหนด โดยเครื่องกรองเจ ความบริสุทธิ์ของเอนไซม์ยังไม่ถูกประเมินโดยใช้ zymogram กิจกรรมย้อมสี ตามที่แสดงใน Fig. 2a (สาย 6), วงชัดเจนเฉพาะของไฮโตรไลซ์เคซีนที่พบในจระเข้ แสดง homogeneity รติเอสบริสุทธิ์ ทั่วไป ปลา trypsins มีการรายงานให้มีน้ำหนักโมเลกุลในช่วง 22 – 28 kDa (วิตเทกเกอร์ 1994) น้ำหนักโมเลกุลของ S. basilisca ทริปซินผู้จากพันธุ์ปลาอื่น ๆ เช่นลาย seabream (Lithognathus mormyrus)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การทำให้บริสุทธิ์ trypsin
Trypsin จากอวัยวะภายในของเอส basilisca ถูกสกัดบริสุทธิ์อย่างต่อเนื่องโดยขั้นตอนสี่ขั้นตอนที่อธิบายไว้ในมาตรา 2 ในขั้นตอนแรกสารสกัดเอนไซม์ถูก fractionated กับแอมโมเนียมซัลเฟต ตะกอนที่เกิดขึ้นที่ 40-80% (w / v) แสดงให้เห็นถึงความอิ่มตัวของกิจกรรมที่เฉพาะเจาะจงสูงกว่า (0.23 U / มิลลิกรัมโปรตีน) กว่าตะกอนที่เกิดขึ้นที่ความอิ่มตัว 0-40% (0.05 U / มิลลิกรัมโปรตีน) ไม่มีกิจกรรมใดถูกตรวจพบในสารละลายสุดท้าย ส่วน 40-80% ซึ่งทำให้กิจกรรมเฉพาะสูงสุดยู่แล้ว Sephadex G-100 กรองเจล ขั้นตอนนี้จะให้ผลอย่างใดอย่างหนึ่งจุดสูงสุดของกิจกรรมโปรติเอส (BAPNA) (รูป. 1a) เศษส่วนแสดงกิจกรรม trypsin ถูกรวบรวมและเต็มไปแล้วเมื่อวันที่โมโน
Q-Sepharose คอลัมน์โครมาแลกเปลี่ยนไอออนที่ได้รับการ equilibrated กับบัฟเฟอร์ซีโปรตีนถูกผูกกับชะลาดเชิงเส้นของโซเดียมคลอไรด์ (0-0.5 M) กิจกรรม BAPNA ปรากฏในยอดเดียว (รูป. 1b) สุดท้ายเศษส่วนที่ใช้งานมีความเข้มข้นโดยการกรอง ผลที่ได้จากขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ได้สรุปไว้ในตารางที่ 1 หลังจากที่ขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์สุดท้าย trypsin บริสุทธิ์เป็น 4.2 เท่าที่มีการกู้คืน 12% และกิจกรรมที่เฉพาะเจาะจงของ 0.5 U / mg ของโปรตีนโดยใช้เป็นสารตั้งต้น BAPNA เอนไซม์บริสุทธิ์ให้วงเดียวบนระบบ SDS-PAGE และน้ำหนักโมเลกุลก็จะประมาณ 27 กิโลดาลตัน (รูป. 2a) สอดคล้องกับที่กำหนดโดยการกรองเจล ความบริสุทธิ์ของเอนไซม์ยังถูกประเมินโดยใช้การย้อมสีกิจกรรม zymogram ดังแสดงในรูป 2a (สาย 6) วงดนตรีที่ชัดเจนเป็นเอกลักษณ์ของการย่อยเคซีนพบว่าในเจลแสดงให้เห็นความเป็นเนื้อเดียวกันของน้ำย่อยบริสุทธิ์ โดยทั่วไป trypsins ปลาได้รับรายงานว่าจะมีน้ำหนักโมเลกุลอยู่ในช่วง 22-28 กิโลดาลตัน (วิเท 1994) น้ำหนักโมเลกุลของ trypsin เอส basilisca ก็คล้ายคลึงกับผู้ที่มาจากปลาชนิดอื่น ๆ เช่นลาย Seabream (Lithognathus mormyrus)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เอนไซม์บริสุทธิ์เอนไซม์จากเครื่องใน
S . basilisca สกัดบริสุทธิ์อย่างต่อเนื่อง โดยสี่ขั้นตอน ขั้นตอนที่อธิบายไว้ในส่วนที่ 2 ในขั้นตอนแรกของเอนไซม์สกัดเป็นลำดับด้วยแอมโมเนียมซัลเฟต ที่ก่อตั้งขึ้นที่ 40 – 80 % ( w / v ) ความเข้มสูงกว่ากิจกรรมจำเพาะ ( 0.23 U / mg โปรตีน ) กว่าที่ก่อตั้งขึ้นที่ 0 – 40 % อิ่มตัว ( 05 U / mg โปรตีน ) ไม่มีกิจกรรมที่ตรวจพบในนำสุดท้าย 40 – 80 % ส่วนที่ให้กิจกรรมที่เฉพาะเจาะจงมากที่สุด ก็ต้องเจล Sephadex G-100 การกรอง ขั้นตอนนี้ให้ผลหนึ่งสูงสุดของกิจกรรมเอนไซม์โปรติเอส ( bapna ) ( รูปที่ 1A ) แสดงกิจกรรมของเอนไซม์ถูกรวมเศษส่วนแล้วโหลดในโมโน
แลกเปลี่ยนไอออน chromatography คอลัมน์ซึ่งมี equilibrated บัฟเฟอร์ซีโปรตีนที่จับกับลาดเชิงเส้นคือตัวอย่างของเกลือโซเดียมคลอไรด์ ( 0 – 0.5 M ) กิจกรรม bapna ปรากฏอยู่ในยอดเดียว ( รูปที่ 1A ) ในที่สุดเศษส่วนปราดเปรียวมีความเข้มข้น โดยผสม . ผลของกระบวนการบำบัดจะสรุปในตารางที่ 1 หลังจากขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์สุดท้ายการเปลี่ยนแปลงเป็น 4.2-fold บริสุทธิ์ กับการกู้คืน 12% และกิจกรรมเฉพาะของ 0.5 U / mg โปรตีน โดยใช้ bapna เป็นสับสเตรท เอนไซม์ให้วงเดียวบนหน้า - SDS และน้ำหนักโมเลกุลของมันคือประมาณ 27 kDa ( รูปที่ 2A ) , สอดคล้องกับที่กำหนดโดยการกรองเจล ความบริสุทธิ์ของเอนไซม์ยังประเมินการจัดกิจกรรมทดลอง staining ดังแสดงในรูปที่2A ( สาย 6 ) , วงเคลียร์เฉพาะของเคซีน ไฮโดรเจล พบว่าแสดงความเป็นเนื้อเดียวกันและโปรติเอส โดยทั่วไป trypsins ปลาได้รับรายงานว่ามีน้ำหนักโมเลกุลในช่วง 22 – 28 กิโลดาลตัน ( Whitaker , 1994 ) น้ำหนักโมเลกุลของเอนไซม์เอส basilisca คล้ายคลึงกับเหล่านั้นจากปลาอื่น ๆเช่น ลาย seabream ( lithognathus mormyrus )