- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
INTRODUCTION‘Chilika’ is the larges
INTRODUCTION
‘Chilika’ is the largest lagoon in the subcontinent which is
situated along the east coast of India between latitude 19o
28’ and 19o 54’ N, and longitude 85o 05’ and 85o 38’E.
This is a shallow, brackish-water lake formed due to the
silting action of the Mahanadi River, which drains into the
northern end of the lake, and the northerly currents in the
Bay of Bengal, which have formed a sandbar along the
eastern shore (Arya and Lakhotia, 2006). It is the largest
brackish water wetland complex in Asia, declared as a
Ramsar site under the convention on “Wetlands of
International Importance”. This lagoon is presently under
threat from both natural and anthropogenic pressures
(Nayak et al., 2004). The marine realm constitutes the
major habitat of the biosphere covering 73 % of the earth
surface which provides the largest inhabitable space for
living organisms, particularly microbes. Marine microbes
flourish not only in the surface water of the sea, but also in
the lower and abyssal depths from coastal to the offshore
regions and from the general oceanic to the specialized
niches like blue waters of coral reefs to black smokers of
hot thermal vents at the sea floor.
As the water being served as major solvent, it plays an
important role in the pharmaceutical industries.
It is
considered as the primary source of contamination for
pharmaceutical products (Tamara et al., 1998). Microbes
present in the marine waters represent a potential source
for commercially important bioactive compounds and their
bioremediation capabilities are also remarkable. There is
an increasing demand of biodiversity from natural
resources for development of therapeutic drugs.
Antibiotics are broadly used as chemotherapeutic agents
which, albeit in a very low quantity, can inhibit the
pathogenic activity of microorganisms. The potential
contribution of marine organisms to the discovery of new
bioactive molecules is increasingly challenging (Sponga et
al., 1999; Skulberg, 2000). The microorganisms have
become a significant attraction as natural source of
bioactive molecules with a broad range of biological
activities, such as antibiotics, antivirals, antitumorals,
antioxidant and anti-inflammatory (Okami, 1982; Kamei et
al., 1987; Nunez et al., 2006; Uzair et al., 2009; Shankar
et al., 2010). Evidence of phycochemical and
pharmacological studies on microbes is available in the
literature (Zeeshan et al., 2010; Odeyemi et al., 2010;
Bragadeeswaran et al., 2010).
Previously, there were a number of researchers that had
worked on ‘Chilika’ regarding hydrological
characterization, water quality variation, antimicrobial
activity and physiochemical variation (Rao et al., 1981;
Nayak et al., 2004; Patra et al., 2009, Patra et al., 2010).
Unfortunately progress made on pharmaceutical studies
of marine microorganism from ‘Chilika’ is inadequate. This
underpinned the present study with a view to investigating
the physiological, biochemical, and serological
characterization of bacteria isolated from marine waters of
‘Chilika’ aiming at their exploitation for pharmaceutical
benefits.
MATERIALS AND METHODS
Isolation and characterization of bacterial strains
The total study area is comprised of 18 sampling stations
covering three different sectors of the ‘Chilika’ lagoon i.e.
Central, Southern and Outer Channel (Figure 1A, 1B)
during the period from January to March 2008. The exact
sampling locations were fixed by using Global Positioning
System (GPS). All the water samples were collected in the
morning hours between 7:00 A.M-11:00 A.M. During
sample collection necessary precautions had been taken
to collect undisturbed water samples in the lake. Samples
were collected in pre-sterilized polypropylene bottles (500
mL). Physical parameters like temperature and pH of the
samples were determined on the spot of collection. Then
the water samples were kept in the icebox and transferred
to laboratory for further analysis and the samples were
preserved at 4ฐC before isolation and identification in the
laboratory. The experiments were carried out within 4
months of collection. Chemicals used for preparation of
reagents in the present investigation were of analytical
reagent grade and for preparation of solutions doubledistilled
water was used. One milliliter of water sample
was subjected through serial dilution to obtain 10-8
dilution. After that 1mL of 10-8 diluted sample was mixed
with 10 mL of sterilized Nutrient broth medium and then it
was incubated at 37 ฐC in a BOD incubator for 24 h. After
incubation a loop-full of microbial culture were picked up
from different colonies and streaked separately on the
different agar-gelled sterilized media and the plates were
incubated at 37 ฐC for 24 h for isolation of pure culture.
The colony characteristics such as colour, appearance,
and shape of the isolate were recorded. Further,
morphological, and biochemical tests were carried out in
the laboratory by following standard microbiological
methods described by Cappuccino and Sherman (2002)
for identification and characterization of isolated
microorganism. The isolated strains were also
characterized through different physiological factors such
as pH, temperature and salinity to observe their tolerance
capacity in the stressed environmental conditions.
Collection and preservation of pre-immunized serum
For production of antisera 3-4 month-old white rabbit (2.5 -
3 kg) were selected and kept in separate cage and
labeled properly. The pre-immunized sera of the rabbit
used for the test were collected before 7 days of
immunization with different a ntigens to confirm that the
rabbit did not contain any antisera. The sterilized tube
containing fresh drawn blood was kept at room
temperature for 1-2 h for clot formation. The clots was
stirred with glass rod and was kept overnight in
refrigerator to allow the clot contraction. The plasma were
centrifuged (3000 rpm, 15 min). The straw-coloured serum
was withdrawn into a sterilized centrifuge tube which was
labeled properly. For preservation of serum, it was added
with 0.02 % sodium azide (NaNH2) to give a final
concentration of 1:5000 and kept in a deep freeze at -20
ฐC for further use.
Serological test
Preparation of whole cell antigen: The antigen was
prepared from the freshly grown bacterial cultures. The
bacteria were cultured on NSA medium in test tube at 27ฐC for 24 h. The test tube was filled with PBS or saline water.
The culture was scraped with sterilized inoculation
needle. The scraped bacteria with saline water were
transferred to the centrifuge tube. The bacterial growth
was mixed thoroughly with the help of a vortex mixture to
make it completely homogenized. The whole cell of
bacteria was centrifuged (3000 rpm, 30 min, room
temperature). The supernatant was discarded and the
pellet was re-suspended with saline water and
centrifuged. The process was repeated three times to
make the bacteria free from any foreign material. After the
last centrifugation bacteria were re-suspended in normal
saline/butler saline, collected in sterilized specimen tube,
labeled properly, preserved and stored in deep freeze at -
20 ฐC for further use.
Preparation of antigen for agglutination test: The
antigens were prepared by suspending live bacteria in
buffer saline as described earlier except that the antigen
prepared was more concentrated having an optical
density of 0.5 using a Gallen Kamp colorimeter at 520
mm.
Immunization of rabbits for antisera production and
harvesting of immunized serum: The rabbits were
immunized by intra-muscular and intravenous injections.
Both right and left legs were used for intra-muscular
injection. In case of intravenous injection, marginal vein of
ear was used. Three doses of antigen (0.5 mL, 1.0 mL,
and 1.5 mL) were injected intra-muscularly at four days
interval. Acetone was used to dilate the vein. The
designed quantity was injected slowly into the blood
system. A booster injection was given 4 days after the last
injection to accelerate antibody production. Five or seven
days after the booster injection, the rabbits were held by
cardiac puncture for collection of antisera. The procedure
of collection of blood separation and preservation of
antiserum was the same as described earlier.
Antigen-antibody reaction tests: Mixture of antigen and
antibody showing positive reaction resulted in the
formation of precipitation due to binding of antibodies with
their respective antigens. Two different serological tests
were conducted to record the precipitations or positive
reaction of antigen and antibodies. The gel diffusion test
was performed following the method as originally
described by Ouchterlony (1958, 1962) while the tube
agglutination test was carried out for homologous and
heterologous antigens using a national standard method
(NHS, 2010).
Antibiotic sensitivity test
Antibiotic sensitivity test of the identified bacteria were
repeated 3 times for each strain using 10 different
antibiotics namely norfloxacin, tetracycline, ciprofloxacin,
neomycin, nalidixic acid, ofloxacin, chloramphenicol,
nitrofurantoin, streptomycin and amoxicillin (Hi- Media,
Mumbai, India) by disc diffusion method (Bauer et al.,1966). Antibiotic activity was measured in terms of zoneinhibition (mm diameter).
Plasmid DNA isolation and agarose gel
electrophoresis
The alkaline-lysis mini-prep method (Wizard Plus
Minipreps DNA Purification Systems, Promega, USA) was
used for plasmid extraction from all the four bacterial
isolates. Overnight-grown bacterial cultures (3-5 mL) were
pelleted by centrifugation (10,000 x g, 10 min),
supernatant decanted and pellet re-suspended in 300 OL
of Cell Re-suspension Solution (50 mM Tris, pH 7.5; 10
mM EDTA; 100 Og/mL RNase A). The re-suspended cells
were transferred to 1.5 mL micro-centrifuged tube to
which 300 OL of Cell Lysis Solution (0.2 M NaOH, 1 %
SDS) was added and samples thoroughly mixed. To the
cleared lysate 300 OL of Neutralization Solution (1.32 M
potassium
‘Chilika’ is the largest lagoon in the subcontinent which is
situated along the east coast of India between latitude 19o
28’ and 19o 54’ N, and longitude 85o 05’ and 85o 38’E.
This is a shallow, brackish-water lake formed due to the
silting action of the Mahanadi River, which drains into the
northern end of the lake, and the northerly currents in the
Bay of Bengal, which have formed a sandbar along the
eastern shore (Arya and Lakhotia, 2006). It is the largest
brackish water wetland complex in Asia, declared as a
Ramsar site under the convention on “Wetlands of
International Importance”. This lagoon is presently under
threat from both natural and anthropogenic pressures
(Nayak et al., 2004). The marine realm constitutes the
major habitat of the biosphere covering 73 % of the earth
surface which provides the largest inhabitable space for
living organisms, particularly microbes. Marine microbes
flourish not only in the surface water of the sea, but also in
the lower and abyssal depths from coastal to the offshore
regions and from the general oceanic to the specialized
niches like blue waters of coral reefs to black smokers of
hot thermal vents at the sea floor.
As the water being served as major solvent, it plays an
important role in the pharmaceutical industries.
It is
considered as the primary source of contamination for
pharmaceutical products (Tamara et al., 1998). Microbes
present in the marine waters represent a potential source
for commercially important bioactive compounds and their
bioremediation capabilities are also remarkable. There is
an increasing demand of biodiversity from natural
resources for development of therapeutic drugs.
