เกิดเมื่อวันที่ 15 กุมภาพันธ์ ค.ศ. 1564 ที่เมืองปิซา ประเทศอิตาลี เป็นบุตรคนโตในจำนวนบุตร 6 คนของวินเชนโซ กาลิเลอี นักดนตรีลูทผู้มีชื่อเสียง มารดาชื่อ จูเลีย อัมมันนาตี เมื่อกาลิเลโออายุได้ 8 ขวบ ครอบครัวได้ย้ายไปตั้งรกรากที่เมืองฟลอเรนซ์ แต่กาลิเลโอต้องพำนักอยู่กับจาโกโป บอร์กีนิ เป็นเวลาสองปี เขาเรียนหนังสือที่อารามคามัลโดเลเซ เมืองวัลลอมโบรซา ซึ่งอยู่ห่างจากฟลอเรนซ์ไปทางตะวันออกเฉียงใต้ประมาณ 34 กิโลเมตร กาลิเลโอมีความคิดจะบวชตั้งแต่ยังหนุ่ม แต่เขาก็ได้สมัครเข้าเรียนวิชาแพทย์ที่มหาวิทยาลัยปิซาตามความต้องการของพ่อ กาลิเลโอเรียนแพทย์ไม่จบ กลับไปได้ปริญญาสาขาคณิตศาสตร์มาแทน ปี ค.ศ. 1589 เขาได้รับเลือกเป็นหัวหน้าวิชาคณิตศาสตร์ที่มหาวิทยาลัยปิซา เมื่อถึงปี ค.ศ. 1591 บิดาของเขาเสียชีวิต กาลิเลโอรับหน้าที่อภิบาลน้องชายคนหนึ่งคือ มีเกลัญโญโล เขาย้ายไปสอนที่มหาวิทยาลัยแพดัวในปี ค.ศ. 1592 โดยสอนวิชาเรขาคณิต กลศาสตร์ และดาราศาสตร์ จนถึงปี ค.ศ. 1610 ในระหว่างช่วงเวลานี้ กาลิเลโอได้ทำการค้นพบที่สำคัญมากมาย ทั้งทางด้านวิทยาศาสตร์บริสุทธิ์ (เช่น จลนศาสตร์การเคลื่อนที่ และดาราศาสตร์) หรือวิทยาศาสตร์ประยุกต์ (เช่น ความแข็งของวัตถุ และการพัฒนากล้องโทรทรรศน์) ความสนใจของเขายังครอบคลุมถึงความรู้ด้านโหราศาสตร์ ซึ่งในยุคสมัยนั้นมีความสำคัญไม่แพ้คณิตศาสตร์หรือดาราศาสตร์ทีเดียว
การศึกษาการเคลื่อนที่ของวัตถุที่มีความเร่งคงที่ ซึ่งสอนกันอยู่ทั่วไปในระดับมัธยมศึกษาและเป็นพื้นฐานสำคัญของวิชาฟิสิกส์ก็เป็นผลงานของกาลิเลโอ รู้จักกันในเวลาต่อมาในฐานะวิชาจลนศาสตร์ งานศึกษาด้านดาราศาสตร์ที่สำคัญของกาลิเลโอได้แก่ การใช้กล้องโทรทรรศน์สังเกตการณ์คาบปรากฏของดาวศุกร์ การค้นพบดาวบริวารของดาวพฤหัสบดี ซึ่งต่อมาตั้งชื่อเป็นเกียรติแก่เขาว่า ดวงจันทร์กาลิเลียน รวมถึงการสังเกตการณ์และการตีความจากการพบจุดดับบนดวงอาทิตย์ กาลิเลโอยังมีผลงานด้านเทคโนโลยีและวิทยาศาสตร์ประยุกต์ซึ่งช่วยพัฒนาการออกแบบเข็มทิศอีกด้วย
การที่ผลงานของกาลิเลโอสนับสนุนแนวคิดของโคเปอร์นิคัสกลายเป็นต้นเหตุของการถกเถียงหลายต่อหลายครั้งในชีวิตของเขา เพราะแนวคิดเรื่องโลกเป็นศูนย์กลางของจักรวาลนั้นเป็นแนวคิดหลักมานานแสนนานนับแต่ยุคของอริสโตเติล การเปลี่ยนแนวคิดใหม่ว่าดวงอาทิตย์เป็นศูนย์กลางของจักรวาลโดยมีข้อมูลสังเกตการณ์ทางวิทยาศาสตร์อย่างชัดเจนจากกาลิเลโอช่วยสนับสนุน ทำให้คริสตจักรโรมันคาทอลิกต้องออกกฎให้แนวคิดเช่นนั้นเป็นสิ่งต้องห้าม เพราะขัดแย้งกับการตีความตามพระคัมภีร์[4] กาลิเลโอถูกบังคับให้ปฏิเสธความเชื่อเรื่องดวงอาทิตย์เป็นศูนย์กลาง และต้องใช้ชีวิตที่เหลืออยู่ในบ้านกักตัวในความควบคุมของศาลศาสนาโรมัน