The experimental design for multipl

The experimental design for multiplexing is more complicated than for single-reaction qPCR. Amplification of the multiple targets in a single sample can be influenced by factors including gene expression levels, primer interactions, and competition for reaction reagents. Therefore, careful primer and probe design and optimization of amplification are critical.

Check for primer and probe se­quence interactions. Use the free IDT OligoAnalyzer® software (www.idtdna.com/SciTools) to ensure that primer and probe sets lack hairpins, and homo- and heterodimer interactions. From there, you can link directly to BLAST to further analyze possible sequence interactions. For help with using the BLAST tool, see Tips for Using BLAST to Locate PCR Primers, in the IDT DECODED 1.1, April 2011 newsletter.
Use a unique reporter dye to identify each target. Determine the dyes for which your qPCR instrument has been calibrated or is capable of detecting once calibrated. The manufacturer can provide instrument excitation and detectable emission wavelengths. Choose dyes with appropriate excitation wavelengths with little to no overlap in their emission spectra (Table 1, above). Take into account overall fluorescence intensity as well. For example, FAM is a good dye choice for low copy transcripts because it has high fluorescent signal intensity. Fluorophores with lower signal intensities can then be used for more abundant transcripts. Keep in mind that you may need to calibrate your instrument for a particular dye prior to use.
Minimize signal cross-talk by using probes that quench well. Highly efficient, dark quenchers—especially those used in combination with a secondary quencher such as the ZEN™ quencher (www.idtdna.com/primetime) have an added advantage in multiplex reactions. They considerably reduce background fluorescence leading to increased sensitivity and end-point signal, as well as earlier Cq values.
Optimize individual reactions. Ensure that each individual assay reaction is >90% efficient. Test this by running individual assay reactions even if you are using assays that have been published or tested in other laboratories. IDT dsDNA gBlocks™ Gene Fragments and long, ssDNA Ultramer® Oligonucleotides are ideal as targets for such studies.
Validate the multiplex reactions. Run a combined reaction alongside individual reactions to ensure comparable performance. Compare the standard curves and verify that the Cq values are similar throughout the dynamic range to be tested. While the endpoint fluorescent signal will likely be reduced in a multiplex reaction compared to a singleplex, the Cq value should not be affected (Figure 2, above).
Optimize the multiplex reactions.
Master mix. The effects of number of targets, target abundance, and amplicon length on the consumption of reaction components are greater for multiplex reactions than singleplex. If any reaction components are limiting, multiplex reactions can show either significant Cq delays in the case of qPCR, or total loss of PCR products, especially for the targets of lowest abundance.

Master mixes specifically formulated for multiplexing are available commercially. When a homemade master mix optimized for singleplex qPCR is being adapted for multiplex reactions, give careful consideration to adjusting the concentration of reaction components. A multiplex reaction will require at least twice as much polymerase as the minimum amount previously titrated for a singleplex qPCR. Additionally, if dNTPs were not in excess for the singleplex reaction, the dNTP concentration will have to be increased. The increased total amount of nucleic acid in the reaction (e.g., from adding additional dNTPs as well as primers/probe, or by generating more template) will decrease the free Mg2+ available for the polymerase, requiring adjustment to the Mg2+ concentration.