Antibiotics are broadly used as chemotherapeutic agents
which, albeit in a very low quantity, can inhibit the
pathogenic activity of microorganisms. The potential
contribution of marine organisms to the discovery of new
bioactive molecules is increasingly challenging (Sponga et
al., 1999; Skulberg, 2000). The microorganisms have
become a significant attraction as natural source of
bioactive molecules with a broad range of biological
activities, such as antibiotics, antivirals, antitumorals,
antioxidant and anti-inflammatory (Okami, 1982; Kamei et
al., 1987; Nunez et al., 2006; Uzair et al., 2009; Shankar
et al., 2010). Evidence of phycochemical and
pharmacological studies on microbes is available in the
literature (Zeeshan et al., 2010; Odeyemi et al., 2010;
Bragadeeswaran et al., 2010).
Previously, there were a number of researchers that had
worked on ‘Chilika’ regarding hydrological
characterization, water quality variation, antimicrobial
activity and physiochemical variation (Rao et al., 1981;
Nayak et al., 2004; Patra et al., 2009, Patra et al., 2010).
Unfortunately progress made on pharmaceutical studies
of marine microorganism from ‘Chilika’ is inadequate. This
underpinned the present study with a view to investigating
the physiological, biochemical, and serological
characterization of bacteria isolated from marine waters of
‘Chilika’ aiming at their exploitation for pharmaceutical
benefits.
MATERIALS AND METHODS
Isolation and characterization of bacterial strains
The total study area is comprised of 18 sampling stations
covering three different sectors of the ‘Chilika’ lagoon i.e.
Central, Southern and Outer Channel (Figure 1A, 1B)
during the period from January to March 2008. The exact
sampling locations were fixed by using Global Positioning
System (GPS). All the water samples were collected in the
morning hours between 7:00 A.M-11:00 A.M. During
sample collection necessary precautions had been taken
to collect undisturbed water samples in the lake. Samples
were collected in pre-sterilized polypropylene bottles (500
mL). Physical parameters like temperature and pH of the
samples were determined on the spot of collection. Then
the water samples were kept in the icebox and transferred
to laboratory for further analysis and the samples were
preserved at 4ฐC before isolation and identification in the
laboratory. The experiments were carried out within 4
months of collection. Chemicals used for preparation of
reagents in the present investigation were of analytical
reagent grade and for preparation of solutions doubledistilled
water was used. One milliliter of water sample
was subjected through serial dilution to obtain 10-8
dilution. After that 1mL of 10-8 diluted sample was mixed
with 10 mL of sterilized Nutrient broth medium and then it
was incubated at 37 ฐC in a BOD incubator for 24 h. After
incubation a loop-full of microbial culture were picked up
from different colonies and streaked separately on the
different agar-gelled sterilized media and the plates were
incubated at 37 ฐC for 24 h for isolation of pure culture.
The colony characteristics such as colour, appearance,
and shape of the isolate were recorded. Further,
morphological, and biochemical tests were carried out in
the laboratory by following standard microbiological
methods described by Cappuccino and Sherman (2002)
for identification and characterization of isolated
microorganism. The isolated strains were also
characterized through different physiological factors such
as pH, temperature and salinity to observe their tolerance
capacity in the stressed environmental conditions.
Collection and preservation of pre-immunized serum
For production of antisera 3-4 month-old white rabbit (2.5 -
3 kg) were selected and kept in separate cage and
labeled properly. The pre-immunized sera of the rabbit
used for the test were collected before 7 days of
immunization with different a ntigens to confirm that the
rabbit did not contain any antisera. The sterilized tube
containing fresh drawn blood was kept at room
temperature for 1-2 h for clot formation. The clots was
stirred with glass rod and was kept overnight in
refrigerator to allow the clot contraction. The plasma were
centrifuged (3000 rpm, 15 min). The straw-coloured serum
was withdrawn into a sterilized centrifuge tube which was
labeled properly. For preservation of serum, it was added
with 0.02 % sodium azide (NaNH2) to give a final
concentration of 1:5000 and kept in a deep freeze at -20
ฐC for further use.
Serological test
Preparation of whole cell antigen: The antigen was
prepared from the freshly grown bacterial cultures. The
bacteria were cultured on NSA medium in test tube at 27ฐC for 24 h. The test tube was filled with PBS or saline water.
The culture was scraped with sterilized inoculation
needle. The scraped bacteria with saline water were
transferred to the centrifuge tube. The bacterial growth
was mixed thoroughly with the help of a vortex mixture to
make it completely homogenized. The whole cell of
bacteria was centrifuged (3000 rpm, 30 min, room
temperature). The supernatant was discarded and the
pellet was re-suspended with saline water and
centrifuged. The process was repeated three times to
make the bacteria free from any foreign material. After the
last centrifugation bacteria were re-suspended in normal
saline/butler saline, collected in sterilized specimen tube,
labeled properly, preserved and stored in deep freeze at -
20 ฐC for further use.
Preparation of antigen for agglutination test: The
antigens were prepared by suspending live bacteria in
buffer saline as described earlier except that the antigen
prepared was more concentrated having an optical
density of 0.5 using a Gallen Kamp colorimeter at 520
mm.
Immunization of rabbits for antisera production and
harvesting of immunized serum: The rabbits were
immunized by intra-muscular and intravenous injections.
Both right and left legs were used for intra-muscular
injection. In case of intravenous injection, marginal vein of
ear was used. Three doses of antigen (0.5 mL, 1.0 mL,
and 1.5 mL) were injected intra-muscularly at four days
interval. Acetone was used to dilate the vein. The
designed quantity was injected slowly into the blood
system. A booster injection was given 4 days after the last
injection to accelerate antibody production. Five or seven
days after the booster injection, the rabbits were held by
cardiac puncture for collection of antisera. The procedure
of collection of blood separation and preservation of
antiserum was the same as described earlier.
Antigen-antibody reaction tests: Mixture of antigen and
antibody showing positive reaction resulted in the
formation of precipitation due to binding of antibodies with
their respective antigens. Two different serological tests
were conducted to record the precipitations or positive
reaction of antigen and antibodies. The gel diffusion test
was performed following the method as originally
described by Ouchterlony (1958, 1962) while the tube
agglutination test was carried out for homologous and
heterologous antigens using a national standard method
(NHS, 2010).
Antibiotic sensitivity test
Antibiotic sensitivity test of the identified bacteria were
repeated 3 times for each strain using 10 different
antibiotics namely norfloxacin, tetracycline, ciprofloxacin,
neomycin, nalidixic acid, ofloxacin, chloramphenicol,
nitrofurantoin, streptomycin and amoxicillin (Hi- Media,
Mumbai, India) by disc diffusion method (Bauer et al.,1966). Antibiotic activity was measured in terms of zoneinhibition (mm diameter).
Plasmid DNA isolation and agarose gel
electrophoresis
The alkaline-lysis mini-prep method (Wizard Plus
Minipreps DNA Purification Systems, Promega, USA) was
used for plasmid extraction from all the four bacterial
isolates. Overnight-grown bacterial cultures (3-5 mL) were
pelleted by centrifugation (10,000 x g, 10 min),
supernatant decanted and pellet re-suspended in 300 OL
of Cell Re-suspension Solution (50 mM Tris, pH 7.5; 10
mM EDTA; 100 Og/mL RNase A). The re-suspended cells
were transferred to 1.5 mL micro-centrifuged tube to
which 300 OL of Cell Lysis Solution (0.2 M NaOH, 1 %
SDS) was added and samples thoroughly mixed. To the
cleared lysate 300 OL of Neutralization Solution (1.32 M
potassium
0/5000
แนะนำ'Chilika' เป็นทะเลสาบที่ใหญ่ที่สุดในอนุทวีปที่เป็นตั้งอยู่ริมฝั่งทะเลตะวันออกของอินเดียระหว่างละติจูด 19o28' และ 19o 54' N และลองจิจูด 85o 05' และ 85o 38' Eนี้เป็นความตื้น ทะเลสาบน้ำกร่อยขึ้นเนื่องการsilting การกระทำของแม่น้ำ Mahanadi ที่ท่อระบายน้ำเป็นการเหนือของทะเลสาบ และกระแสเหนือในการอ่าวเบงกอล ซึ่งได้เกิดขึ้นกับ sandbar แบบตามชายฝั่งตะวันออก (อาและ Lakhotia, 2006) เป็นใหญ่ที่สุดประกาศพื้นที่ชุ่มน้ำกร่อยน้ำซับซ้อนในทวีปเอเชีย เป็นการRamsar ไซต์ภายใต้อนุสัญญาว่าด้วย "พื้นที่ชุ่มน้ำของความสำคัญระหว่างประเทศ" ทะเลสาบนี้อยู่ปัจจุบันความเสี่ยงจากแรงกดดันทั้งจากธรรมชาติ และที่มาของมนุษย์(Nayak et al., 2004) ขอบเขตทางทะเลถือการอยู่อาศัยหลักของชีวบริเวณครอบคลุมร้อยละ 73 ของโลกที่มีช่องว่าง inhabitable ที่ใหญ่ที่สุดสำหรับผิวหน้าชีวิต โดยเฉพาะอย่างยิ่งจุลินทรีย์ จุลินทรีย์ทางทะเลงอกงามไม่เพียงแต่น้ำที่พื้นผิว ของทะเล แต่ยังอยู่ในลึกก้นสมุทร และต่ำจากชายฝั่งไปยังต่างประเทศภูมิภาค และทั่วมหาสมุทรเพื่อการเฉพาะตรงไหนเช่นสีครามปะการังให้ดำผู้สูบบุหรี่ของช่องลมร้อนร้อนที่พื้นทะเลน้ำจะทำหน้าที่เป็นตัวทำละลายที่สำคัญ มันเล่นการบทบาทสำคัญในอุตสาหกรรมยามันเป็นถือว่าเป็นแหล่งที่มาหลักการปนเปื้อนในผลิตภัณฑ์ยา (ทามาระเกสท์เฮ้าส์และ al., 1998) จุลินทรีย์ปัจจุบันแสดงถึงน้ำทะเลในแหล่งที่มีศักยภาพสำหรับกรรมการกสารประกอบสำคัญในเชิงพาณิชย์ และการววิธีความสามารถโดดเด่น มีความต้องการเพิ่มขึ้นของความหลากหลายทางชีวภาพจากธรรมชาติทรัพยากรสำหรับการพัฒนายารักษาโรคยาปฏิชีวนะทั่วไปใช้เป็นตัวแทนที่เผชิญที่ แม้ว่าในปริมาณต่ำมาก สามารถยับยั้งการกิจกรรมการอุบัติของจุลินทรีย์ ศักยภาพสัดส่วนของสิ่งมีชีวิตทางทะเลการค้นพบของใหม่กรรมการกโมเลกุลถูกท้าทายมากขึ้น (Sponga etal., 1999 Skulberg, 2000) จุลินทรีย์มีเป็น สถานที่ท่องเที่ยวที่สำคัญเป็นแหล่งธรรมชาติของกรรมการกโมเลกุล มีความหลากหลายของชีวภาพกิจกรรม ยาปฏิชีวนะ antivirals, antitumoralsสารต้านอนุมูลอิสระและต้านการอักเสบ (Okami, 1982 Kamei etal., 1987 Nunez et al., 2006 Uzair et al., 2009 แชงการ์ร้อยเอ็ด al., 2010) หลักฐานของ phycochemical และpharmacological ศึกษาจุลินทรีย์พร้อมใช้ในการวรรณกรรม (Zeeshan et al., 2010 Odeyemi et al., 2010Bragadeeswaran et al., 2010)ก่อนหน้านี้ มีจำนวนนักวิจัยที่มีทำงานใน 'Chilika' เกี่ยวกับอุทกวิทยาจำแนก ปรับคุณภาพ จุลินทรีย์น้ำกิจกรรมและการเปลี่ยนแปลง physiochemical (ราว et al., 1981Nayak et al., 2004 ภัทราร้อยเอ็ด al. ปี 2009 ภัทราร้อยเอ็ด al., 2010)แต่ระหว่างที่ทำการศึกษาเภสัชกรรมของจุลินทรีย์ทางทะเลจาก 'Chilika' มีไม่เพียงพอ นี้รับการค้ำจุนการศึกษานำเสนอมุมมองการตรวจสอบสรีรวิทยา ชีวเคมี และสภาวะคุณสมบัติของแบคทีเรียที่แยกต่างหากจากน้ำทะเล'Chilika' มุ่งที่การแสวงหาประโยชน์สำหรับยาประโยชน์วัสดุและวิธีการการแยกและคุณสมบัติของสายพันธุ์เชื้อแบคทีเรียประกอบด้วยพื้นที่การศึกษารวม 18 สถานีสุ่มตัวอย่างครอบคลุมภาคแตกต่างกันของ 'Chilika' เช่นภาคกลาง ภาคใต้ และนอกช่อง (รูปที่ 1A, 1B)ในระหว่างรอบระยะเวลาตั้งแต่เดือนมกราคมถึง 2551 มีนาคม แน่นอนสถานสุ่มได้ถาวรโดยตำแหน่งส่วนกลางระบบ(ดาวเทียม GPS) ตัวอย่างน้ำทั้งหมดถูกรวบรวมในการชั่วโมงเช้าระหว่าง 7:00 ท่าเรือคอรัลบีช - 11:00 น.ระหว่างมีการใช้มาตรการจำเป็นคอลเลกชันตัวอย่างการเก็บตัวอย่างน้ำอย่างมากในทะเลสาบ ตัวอย่างถูกรวบรวมไว้ในก่อน sterilized polypropylene ขวด (500มล) . พารามิเตอร์ทางกายภาพเช่นอุณหภูมิและ pHตัวอย่างที่กำหนดในจุดของคอลเลกชัน แล้วตัวอย่างน้ำถูกเก็บไว้ใน icebox และโอนย้ายการปฏิบัติสำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติมและตัวอย่างได้เก็บรักษาไว้ที่ 4ฐC ก่อนที่จะแยกและในการห้องปฏิบัติการ การทดลองได้ดำเนินการภายใน 4เดือนของคอลเลกชัน ใช้สำหรับเตรียมสารเคมีreagents ในปัจจุบันมีการวิเคราะห์รีเอเจนต์เกรด และเตรียมสอบ doubledistilled โซลูชั่นมีใช้น้ำ Milliliter ของน้ำอย่างหนึ่งถูกยัดเยียด โดยเจือจางประจำรับ 10-8เจือจาง หลังจากที่ มีผสม 1 มิลลิลิตรของตัวอย่างแตกออก 10-8กับ 10 mL ของ sterilized ซุปธาตุอาหารปานกลาง แล้วก็มี incubated ที่ ฐC 37 ในการบ่มเพาะวิสาหกิจ BOD ใน h. 24 หลังคณะทันตแพทยศาสตร์ที่รับค่าแบบเต็มวงของจุลินทรีย์จากอาณานิคมต่าง ๆ และลายแยกต่างหากในการagar gelled sterilized สื่อต่าง ๆ และแผ่นincubated ที่ ฐC 37 สำหรับ 24 ชมสำหรับแยกวัฒนธรรมบริสุทธิ์ลักษณะโคโลนีเช่นสี ลักษณะและรูปร่างของการแยกบันทึก เพิ่มเติมสัณฐาน และชีวเคมีทดสอบได้ดำเนินการปฏิบัติตามมาตรฐานทางจุลชีววิทยาต่อไปนี้วิธีโดยคาปูชิโน่และเชอร์แมน (2002)การระบุคุณสมบัติของแยกจุลินทรีย์ สายพันธุ์ที่แยกได้ยังลักษณะทางสรีรวิทยาปัจจัยต่าง ๆ เช่นค่า pH อุณหภูมิ และเค็มสังเกตยอมรับพวกเขากำลังการผลิตในสภาพแวดล้อมที่เครียดเก็บรวบรวมและเก็บรักษาซีรั่มก่อน immunizedสำหรับการผลิตของ antisera 3-4 เดือน-กระต่ายขาวเก่า (2.5 -3 กิโลกรัม) ถูกเลือก และเก็บไว้ในกรงต่างหาก และชื่ออย่างถูกต้อง จะ immunized ก่อนเถาะใช้สำหรับการทดสอบถูกรวบรวมไว้ก่อน 7 วันรับวัคซีนพร้อม ntigens เพื่อยืนยันว่า การกระต่ายไม่ประกอบด้วย antisera ใด ๆ หลอด sterilizedประกอบด้วยเลือดสดออกถูกเก็บไว้ที่ห้องอุณหภูมิสำหรับ h 1-2 สำหรับก่อ clot Clots ถูกกวน ด้วยเหล็กแก้ว และถูกเก็บไว้ค้างคืนในตู้เย็นให้หดตัว clot พลาสมาถูกcentrifuged (3000 รอบต่อนาที 15 นาที) เซรั่ม straw-colouredถูกถอนในหลอด sterilized เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ชื่ออย่างถูกต้อง สำหรับเก็บรักษาซีรั่ม ถูกเพิ่มด้วย 0.02% โซเดียม azide (NaNH2) ให้เป็นสุดท้ายความเข้มข้นของ 1:5000 และเก็บไว้ในเกมส์ที่ -20ฐC สำหรับใช้เพิ่มเติมทดสอบสภาวะจัดเตรียมการตรวจหาเซลล์ทั้งหมด: ตรวจหาได้เตรียมจากวัฒนธรรมแบคทีเรียสดปลูก ที่แบคทีเรียมีอ่างใน NSA ปานกลางในหลอดทดสอบที่ 27ฐC ใน 24 ชม หลอดทดสอบก็เต็มไป ด้วย PBS หรือน้ำเกลือวัฒนธรรมถูกขูดกับ sterilized inoculationเข็ม แบคทีเรีย scraped ด้วยน้ำเกลือได้โอนย้ายไปหลอดเครื่องหมุนเหวี่ยง การเจริญเติบโตของแบคทีเรียถูกผสมอย่างละเอียด โดยใช้ vortex ส่วนผสมการทำให้มันสมบูรณ์ homogenized เป็นกลุ่ม เซลล์ทั้งหมดของแบคทีเรียถูก centrifuged (3000 รอบต่อนาที 30 นาที ห้องพักอุณหภูมิ) Supernatant ถูกละทิ้งและเม็ดถูกเลื่อนออกไปอีกครั้ง ด้วยน้ำเกลือ และcentrifuged การถูกทำซ้ำสามครั้งเพื่อทำให้เชื้อแบคทีเรียจากวัสดุต่างประเทศใด ๆ หลังจากcentrifugation แบคทีเรียสุดท้ายถูกหยุดชั่วคราวในปกติอีกครั้งน้ำเกลือน้ำเกลือ/บริกร เก็บในหลอดตัวอย่าง sterilizedป้ายถูก รักษา และเก็บไว้ในเกมส์ที่-ฐC 20 สำหรับใช้เพิ่มเติมจัดเตรียมการตรวจหา agglutination ทดสอบ: การantigens ถูกเตรียม โดยระงับเชื้อแบคทีเรียที่อยู่ในบัฟเฟอร์น้ำเกลือตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ยกเว้นที่การตรวจหาเตรียมเข้มข้นมากขึ้นมีการออปติคอลความหนาแน่น 0.5 ใช้เครื่องไฮกัลเลนที่ 520มม.รับวัคซีนของกระต่าย antisera ผลิต และเก็บเกี่ยวซีรั่ม immunized: กระต่ายได้immunized โดยฉีดภายในกล้ามเนื้อ และฉีดขาซ้าย และขวาใช้สำหรับภายในกล้ามเนื้อฉีด ในกรณีที่ฉีดทางหลอดเลือดดำ หลอดเลือดดำกำไรของใช้หู 3 ปริมาณของตรวจหา (มล. 0.5, 1.0 mLและ 1.5 mL) ถูกฉีดที่สี่วัน intra-muscularlyช่วง อะซีโตนที่ใช้ถ่างหลอดเลือดดำ ที่ปริมาณออกถูกฉีดช้า ๆ ในเลือดระบบ ฉีดบูสเตอร์ให้ 4 วันหลังจากล่าสุดฉีดเพื่อเร่งผลิตแอนติบอดี ห้า หรือเจ็ดวันหลังจากฉีดบูสเตอร์ กระต่ายถูกจัดขึ้นโดยเจาะหัวใจสำหรับคอลเลกชันของ antisera ขั้นตอนการของเลือดแยกและเก็บรักษาของantiserum เหมือนกับที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ตรวจหาแอนติบอดีปฏิกิริยาทดสอบ: ส่วนผสมของการตรวจหา และแอนติบอดีที่แสดงปฏิกิริยาเชิงบวกทำให้เกิดการก่อตัวของฝนเนื่องจากผูกของแอนตี้ด้วยantigens ที่เกี่ยวข้องของพวกเขา สองทดสอบสภาวะต่าง ๆได้ดำเนินการบันทึก precipitations หรือบวกปฏิกิริยาของแอนตี้และตรวจหา ทดสอบเจลแพร่ทำตามวิธีการที่เป็นครั้งแรกโดย Ouchterlony (1958, 1962) ในขณะหลอดagglutination ทดสอบถูกดำเนินการสำหรับ homologous และantigens heterologous ที่ใช้วิธีการมาตรฐานแห่งชาติ(NHS, 2010)ทดสอบความไวต่อยาปฏิชีวนะทดสอบความไวต่อยาปฏิชีวนะของเชื้อแบคทีเรียที่ระบุได้ทำซ้ำ 3 ครั้งสำหรับแต่ละต้องใช้ใช้ 10 แตกต่างกันยาปฏิชีวนะได้แก่ norfloxacin เตตราไซคลีน ciprofloxacinนีโอมัยซิน กรดนาลิดิซิก ofloxacin, chloramphenicolnitrofurantoin, streptomycin และ amoxicillin (Hi - สื่อมุมไบ อินเดีย) โดยวิธีการแพร่ดิสก์ (Bauer et al., 1966) กิจกรรมยาปฏิชีวนะถูกวัด zoneinhibition (มม.เส้นผ่าศูนย์กลาง)Plasmid DNA agarose และแยกเจelectrophoresisวิธีเตรียมมินิ lysis ด่าง (ช่วยบวกสหรัฐอเมริการะบบฟอก DNA, Promega, Minipreps) ได้ใช้สำหรับสกัด plasmid จากแบคทีเรียสี่ทั้งหมดแยก มีแอร์พอร์ตโอเวอร์ไนท์โตแบคทีเรียวัฒนธรรม (3-5 mL)pelleted โดย centrifugation (10000 x g, 10 นาที),supernatant decanted และหยุดชั่วคราวอีกครั้งในแอล 300 เม็ดของเซลล์ใหม่ระงับ (50 มม.ตรี pH 7.5, 10mM EDTA ออก 100 mL RNase A) เซลล์ใหม่ระงับมีการถ่ายโอนการท่อไมโคร centrifuged 1.5 mL ไปOL ที่ 300 ของโซลูชันการ Lysis เซลล์ (0.2 M NaOH, 1%SDS) เข้ามา และตัวอย่างอย่างละเอียดผสม การล้างแอล 300 lysate ของปฏิกิริยาสะเทิน (1.32 Mโพแทสเซียม
การแปล กรุณารอสักครู่..
INTRODUCTION
‘Chilika’ is the largest lagoon in the subcontinent which is
situated along the east coast of India between latitude 19o
28’ and 19o 54’ N, and longitude 85o 05’ and 85o 38’E.
This is a shallow, brackish-water lake formed due to the
silting action of the Mahanadi River, which drains into the
northern end of the lake, and the northerly currents in the
Bay of Bengal, which have formed a sandbar along the
eastern shore (Arya and Lakhotia, 2006). It is the largest
brackish water wetland complex in Asia, declared as a
Ramsar site under the convention on “Wetlands of
International Importance”. This lagoon is presently under
threat from both natural and anthropogenic pressures
(Nayak et al., 2004). The marine realm constitutes the
major habitat of the biosphere covering 73 % of the earth
surface which provides the largest inhabitable space for
living organisms, particularly microbes. Marine microbes
flourish not only in the surface water of the sea, but also in
the lower and abyssal depths from coastal to the offshore
regions and from the general oceanic to the specialized
niches like blue waters of coral reefs to black smokers of
hot thermal vents at the sea floor.
As the water being served as major solvent, it plays an
important role in the pharmaceutical industries.
It is
considered as the primary source of contamination for
pharmaceutical products (Tamara et al., 1998). Microbes
present in the marine waters represent a potential source
for commercially important bioactive compounds and their
bioremediation capabilities are also remarkable. There is
an increasing demand of biodiversity from natural
resources for development of therapeutic drugs.
Antibiotics are broadly used as chemotherapeutic agents
which, albeit in a very low quantity, can inhibit the
pathogenic activity of microorganisms. The potential
contribution of marine organisms to the discovery of new
bioactive molecules is increasingly challenging (Sponga et
al., 1999; Skulberg, 2000). The microorganisms have
become a significant attraction as natural source of
bioactive molecules with a broad range of biological
activities, such as antibiotics, antivirals, antitumorals,
antioxidant and anti-inflammatory (Okami, 1982; Kamei et
al., 1987; Nunez et al., 2006; Uzair et al., 2009; Shankar
et al., 2010). Evidence of phycochemical and
pharmacological studies on microbes is available in the
literature (Zeeshan et al., 2010; Odeyemi et al., 2010;
Bragadeeswaran et al., 2010).
Previously, there were a number of researchers that had
worked on ‘Chilika’ regarding hydrological
characterization, water quality variation, antimicrobial
activity and physiochemical variation (Rao et al., 1981;
Nayak et al., 2004; Patra et al., 2009, Patra et al., 2010).
Unfortunately progress made on pharmaceutical studies
of marine microorganism from ‘Chilika’ is inadequate. This
underpinned the present study with a view to investigating
the physiological, biochemical, and serological
characterization of bacteria isolated from marine waters of
‘Chilika’ aiming at their exploitation for pharmaceutical
benefits.
MATERIALS AND METHODS
Isolation and characterization of bacterial strains
The total study area is comprised of 18 sampling stations
covering three different sectors of the ‘Chilika’ lagoon i.e.
Central, Southern and Outer Channel (Figure 1A, 1B)
during the period from January to March 2008. The exact
sampling locations were fixed by using Global Positioning
System (GPS). All the water samples were collected in the
morning hours between 7:00 A.M-11:00 A.M. During
sample collection necessary precautions had been taken
to collect undisturbed water samples in the lake. Samples
were collected in pre-sterilized polypropylene bottles (500
mL). Physical parameters like temperature and pH of the
samples were determined on the spot of collection. Then
the water samples were kept in the icebox and transferred
to laboratory for further analysis and the samples were
preserved at 4ฐC before isolation and identification in the
laboratory. The experiments were carried out within 4
months of collection. Chemicals used for preparation of
reagents in the present investigation were of analytical
reagent grade and for preparation of solutions doubledistilled
water was used. One milliliter of water sample
was subjected through serial dilution to obtain 10-8
dilution. After that 1mL of 10-8 diluted sample was mixed
with 10 mL of sterilized Nutrient broth medium and then it
was incubated at 37 ฐC in a BOD incubator for 24 h. After
incubation a loop-full of microbial culture were picked up
from different colonies and streaked separately on the
different agar-gelled sterilized media and the plates were
incubated at 37 ฐC for 24 h for isolation of pure culture.
The colony characteristics such as colour, appearance,
and shape of the isolate were recorded. Further,
morphological, and biochemical tests were carried out in
the laboratory by following standard microbiological
methods described by Cappuccino and Sherman (2002)
for identification and characterization of isolated
microorganism. The isolated strains were also
characterized through different physiological factors such
as pH, temperature and salinity to observe their tolerance
capacity in the stressed environmental conditions.
Collection and preservation of pre-immunized serum
For production of antisera 3-4 month-old white rabbit (2.5 -
3 kg) were selected and kept in separate cage and
labeled properly. The pre-immunized sera of the rabbit
used for the test were collected before 7 days of
immunization with different a ntigens to confirm that the
rabbit did not contain any antisera. The sterilized tube
containing fresh drawn blood was kept at room
temperature for 1-2 h for clot formation. The clots was
stirred with glass rod and was kept overnight in
refrigerator to allow the clot contraction. The plasma were
centrifuged (3000 rpm, 15 min). The straw-coloured serum
was withdrawn into a sterilized centrifuge tube which was
labeled properly. For preservation of serum, it was added
with 0.02 % sodium azide (NaNH2) to give a final
concentration of 1:5000 and kept in a deep freeze at -20
ฐC for further use.
Serological test
Preparation of whole cell antigen: The antigen was
prepared from the freshly grown bacterial cultures. The
bacteria were cultured on NSA medium in test tube at 27ฐC for 24 h. The test tube was filled with PBS or saline water.
The culture was scraped with sterilized inoculation
needle. The scraped bacteria with saline water were
transferred to the centrifuge tube. The bacterial growth
was mixed thoroughly with the help of a vortex mixture to
make it completely homogenized. The whole cell of
bacteria was centrifuged (3000 rpm, 30 min, room
temperature). The supernatant was discarded and the
pellet was re-suspended with saline water and
centrifuged. The process was repeated three times to
make the bacteria free from any foreign material. After the
last centrifugation bacteria were re-suspended in normal
saline/butler saline, collected in sterilized specimen tube,
labeled properly, preserved and stored in deep freeze at -
20 ฐC for further use.
Preparation of antigen for agglutination test: The
antigens were prepared by suspending live bacteria in
buffer saline as described earlier except that the antigen
prepared was more concentrated having an optical
density of 0.5 using a Gallen Kamp colorimeter at 520
mm.
Immunization of rabbits for antisera production and
harvesting of immunized serum: The rabbits were
immunized by intra-muscular and intravenous injections.
Both right and left legs were used for intra-muscular
injection. In case of intravenous injection, marginal vein of
ear was used. Three doses of antigen (0.5 mL, 1.0 mL,
and 1.5 mL) were injected intra-muscularly at four days
interval. Acetone was used to dilate the vein. The
designed quantity was injected slowly into the blood
system. A booster injection was given 4 days after the last
injection to accelerate antibody production. Five or seven
days after the booster injection, the rabbits were held by
cardiac puncture for collection of antisera. The procedure
of collection of blood separation and preservation of
antiserum was the same as described earlier.
Antigen-antibody reaction tests: Mixture of antigen and
antibody showing positive reaction resulted in the
formation of precipitation due to binding of antibodies with
their respective antigens. Two different serological tests
were conducted to record the precipitations or positive
reaction of antigen and antibodies. The gel diffusion test
was performed following the method as originally
described by Ouchterlony (1958, 1962) while the tube
agglutination test was carried out for homologous and
heterologous antigens using a national standard method
(NHS, 2010).
Antibiotic sensitivity test
Antibiotic sensitivity test of the identified bacteria were
repeated 3 times for each strain using 10 different
antibiotics namely norfloxacin, tetracycline, ciprofloxacin,
neomycin, nalidixic acid, ofloxacin, chloramphenicol,
nitrofurantoin, streptomycin and amoxicillin (Hi- Media,
Mumbai, India) by disc diffusion method (Bauer et al.,1966). Antibiotic activity was measured in terms of zoneinhibition (mm diameter).
Plasmid DNA isolation and agarose gel
electrophoresis
The alkaline-lysis mini-prep method (Wizard Plus
Minipreps DNA Purification Systems, Promega, USA) was
used for plasmid extraction from all the four bacterial
isolates. Overnight-grown bacterial cultures (3-5 mL) were
pelleted by centrifugation (10,000 x g, 10 min),
supernatant decanted and pellet re-suspended in 300 OL
of Cell Re-suspension Solution (50 mM Tris, pH 7.5; 10
mM EDTA; 100 Og/mL RNase A). The re-suspended cells
were transferred to 1.5 mL micro-centrifuged tube to
which 300 OL of Cell Lysis Solution (0.2 M NaOH, 1 %
SDS) was added and samples thoroughly mixed. To the
cleared lysate 300 OL of Neutralization Solution (1.32 M
potassium
‘Chilika’ is the largest lagoon in the subcontinent which is
situated along the east coast of India between latitude 19o
28’ and 19o 54’ N, and longitude 85o 05’ and 85o 38’E.
This is a shallow, brackish-water lake formed due to the
silting action of the Mahanadi River, which drains into the
northern end of the lake, and the northerly currents in the
Bay of Bengal, which have formed a sandbar along the
eastern shore (Arya and Lakhotia, 2006). It is the largest
brackish water wetland complex in Asia, declared as a
Ramsar site under the convention on “Wetlands of
International Importance”. This lagoon is presently under
threat from both natural and anthropogenic pressures
(Nayak et al., 2004). The marine realm constitutes the
major habitat of the biosphere covering 73 % of the earth
surface which provides the largest inhabitable space for
living organisms, particularly microbes. Marine microbes
flourish not only in the surface water of the sea, but also in
the lower and abyssal depths from coastal to the offshore
regions and from the general oceanic to the specialized
niches like blue waters of coral reefs to black smokers of
hot thermal vents at the sea floor.
As the water being served as major solvent, it plays an
important role in the pharmaceutical industries.
It is
considered as the primary source of contamination for
pharmaceutical products (Tamara et al., 1998). Microbes
present in the marine waters represent a potential source
for commercially important bioactive compounds and their
bioremediation capabilities are also remarkable. There is
an increasing demand of biodiversity from natural
resources for development of therapeutic drugs.
Antibiotics are broadly used as chemotherapeutic agents
which, albeit in a very low quantity, can inhibit the
pathogenic activity of microorganisms. The potential
contribution of marine organisms to the discovery of new
bioactive molecules is increasingly challenging (Sponga et
al., 1999; Skulberg, 2000). The microorganisms have
become a significant attraction as natural source of
bioactive molecules with a broad range of biological
activities, such as antibiotics, antivirals, antitumorals,
antioxidant and anti-inflammatory (Okami, 1982; Kamei et
al., 1987; Nunez et al., 2006; Uzair et al., 2009; Shankar
et al., 2010). Evidence of phycochemical and
pharmacological studies on microbes is available in the
literature (Zeeshan et al., 2010; Odeyemi et al., 2010;
Bragadeeswaran et al., 2010).
Previously, there were a number of researchers that had
worked on ‘Chilika’ regarding hydrological
characterization, water quality variation, antimicrobial
activity and physiochemical variation (Rao et al., 1981;
Nayak et al., 2004; Patra et al., 2009, Patra et al., 2010).
Unfortunately progress made on pharmaceutical studies
of marine microorganism from ‘Chilika’ is inadequate. This
underpinned the present study with a view to investigating
the physiological, biochemical, and serological
characterization of bacteria isolated from marine waters of
‘Chilika’ aiming at their exploitation for pharmaceutical
benefits.
MATERIALS AND METHODS
Isolation and characterization of bacterial strains
The total study area is comprised of 18 sampling stations
covering three different sectors of the ‘Chilika’ lagoon i.e.
Central, Southern and Outer Channel (Figure 1A, 1B)
during the period from January to March 2008. The exact
sampling locations were fixed by using Global Positioning
System (GPS). All the water samples were collected in the
morning hours between 7:00 A.M-11:00 A.M. During
sample collection necessary precautions had been taken
to collect undisturbed water samples in the lake. Samples
were collected in pre-sterilized polypropylene bottles (500
mL). Physical parameters like temperature and pH of the
samples were determined on the spot of collection. Then
the water samples were kept in the icebox and transferred
to laboratory for further analysis and the samples were
preserved at 4ฐC before isolation and identification in the
laboratory. The experiments were carried out within 4
months of collection. Chemicals used for preparation of
reagents in the present investigation were of analytical
reagent grade and for preparation of solutions doubledistilled
water was used. One milliliter of water sample
was subjected through serial dilution to obtain 10-8
dilution. After that 1mL of 10-8 diluted sample was mixed
with 10 mL of sterilized Nutrient broth medium and then it
was incubated at 37 ฐC in a BOD incubator for 24 h. After
incubation a loop-full of microbial culture were picked up
from different colonies and streaked separately on the
different agar-gelled sterilized media and the plates were
incubated at 37 ฐC for 24 h for isolation of pure culture.
The colony characteristics such as colour, appearance,
and shape of the isolate were recorded. Further,
morphological, and biochemical tests were carried out in
the laboratory by following standard microbiological
methods described by Cappuccino and Sherman (2002)
for identification and characterization of isolated
microorganism. The isolated strains were also
characterized through different physiological factors such
as pH, temperature and salinity to observe their tolerance
capacity in the stressed environmental conditions.
Collection and preservation of pre-immunized serum
For production of antisera 3-4 month-old white rabbit (2.5 -
3 kg) were selected and kept in separate cage and
labeled properly. The pre-immunized sera of the rabbit
used for the test were collected before 7 days of
immunization with different a ntigens to confirm that the
rabbit did not contain any antisera. The sterilized tube
containing fresh drawn blood was kept at room
temperature for 1-2 h for clot formation. The clots was
stirred with glass rod and was kept overnight in
refrigerator to allow the clot contraction. The plasma were
centrifuged (3000 rpm, 15 min). The straw-coloured serum
was withdrawn into a sterilized centrifuge tube which was
labeled properly. For preservation of serum, it was added
with 0.02 % sodium azide (NaNH2) to give a final
concentration of 1:5000 and kept in a deep freeze at -20
ฐC for further use.
Serological test
Preparation of whole cell antigen: The antigen was
prepared from the freshly grown bacterial cultures. The
bacteria were cultured on NSA medium in test tube at 27ฐC for 24 h. The test tube was filled with PBS or saline water.
The culture was scraped with sterilized inoculation
needle. The scraped bacteria with saline water were
transferred to the centrifuge tube. The bacterial growth
was mixed thoroughly with the help of a vortex mixture to
make it completely homogenized. The whole cell of
bacteria was centrifuged (3000 rpm, 30 min, room
temperature). The supernatant was discarded and the
pellet was re-suspended with saline water and
centrifuged. The process was repeated three times to
make the bacteria free from any foreign material. After the
last centrifugation bacteria were re-suspended in normal
saline/butler saline, collected in sterilized specimen tube,
labeled properly, preserved and stored in deep freeze at -
20 ฐC for further use.
Preparation of antigen for agglutination test: The
antigens were prepared by suspending live bacteria in
buffer saline as described earlier except that the antigen
prepared was more concentrated having an optical
density of 0.5 using a Gallen Kamp colorimeter at 520
mm.
Immunization of rabbits for antisera production and
harvesting of immunized serum: The rabbits were
immunized by intra-muscular and intravenous injections.
Both right and left legs were used for intra-muscular
injection. In case of intravenous injection, marginal vein of
ear was used. Three doses of antigen (0.5 mL, 1.0 mL,
and 1.5 mL) were injected intra-muscularly at four days
interval. Acetone was used to dilate the vein. The
designed quantity was injected slowly into the blood
system. A booster injection was given 4 days after the last
injection to accelerate antibody production. Five or seven
days after the booster injection, the rabbits were held by
cardiac puncture for collection of antisera. The procedure
of collection of blood separation and preservation of
antiserum was the same as described earlier.
Antigen-antibody reaction tests: Mixture of antigen and
antibody showing positive reaction resulted in the
formation of precipitation due to binding of antibodies with
their respective antigens. Two different serological tests
were conducted to record the precipitations or positive
reaction of antigen and antibodies. The gel diffusion test
was performed following the method as originally
described by Ouchterlony (1958, 1962) while the tube
agglutination test was carried out for homologous and
heterologous antigens using a national standard method
(NHS, 2010).
Antibiotic sensitivity test
Antibiotic sensitivity test of the identified bacteria were
repeated 3 times for each strain using 10 different
antibiotics namely norfloxacin, tetracycline, ciprofloxacin,
neomycin, nalidixic acid, ofloxacin, chloramphenicol,
nitrofurantoin, streptomycin and amoxicillin (Hi- Media,
Mumbai, India) by disc diffusion method (Bauer et al.,1966). Antibiotic activity was measured in terms of zoneinhibition (mm diameter).
Plasmid DNA isolation and agarose gel
electrophoresis
The alkaline-lysis mini-prep method (Wizard Plus
Minipreps DNA Purification Systems, Promega, USA) was
used for plasmid extraction from all the four bacterial
isolates. Overnight-grown bacterial cultures (3-5 mL) were
pelleted by centrifugation (10,000 x g, 10 min),
supernatant decanted and pellet re-suspended in 300 OL
of Cell Re-suspension Solution (50 mM Tris, pH 7.5; 10
mM EDTA; 100 Og/mL RNase A). The re-suspended cells
were transferred to 1.5 mL micro-centrifuged tube to
which 300 OL of Cell Lysis Solution (0.2 M NaOH, 1 %
SDS) was added and samples thoroughly mixed. To the
cleared lysate 300 OL of Neutralization Solution (1.32 M
potassium
การแปล กรุณารอสักครู่..
บทนำ
'chilika ' เป็นทะเลสาบที่ใหญ่ที่สุดในทวีปซึ่ง
ตั้งอยู่ตามชายฝั่งตะวันออกของอินเดีย ระหว่างละติจูด 19o
28 ' และ 19o 54 ' N และลองจิจูด 85o 05 ' และ 85o 38'e.
นี่คือตื้น ทะเลสาบน้ำกร่อยที่เกิดขึ้นเนื่องจากการกระทำของ
silting waters world - class . kgm แม่น้ำซึ่งไหลใน
ตอนเหนือสุดของทะเลสาบ และเหนือกระแสใน
อ่าวเบงกอลซึ่งมีรูปแบบที่สันทรายตามชายฝั่งตะวันออก ( อารียา และ lakhotia
, 2006 ) มันเป็นที่ใหญ่ที่สุด
น้ำกร่อยพื้นที่ชุ่มน้ำซับซ้อนในเอเชีย ประกาศเป็น
Ramsar เว็บไซต์ภายใต้อนุสัญญาว่าด้วย " ชายเลน
ความสำคัญระหว่างประเทศ " ทะเลสาบนี้เป็นปัจจุบันภายใต้การคุกคามจาก
แรงกดดันทั้งจากธรรมชาติและมนุษย์
( นาแยค et al . , 2004 ) อาณาจักรทะเลถือเป็น
ที่อยู่อาศัยหลักของชีวมณฑลครอบคลุมร้อยละ 73 ของโลก
พื้นผิวซึ่งมีพื้นที่ใหญ่ที่สุดสำหรับ inhabitable
สิ่งมีชีวิต โดยเฉพาะจุลินทรีย์ จุลินทรีย์ทะเล
เจริญรุ่งเรืองไม่เพียง แต่ในน้ำในทะเล แต่ยังลดลงและระดับความลึกจากก้นสมุทร
นอกชายฝั่งในภูมิภาคและจากมหาสมุทรทั่วไปกับเฉพาะ
niches เหมือนน้ำทะเลสีฟ้าของปะการังสีดำระบายความร้อนร้อนสูบบุหรี่ของ
อย่างที่พื้น ทะเล น้ำที่ถูกเสิร์ฟเป็นตัวทำละลายที่สำคัญ มันเล่นเป็นบทบาทสำคัญในอุตสาหกรรมเภสัชกรรม
ถือว่าเป็นหลักเป็นแหล่งที่มาของการปนเปื้อนสำหรับ
ผลิตภัณฑ์เภสัชกรรม ( Tamara et al . , 1998 ) . จุลินทรีย์ที่มีอยู่ในน้ำทะเล
แหล่งที่มีศักยภาพแทนสำหรับสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่สำคัญในเชิงพาณิชย์และความสามารถ
ค่าของพวกเขาจะยังโดดเด่น มีอุปสงค์เพิ่มขึ้นของความหลากหลายทางชีวภาพ
จากทรัพยากรธรรมชาติเพื่อการพัฒนายารักษาโรค .
ยาปฏิชีวนะวงกว้างใช้เป็นชนิดตัวแทน
ซึ่งแม้ว่าในปริมาณที่น้อยมากสามารถยับยั้งเชื้อโรค
กิจกรรมของจุลินทรีย์ ศักยภาพ
ผลงานของสิ่งมีชีวิตในทะเลเพื่อการค้นพบโมเลกุลของสารถูกท้าทายมากขึ้น ( sponga ใหม่
อัล et . , 1999 ; skulberg , 2000 ) จุลินทรีย์ได้กลายเป็นแหล่งท่องเที่ยวที่สำคัญเป็นแหล่ง
ธรรมชาติของโมเลกุลทางชีวภาพที่มีช่วงกว้างของกิจกรรมทางชีวภาพ
, เช่น ยาปฏิชีวนะ ยาต้าน antitumorals
, , สารต้านอนุมูลอิสระและต้านการอักเสบ ( หญิง , 1982 ;
คาเมอิ et al . ,1987 ; นูนเยซ et al . , 2006 ; uzair et al . , 2009 ; Shankar
et al . , 2010 ) หลักฐานการศึกษาทางเภสัชวิทยาใน phycochemical และ
จุลินทรีย์ที่มีอยู่ในวรรณคดี ( zeeshan et al . , 2010 ; odeyemi et al . , 2010 ;
bragadeeswaran et al . , 2010 ) .
ก่อนหน้านี้มีจำนวนของนักวิจัยที่ได้ทำงานใน ' '
chilika เกี่ยวกับลักษณะทางอุทกวิทยา
, การเปลี่ยนแปลงคุณภาพน้ำ ,ฤทธิ์ต้านจุลชีพและการเปลี่ยนแปลง (
physiochemical Rao et al . , 1981 ;
นาแยค et al . , 2004 ; ภัทร et al . , 2009 , ภัทร et al . , 2010 ) .
แต่ความก้าวหน้าในการศึกษาเภสัชกรรม
ทะเลจุลินทรีย์จาก ' chilika ' ไม่ นี้
สนับสนุนการศึกษาที่มีมุมมองที่จะสืบสวน
ทางสรีรวิทยา ชีวเคมี และการศึกษาคุณสมบัติของแบคทีเรียที่แยกได้จากปลาทะเลน้ำ
'chilika ' เป้าหมายในการแสวงหาประโยชน์ตนเพื่อประโยชน์ทางเภสัชกรรม
.
วัสดุและวิธีการ การแยกและการศึกษาคุณสมบัติของแบคทีเรียสายพันธุ์
พื้นที่ศึกษาทั้งหมดประกอบด้วย 18 ตัวอย่างสถานี
ครอบคลุมสามภาคต่าง ๆ ของ ' ' (
chilika ลากูน ภาคกลาง ภาคใต้ และภายนอกช่อง ( รูปที่ 1A 1B )
,ในช่วงเดือนมกราคม - มีนาคม 2551 แน่นอน
ตัวอย่างสถานที่ถูกกำหนดโดยการใช้ระบบตำแหน่งทั่วโลก ( GPS )
. ตัวอย่างน้ำทั้งหมดถูกเก็บในชั่วโมงเช้าระหว่าง 7 : 00 น.
a.m-11:00 ในระหว่างการเก็บตัวอย่างเป็นมาตรการป้องกันที่ได้ถูกถ่าย
เก็บตัวอย่างน้ำมองเห็นทิวทัศน์ในทะเลสาบ ตัวอย่าง
เก็บตัวก่อนฆ่าเชื้อ ขวดโพรพิลีน ( 500
มิลลิลิตร )พารามิเตอร์ทางกายภาพ เช่น อุณหภูมิ และ pH ของ
ตัวอย่างในจุดของคอลเลกชัน งั้น
ตัวอย่างน้ำถูกเก็บไว้ในช่องแช่แข็ง และโอน
เพื่อปฏิบัติการสำหรับการวิเคราะห์ต่อไปและจำนวน
เก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียสก่อนการแยกและระบุใน
ห้องปฏิบัติการ ทำการทดลองภายใน 4
เดือนของคอลเลกชัน สารเคมีที่ใช้สำหรับการเตรียม
สารเคมีในการตรวจสอบปัจจุบันมีสารเคมีเกรดวิเคราะห์
และการเตรียมการแก้ปัญหา doubledistilled
น้ำที่ใช้ หนึ่งมิลลิลิตรของน้ำตัวอย่าง
ถูกกระทำผ่านอุทิศถวายเพื่อให้ได้ 10-8
เจือจาง หลังจากนั้น 1ml ของ 10-8 ตัวอย่างเจือจางผสม
10 มิลลิลิตรน้ำสารอาหารและฆ่าเชื้อขนาดกลางแล้ว
ถูกบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสใน BOD Incubator เป็นเวลา 24 ชั่วโมงหลังจาก
บ่มเพาะห่วงเต็มของวัฒนธรรมจุลินทรีย์ถูกหยิบขึ้นมา
จากอาณานิคมที่แตกต่างกันและลายต่างหาก
วุ้นเจลฆ่าเชื้อต่าง ๆสื่อและแผ่นถูก
บ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมงในการแยกเชื้อบริสุทธิ์
โคโลนีลักษณะเช่นสี , ลักษณะ ,
และรูปร่างของแยกถูกบันทึกไว้ เพิ่มเติม เกี่ยวกับ การทดสอบทางชีวเคมี
,
ทดลองในห้องปฏิบัติการตามมาตรฐานที่อธิบายโดยวิธีทางจุลชีววิทยา
คาปูชิโนและเชอร์แมน ( 2002 )
สำหรับประชาชนและการแยกจุลินทรีย์ การแยกสายพันธุ์ ลักษณะทางสรีรวิทยาที่แตกต่างกันยัง
เป็นปัจจัยค่า pH , อุณหภูมิและความเค็ม เพื่อสังเกตความสามารถความอดทนของพวกเขาในสภาพแวดล้อมที่เครียด
.การเก็บและรักษาก่อนฉีดเซรั่ม
ผลิตแอนติ 3-4 เดือนกระต่ายเก่าสีขาว ( 2.5 -
3 กิโลกรัม ) สุ่มและเก็บไว้ในกรงแยก
ข้อความที่ถูกต้อง ก่อนการฉีดซีรั่มของกระต่าย
ที่ใช้สำหรับการทดสอบครั้งนี้ ก่อน 7 วันของการเป็น ntigens แตกต่างกัน
กระต่าย เพื่อยืนยันว่า ไม่ได้มีแอนติ . โดยหลอด
ประกอบด้วยสดวาดเลือดที่ถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้อง
1-2 H สำหรับการพัฒนาลิ่มเลือด ที่อุดตันอยู่
กวนด้วยแท่งแก้ว และถูกเก็บไว้ค้างคืนในตู้เย็นให้แข็งตัว
การหดตัว ระดับพลาสมาถูก
( 3000 รอบต่อนาที 15 นาที ) หลอดสี เซรั่ม
ถูกถอนไปฆ่าเชื้อหลอด centrifuge ซึ่ง
ข้อความที่ถูกต้อง สำหรับการเก็บรักษาเลือดมันเพิ่มด้วย
002 เดียมไซด์ ( nanh2 ) เพื่อให้ความเข้มข้นสุดท้าย
ของ 1:5000 และเก็บไว้ในลึกแช่แข็งที่ - 20 องศาเซลเซียส เพื่อการใช้งานต่อไป
.
เตรียมทดสอบระบบของแอนติเจนเซลล์ทั้งหมด : แอนติเจนคือ
เตรียมจากสด ๆโตแบคทีเรียวัฒนธรรม
แบคทีเรียถูกเพาะเลี้ยงในหลอดทดลองที่หน่วยข่าวกรองกลาง 27 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลอดทดลองที่เต็มไปด้วย PBS หรือน้ำเกลือ
วัฒนธรรม คือ การฆ่าเชื้อเข็มขูดด้วย
การถลอกแบคทีเรียด้วยน้ำเกลือถูก
โอนไปยัง centrifuge หลอด
การเจริญเติบโตแบคทีเรียผสมอย่างทั่วถึงด้วยความช่วยเหลือของ vortex ผสม
ทำให้มันสมบูรณ์บด . เซลล์ทั้งหมดของ
แบคทีเรียไฟฟ้า ( 3000 รอบต่อนาที , 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง )
) และน่านถูกทิ้งและ
เม็ดระงับได้อีกครั้งด้วยน้ำเกลือและ
ไฟฟ้า . กระบวนการทำซ้ำสามครั้ง
ทำให้แบคทีเรียฟรีจากวัสดุต่างประเทศใด ๆ หลังจาก
แบคทีเรีย 3 ที่แล้ว Re แขวนลอยในปกติ
น้ำเกลือ / พ่อบ้านน้ำเกลือฆ่าเชื้อเก็บในหลอดทดลอง
ติดป้ายอย่างถูกต้อง , การรักษาและเก็บไว้ในลึกแช่แข็งที่ - 20 องศาเซลเซียส เพื่อใช้ต่อ
.การเตรียมแอนติเจนสำหรับการทดสอบการจับกลุ่ม :
แอนติเจนเตรียมระงับแบคทีเรียอยู่ในบัฟเฟอร์น้ำเกลือตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้
เตรียมยกเว้นแอนติเจนคือเข้มข้นกว่า มีแสง
ความหนาแน่น 0.5 ใช้กัลเลนแคมพ์คัลเลอริมิเตอร์ที่ 520
.
ภูมิคุ้มกันโรคของกระต่ายสำหรับการผลิตแอนติซีรั่มและการเก็บเกี่ยว 5
: กระต่าย
โดยภายในกล้ามเนื้อและได้รับการฉีด .
ทั้งขวาและขาซ้าย ถูกใช้สำหรับฉีดภายในกล้ามเนื้อ
ในกรณีของการฉีดทางหลอดเลือดดำ , เส้นเลือดชายขอบของ
หูที่ใช้ 3 ปริมาณแอนติเจน ( 0.5 มล. 1.0 มล.
1.5 มิลลิลิตรฉีดภายในเกี่ยวกับกล้ามเนื้อในช่วงเวลาสี่วัน
. สำหรับใช้ขยายเส้นเลือด
ออกแบบปริมาณการฉีดช้าๆเข้าไปในระบบเลือด
ฉีดเพิ่มให้ 4 วัน หลังจากฉีดสุดท้าย
เพื่อเร่งการผลิตแอนติบอดี ห้า หรือเจ็ด
วันหลังฉีดบูสเตอร์ กระต่ายที่ถูกจัดขึ้นโดย
เจาะหัวใจสำหรับคอลเลกชันของแอนติ . กระบวนการของการแยกและรวบรวมเลือด
การทำปฏิกิริยาเช่นเดียวกับที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ แอนติเจนแอนติบอดีปฏิกิริยาทดสอบ
และส่วนผสมของแอนติเจนแอนติบอดีที่แสดงปฏิกิริยาบวก ส่งผลให้มีการตกตะกอนเนื่องจากผูกพัน
ของตนกับของแอนติบอดีต่อแอนติเจน การทดสอบที่แตกต่างกันสองระบบ
มีวัตถุประสงค์เพื่อบันทึกตะกอนหรือปฏิกิริยาบวก
ของแอนติเจนและแอนติบอดี เจลแบบทดสอบ
แสดงตามแบบเดิม
อธิบายโดย ouchterlony ( 1958 , 1962 ) ในขณะที่หลอด
การทดสอบการเกาะกลุ่มพบว่าแอนติเจนชนิดความคล้ายคลึงและ
วิธีการมาตรฐานแห่งชาติ ( NHS ) ) .
ยาปฏิชีวนะยาปฏิชีวนะการทดสอบความไวของการทดสอบความไวของการระบุแบคทีเรียถูก
ซ้ำ 3 ครั้งสำหรับแต่ละสายพันธุ์โดยใช้ที่แตกต่างกัน 10
ยาปฏิชีวนะคือ norfloxacin , tetracycline ไซโปรฟลอกซาซิน
นีโอมัยซิน , สะพานกรุงธน , ออฟลอกซาซิน , chloramphenicol ,
ไน , ,ยารักษา และ amoxicillin ( ไฮ - สื่อ
มุมไบ , อินเดีย ) โดยวิธีกระจายดิสก์ ( บาวเออร์ et al . , 1966 ) ยาปฏิชีวนะกิจกรรมวัดในแง่ของ zoneinhibition ( เส้นผ่าศูนย์กลาง มม.
แยกดีเอ็นเอดีเอ็นเอเจลอิเลคโตรโฟรีซีสและ
การสลายเป็นด่างขนาดเล็กเตรียมวิธี ( พ่อมดบวก
minipreps ระบบ บำบัดน้ำเสีย ดีเอ็นเอ promega , USA ) คือ
ใช้พลาสมิดการสกัดจากทั้งหมดสี่แบคทีเรีย
เชื้อ ค้างคืนที่ปลูกวัฒนธรรมแบคทีเรีย ( 3-5 มิลลิลิตร
เม็ดโดยการเหวี่ยงแยก ( 10 , 000 x G 10 นาที ) ,
น่านรินและ เม็ดจะแขวนลอยอยู่ในสารละลายแขวนลอย 300 ol
เซลล์อีกครั้ง ( 50 มม. โดย pH 7.5 , 10
100 mM EDTA ; Y / ml เลส ) เรื่องระงับเซลล์
โอน 1.5 ml หลอด
ระดับไมโครที่ 300 ol ของโซลูชั่นการสลายเซลล์ ( 0.2 M NaOH 1 %
SDS ) คือการเพิ่มและผสมอย่างทั่วถึง เพื่อ ol ในการล้าง lysate 300
โพแทสเซียมโซลูชั่น ( 1.32 เมตร
'chilika ' เป็นทะเลสาบที่ใหญ่ที่สุดในทวีปซึ่ง
ตั้งอยู่ตามชายฝั่งตะวันออกของอินเดีย ระหว่างละติจูด 19o
28 ' และ 19o 54 ' N และลองจิจูด 85o 05 ' และ 85o 38'e.
นี่คือตื้น ทะเลสาบน้ำกร่อยที่เกิดขึ้นเนื่องจากการกระทำของ
silting waters world - class . kgm แม่น้ำซึ่งไหลใน
ตอนเหนือสุดของทะเลสาบ และเหนือกระแสใน
อ่าวเบงกอลซึ่งมีรูปแบบที่สันทรายตามชายฝั่งตะวันออก ( อารียา และ lakhotia
, 2006 ) มันเป็นที่ใหญ่ที่สุด
น้ำกร่อยพื้นที่ชุ่มน้ำซับซ้อนในเอเชีย ประกาศเป็น
Ramsar เว็บไซต์ภายใต้อนุสัญญาว่าด้วย " ชายเลน
ความสำคัญระหว่างประเทศ " ทะเลสาบนี้เป็นปัจจุบันภายใต้การคุกคามจาก
แรงกดดันทั้งจากธรรมชาติและมนุษย์
( นาแยค et al . , 2004 ) อาณาจักรทะเลถือเป็น
ที่อยู่อาศัยหลักของชีวมณฑลครอบคลุมร้อยละ 73 ของโลก
พื้นผิวซึ่งมีพื้นที่ใหญ่ที่สุดสำหรับ inhabitable
สิ่งมีชีวิต โดยเฉพาะจุลินทรีย์ จุลินทรีย์ทะเล
เจริญรุ่งเรืองไม่เพียง แต่ในน้ำในทะเล แต่ยังลดลงและระดับความลึกจากก้นสมุทร
นอกชายฝั่งในภูมิภาคและจากมหาสมุทรทั่วไปกับเฉพาะ
niches เหมือนน้ำทะเลสีฟ้าของปะการังสีดำระบายความร้อนร้อนสูบบุหรี่ของ
อย่างที่พื้น ทะเล น้ำที่ถูกเสิร์ฟเป็นตัวทำละลายที่สำคัญ มันเล่นเป็นบทบาทสำคัญในอุตสาหกรรมเภสัชกรรม
ถือว่าเป็นหลักเป็นแหล่งที่มาของการปนเปื้อนสำหรับ
ผลิตภัณฑ์เภสัชกรรม ( Tamara et al . , 1998 ) . จุลินทรีย์ที่มีอยู่ในน้ำทะเล
แหล่งที่มีศักยภาพแทนสำหรับสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่สำคัญในเชิงพาณิชย์และความสามารถ
ค่าของพวกเขาจะยังโดดเด่น มีอุปสงค์เพิ่มขึ้นของความหลากหลายทางชีวภาพ
จากทรัพยากรธรรมชาติเพื่อการพัฒนายารักษาโรค .
ยาปฏิชีวนะวงกว้างใช้เป็นชนิดตัวแทน
ซึ่งแม้ว่าในปริมาณที่น้อยมากสามารถยับยั้งเชื้อโรค
กิจกรรมของจุลินทรีย์ ศักยภาพ
ผลงานของสิ่งมีชีวิตในทะเลเพื่อการค้นพบโมเลกุลของสารถูกท้าทายมากขึ้น ( sponga ใหม่
อัล et . , 1999 ; skulberg , 2000 ) จุลินทรีย์ได้กลายเป็นแหล่งท่องเที่ยวที่สำคัญเป็นแหล่ง
ธรรมชาติของโมเลกุลทางชีวภาพที่มีช่วงกว้างของกิจกรรมทางชีวภาพ
, เช่น ยาปฏิชีวนะ ยาต้าน antitumorals
, , สารต้านอนุมูลอิสระและต้านการอักเสบ ( หญิง , 1982 ;
คาเมอิ et al . ,1987 ; นูนเยซ et al . , 2006 ; uzair et al . , 2009 ; Shankar
et al . , 2010 ) หลักฐานการศึกษาทางเภสัชวิทยาใน phycochemical และ
จุลินทรีย์ที่มีอยู่ในวรรณคดี ( zeeshan et al . , 2010 ; odeyemi et al . , 2010 ;
bragadeeswaran et al . , 2010 ) .
ก่อนหน้านี้มีจำนวนของนักวิจัยที่ได้ทำงานใน ' '
chilika เกี่ยวกับลักษณะทางอุทกวิทยา
, การเปลี่ยนแปลงคุณภาพน้ำ ,ฤทธิ์ต้านจุลชีพและการเปลี่ยนแปลง (
physiochemical Rao et al . , 1981 ;
นาแยค et al . , 2004 ; ภัทร et al . , 2009 , ภัทร et al . , 2010 ) .
แต่ความก้าวหน้าในการศึกษาเภสัชกรรม
ทะเลจุลินทรีย์จาก ' chilika ' ไม่ นี้
สนับสนุนการศึกษาที่มีมุมมองที่จะสืบสวน
ทางสรีรวิทยา ชีวเคมี และการศึกษาคุณสมบัติของแบคทีเรียที่แยกได้จากปลาทะเลน้ำ
'chilika ' เป้าหมายในการแสวงหาประโยชน์ตนเพื่อประโยชน์ทางเภสัชกรรม
.
วัสดุและวิธีการ การแยกและการศึกษาคุณสมบัติของแบคทีเรียสายพันธุ์
พื้นที่ศึกษาทั้งหมดประกอบด้วย 18 ตัวอย่างสถานี
ครอบคลุมสามภาคต่าง ๆ ของ ' ' (
chilika ลากูน ภาคกลาง ภาคใต้ และภายนอกช่อง ( รูปที่ 1A 1B )
,ในช่วงเดือนมกราคม - มีนาคม 2551 แน่นอน
ตัวอย่างสถานที่ถูกกำหนดโดยการใช้ระบบตำแหน่งทั่วโลก ( GPS )
. ตัวอย่างน้ำทั้งหมดถูกเก็บในชั่วโมงเช้าระหว่าง 7 : 00 น.
a.m-11:00 ในระหว่างการเก็บตัวอย่างเป็นมาตรการป้องกันที่ได้ถูกถ่าย
เก็บตัวอย่างน้ำมองเห็นทิวทัศน์ในทะเลสาบ ตัวอย่าง
เก็บตัวก่อนฆ่าเชื้อ ขวดโพรพิลีน ( 500
มิลลิลิตร )พารามิเตอร์ทางกายภาพ เช่น อุณหภูมิ และ pH ของ
ตัวอย่างในจุดของคอลเลกชัน งั้น
ตัวอย่างน้ำถูกเก็บไว้ในช่องแช่แข็ง และโอน
เพื่อปฏิบัติการสำหรับการวิเคราะห์ต่อไปและจำนวน
เก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียสก่อนการแยกและระบุใน
ห้องปฏิบัติการ ทำการทดลองภายใน 4
เดือนของคอลเลกชัน สารเคมีที่ใช้สำหรับการเตรียม
สารเคมีในการตรวจสอบปัจจุบันมีสารเคมีเกรดวิเคราะห์
และการเตรียมการแก้ปัญหา doubledistilled
น้ำที่ใช้ หนึ่งมิลลิลิตรของน้ำตัวอย่าง
ถูกกระทำผ่านอุทิศถวายเพื่อให้ได้ 10-8
เจือจาง หลังจากนั้น 1ml ของ 10-8 ตัวอย่างเจือจางผสม
10 มิลลิลิตรน้ำสารอาหารและฆ่าเชื้อขนาดกลางแล้ว
ถูกบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสใน BOD Incubator เป็นเวลา 24 ชั่วโมงหลังจาก
บ่มเพาะห่วงเต็มของวัฒนธรรมจุลินทรีย์ถูกหยิบขึ้นมา
จากอาณานิคมที่แตกต่างกันและลายต่างหาก
วุ้นเจลฆ่าเชื้อต่าง ๆสื่อและแผ่นถูก
บ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมงในการแยกเชื้อบริสุทธิ์
โคโลนีลักษณะเช่นสี , ลักษณะ ,
และรูปร่างของแยกถูกบันทึกไว้ เพิ่มเติม เกี่ยวกับ การทดสอบทางชีวเคมี
,
ทดลองในห้องปฏิบัติการตามมาตรฐานที่อธิบายโดยวิธีทางจุลชีววิทยา
คาปูชิโนและเชอร์แมน ( 2002 )
สำหรับประชาชนและการแยกจุลินทรีย์ การแยกสายพันธุ์ ลักษณะทางสรีรวิทยาที่แตกต่างกันยัง
เป็นปัจจัยค่า pH , อุณหภูมิและความเค็ม เพื่อสังเกตความสามารถความอดทนของพวกเขาในสภาพแวดล้อมที่เครียด
.การเก็บและรักษาก่อนฉีดเซรั่ม
ผลิตแอนติ 3-4 เดือนกระต่ายเก่าสีขาว ( 2.5 -
3 กิโลกรัม ) สุ่มและเก็บไว้ในกรงแยก
ข้อความที่ถูกต้อง ก่อนการฉีดซีรั่มของกระต่าย
ที่ใช้สำหรับการทดสอบครั้งนี้ ก่อน 7 วันของการเป็น ntigens แตกต่างกัน
กระต่าย เพื่อยืนยันว่า ไม่ได้มีแอนติ . โดยหลอด
ประกอบด้วยสดวาดเลือดที่ถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้อง
1-2 H สำหรับการพัฒนาลิ่มเลือด ที่อุดตันอยู่
กวนด้วยแท่งแก้ว และถูกเก็บไว้ค้างคืนในตู้เย็นให้แข็งตัว
การหดตัว ระดับพลาสมาถูก
( 3000 รอบต่อนาที 15 นาที ) หลอดสี เซรั่ม
ถูกถอนไปฆ่าเชื้อหลอด centrifuge ซึ่ง
ข้อความที่ถูกต้อง สำหรับการเก็บรักษาเลือดมันเพิ่มด้วย
002 เดียมไซด์ ( nanh2 ) เพื่อให้ความเข้มข้นสุดท้าย
ของ 1:5000 และเก็บไว้ในลึกแช่แข็งที่ - 20 องศาเซลเซียส เพื่อการใช้งานต่อไป
.
เตรียมทดสอบระบบของแอนติเจนเซลล์ทั้งหมด : แอนติเจนคือ
เตรียมจากสด ๆโตแบคทีเรียวัฒนธรรม
แบคทีเรียถูกเพาะเลี้ยงในหลอดทดลองที่หน่วยข่าวกรองกลาง 27 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลอดทดลองที่เต็มไปด้วย PBS หรือน้ำเกลือ
วัฒนธรรม คือ การฆ่าเชื้อเข็มขูดด้วย
การถลอกแบคทีเรียด้วยน้ำเกลือถูก
โอนไปยัง centrifuge หลอด
การเจริญเติบโตแบคทีเรียผสมอย่างทั่วถึงด้วยความช่วยเหลือของ vortex ผสม
ทำให้มันสมบูรณ์บด . เซลล์ทั้งหมดของ
แบคทีเรียไฟฟ้า ( 3000 รอบต่อนาที , 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง )
) และน่านถูกทิ้งและ
เม็ดระงับได้อีกครั้งด้วยน้ำเกลือและ
ไฟฟ้า . กระบวนการทำซ้ำสามครั้ง
ทำให้แบคทีเรียฟรีจากวัสดุต่างประเทศใด ๆ หลังจาก
แบคทีเรีย 3 ที่แล้ว Re แขวนลอยในปกติ
น้ำเกลือ / พ่อบ้านน้ำเกลือฆ่าเชื้อเก็บในหลอดทดลอง
ติดป้ายอย่างถูกต้อง , การรักษาและเก็บไว้ในลึกแช่แข็งที่ - 20 องศาเซลเซียส เพื่อใช้ต่อ
.การเตรียมแอนติเจนสำหรับการทดสอบการจับกลุ่ม :
แอนติเจนเตรียมระงับแบคทีเรียอยู่ในบัฟเฟอร์น้ำเกลือตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้
เตรียมยกเว้นแอนติเจนคือเข้มข้นกว่า มีแสง
ความหนาแน่น 0.5 ใช้กัลเลนแคมพ์คัลเลอริมิเตอร์ที่ 520
.
ภูมิคุ้มกันโรคของกระต่ายสำหรับการผลิตแอนติซีรั่มและการเก็บเกี่ยว 5
: กระต่าย
โดยภายในกล้ามเนื้อและได้รับการฉีด .
ทั้งขวาและขาซ้าย ถูกใช้สำหรับฉีดภายในกล้ามเนื้อ
ในกรณีของการฉีดทางหลอดเลือดดำ , เส้นเลือดชายขอบของ
หูที่ใช้ 3 ปริมาณแอนติเจน ( 0.5 มล. 1.0 มล.
1.5 มิลลิลิตรฉีดภายในเกี่ยวกับกล้ามเนื้อในช่วงเวลาสี่วัน
. สำหรับใช้ขยายเส้นเลือด
ออกแบบปริมาณการฉีดช้าๆเข้าไปในระบบเลือด
ฉีดเพิ่มให้ 4 วัน หลังจากฉีดสุดท้าย
เพื่อเร่งการผลิตแอนติบอดี ห้า หรือเจ็ด
วันหลังฉีดบูสเตอร์ กระต่ายที่ถูกจัดขึ้นโดย
เจาะหัวใจสำหรับคอลเลกชันของแอนติ . กระบวนการของการแยกและรวบรวมเลือด
การทำปฏิกิริยาเช่นเดียวกับที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ แอนติเจนแอนติบอดีปฏิกิริยาทดสอบ
และส่วนผสมของแอนติเจนแอนติบอดีที่แสดงปฏิกิริยาบวก ส่งผลให้มีการตกตะกอนเนื่องจากผูกพัน
ของตนกับของแอนติบอดีต่อแอนติเจน การทดสอบที่แตกต่างกันสองระบบ
มีวัตถุประสงค์เพื่อบันทึกตะกอนหรือปฏิกิริยาบวก
ของแอนติเจนและแอนติบอดี เจลแบบทดสอบ
แสดงตามแบบเดิม
อธิบายโดย ouchterlony ( 1958 , 1962 ) ในขณะที่หลอด
การทดสอบการเกาะกลุ่มพบว่าแอนติเจนชนิดความคล้ายคลึงและ
วิธีการมาตรฐานแห่งชาติ ( NHS ) ) .
ยาปฏิชีวนะยาปฏิชีวนะการทดสอบความไวของการทดสอบความไวของการระบุแบคทีเรียถูก
ซ้ำ 3 ครั้งสำหรับแต่ละสายพันธุ์โดยใช้ที่แตกต่างกัน 10
ยาปฏิชีวนะคือ norfloxacin , tetracycline ไซโปรฟลอกซาซิน
นีโอมัยซิน , สะพานกรุงธน , ออฟลอกซาซิน , chloramphenicol ,
ไน , ,ยารักษา และ amoxicillin ( ไฮ - สื่อ
มุมไบ , อินเดีย ) โดยวิธีกระจายดิสก์ ( บาวเออร์ et al . , 1966 ) ยาปฏิชีวนะกิจกรรมวัดในแง่ของ zoneinhibition ( เส้นผ่าศูนย์กลาง มม.
แยกดีเอ็นเอดีเอ็นเอเจลอิเลคโตรโฟรีซีสและ
การสลายเป็นด่างขนาดเล็กเตรียมวิธี ( พ่อมดบวก
minipreps ระบบ บำบัดน้ำเสีย ดีเอ็นเอ promega , USA ) คือ
ใช้พลาสมิดการสกัดจากทั้งหมดสี่แบคทีเรีย
เชื้อ ค้างคืนที่ปลูกวัฒนธรรมแบคทีเรีย ( 3-5 มิลลิลิตร
เม็ดโดยการเหวี่ยงแยก ( 10 , 000 x G 10 นาที ) ,
น่านรินและ เม็ดจะแขวนลอยอยู่ในสารละลายแขวนลอย 300 ol
เซลล์อีกครั้ง ( 50 มม. โดย pH 7.5 , 10
100 mM EDTA ; Y / ml เลส ) เรื่องระงับเซลล์
โอน 1.5 ml หลอด
ระดับไมโครที่ 300 ol ของโซลูชั่นการสลายเซลล์ ( 0.2 M NaOH 1 %
SDS ) คือการเพิ่มและผสมอย่างทั่วถึง เพื่อ ol ในการล้าง lysate 300
โพแทสเซียมโซลูชั่น ( 1.32 เมตร
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- Natural foods are often assumed to be fo
- Shop till you drop
- For the technological analysis, discuss
- As well as the friends of the field.
- ตอบจะไม่รบกวนอีก
- ทุกวันนี้ไลฟ์สไตล์ของผู้คนเปลี่ยนไป ใช้ช
- เล่นเกมส์จนครบทุกคู่
- เหมยเก่อหนี่
- A concerned
- ฉันเตรียมตัวสอบคัดเลือก
- ฉันซ้อมเชียร์หลีดเดอร์พึ่งเสร็จ
- ช่วงนี้พ่อทำงานจนถึงต้นปีหน้า ดูเหมือนว่
- When winter arrived Forest will start to
- Would you even let me get into your pant
- hence the crystallinity ofthe samples al
- Bacterial vaginosis
- I'm cold as stone I’m cold as stone
- purchases = cost of sales +(ending balan
- ช่วงนี้พ่อทำงานจนถึงต้นปีหน้า ดูเหมือนว่
- เล่นเกมส์จนครบทุกคู่
- ฉันเผลอหลับไป
- เงาะ
- Health all darling
- และที่HNอากาศเป็นยังไง?