Primer ratio. If the standard 2:1 primer-to-probe ratio for each of the genes analyzed does not provide optimal results, adjust the primer concentrations. For highly expressed targets, use a 1:1 primer-to-probe ratio. Increase the primer-to-probe ratio for targets expressed at lower levels. IDT offers custom primer-to-probe ratio options for PrimeTime® qPCR Assays.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การออกแบบการทดลองสำหรับมัลติเพล็กซ์แบบมีความซับซ้อนมากขึ้นกว่าในปฏิกิริยาเดียว qPCR ขยายเป้าหมายหลายในตัวอย่างเดียวอาจมีผลมาจากปัจจัยระดับยีนนิพจน์ พื้นโต้ตอบ และการแข่งขันสำหรับปฏิกิริยา reagents ดังนั้น ระวังรองพื้นและโพรบการออกแบบและเพิ่มประสิทธิภาพของขยายมีความสำคัญตรวจสอบพื้นและโพรบโต้ตอบลำดับ ใช้ฟรี IDT OligoAnalyzer ®ซอฟต์แวร์ (www.idtdna.com/SciTools) เพื่อให้แน่ใจว่าพื้น และโพรบตั้ง hairpins ขาด และการโต้ตอบที่กะเทยและ heterodimer จาก คุณสามารถเชื่อมโยงกับระเบิดเพื่อวิเคราะห์เพิ่มเติม ลำดับที่สามารถโต้ตอบโดยตรง สำหรับความช่วยเหลือเกี่ยวกับการใช้เครื่องมือระเบิด ดูเคล็ดลับสำหรับระเบิดที่ใช้เพื่อค้นหา PCR ไพรเมอร์ ใน IDT ถอดรหัส 1.1 จดหมายข่าวเดือน 2554 เมษายนใช้ย้อมเฉพาะโปรแกรมรายงานเพื่อระบุเป้าหมายแต่ละ กำหนดสีที่ qPCR เครื่องของคุณมีการปรับเทียบ หรือมีความสามารถในการตรวจสอบปรับเทียบครั้ง ผู้ผลิตสามารถให้เครื่องมือในการกระตุ้นและความยาวคลื่นที่สามารถปล่อยก๊าซ เลือกสีที่ มีความยาวคลื่นในการกระตุ้นที่เหมาะสมทับซ้อนไม่น้อยด้วยในแรมสเป็คตราของมลพิษ (ตาราง 1 เหนือ) คำนึงถึงความเข้ม fluorescence โดยรวมเช่นการ ตัวอย่าง FAM เป็นตัวเลือกดีย้อมสำหรับต่ำสำเนาใบแสดงผลเนื่องจากมีความเข้มสัญญาณสูงเรืองแสง แล้วใช้ Fluorophores กับการปลดปล่อยก๊าซสัญญาณต่ำในใบแสดงผลมากขึ้น โปรดจำไว้ว่าคุณอาจต้องการปรับเทียบเครื่องมือสำหรับก่อนการย้อมที่จะใช้ลดการคุยข้ามกันของสัญญาณ โดยใช้คลิปปากตะเข้ที่ดับดี Quenchers ที่มีประสิทธิภาพสูง ดำ — โดยเฉพาะอย่างยิ่งผู้ที่ใช้ร่วมกับ quencher รองเช่น quencher ™เซน (www.idtdna.com/primetime) มีข้อดีเพิ่มในปฏิกิริยาต่าง ๆ ๅ นอกจากนี้พวกเขามากลด fluorescence พื้นหลังที่นำไปสู่ความไวเพิ่มขึ้น และจุดสัญญาณ รวมทั้งค่าซีก่อนหน้านี้ปรับแต่ละปฏิกิริยา มั่นใจว่า แต่ละปฏิกิริยาทดสอบละ > 90% มีประสิทธิภาพ ทดสอบได้ โดยทำการวิเคราะห์แต่ละปฏิกิริยาแม้ว่าคุณใช้ assays ที่เผยแพร่ หรือทดสอบในห้องปฏิบัติการอื่น ๆ IDT dsDNA gBlocks ™บางส่วนของยีนและยาวนาน ssDNA Ultramer ® Oligonucleotides เหมาะเป็นเป้าหมายในการศึกษาดังกล่าวตรวจสอบปฏิกิริยา multiplex เรียกปฏิกิริยารวมควบคู่ไปกับปฏิกิริยาแต่ละให้ประสิทธิภาพเทียบเท่า เปรียบเทียบเส้นโค้งมาตรฐาน และตรวจสอบว่า ค่าซีคล้ายกันตลอดช่วงแบบไดนามิกที่จะทดสอบ ในขณะที่สัญญาณฟลูออเรสปลายจะลดลงในปฏิกิริยา multiplex ที่เปรียบเทียบกับ singleplex มีแนวโน้ม ค่าซีจะไม่ได้รับผลกระทบ (รูป 2 เหนือ)ปรับปฏิกิริยา multiplexผสมหลัก ผลกระทบของเป้าหมาย เป้าหมายมากมาย และ amplicon ความยาวในปริมาณของส่วนประกอบปฏิกิริยามีมากกว่าสำหรับปฏิกิริยาต่าง ๆ ๅ singleplex หากจำกัดการคอมโพเนนต์ใด ๆ ปฏิกิริยา ปฏิกิริยา multiplex สามารถแสดงหนึ่งซีล่าช้าที่สำคัญในกรณีของ qPCR หรือขาดทุนรวมของผลิตภัณฑ์ PCR โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับเป้าหมายของความอุดมสมบูรณ์ต่ำออกแบบผสมผสานหลักสูตรเฉพาะสำหรับการมัลติเพล็กซ์แบบมีพร้อมจำหน่าย เมื่อเป็นการดัดแปลงผสมหลักโฮมเมดเหมาะ singleplex qPCR สำหรับปฏิกิริยาต่าง ๆ ๅ ให้รอบคอบเพื่อปรับความเข้มข้นของส่วนประกอบปฏิกิริยา ปฏิกิริยา multiplex จะต้องพอลิเมอเรสที่สองเท่ากับยอดเงินต่ำสุดก่อนหน้านี้ titrated สำหรับ singleplex qPCR นอกจากนี้ ถ้าเกินสำหรับปฏิกิริยา singleplex, dNTPs ไม่เข้มข้น dNTP จะได้ที่จะเพิ่ม เพิ่มจำนวนกรดนิวคลีอิกในปฏิกิริยา (เช่น เพิ่มเติม dNTPs เป็นไพรเมอร์/โพรบ หรือ โดยการสร้างแม่แบบเพิ่มเติม) จะลดการฟรี Mg2 + สำหรับพอลิเมอเรส ต้องปรับปรุง Mg2 + ความเข้มข้นอัตราส่วนสีรองพื้น ถ้าอัตราส่วนพื้นโพรบ 2:1 มาตรฐานสำหรับแต่ละยีนที่วิเคราะห์ให้ผล ปรับความเข้มข้นสีรองพื้น สำหรับเป้าหมายที่แสดงสูง ใช้อัตราส่วนเป็น 1:1 พื้นโพรบ เพิ่มอัตรารองพื้นโพรบสำหรับแสดงในระดับต่ำกว่าเป้าหมาย IDT มีอัตราส่วนพื้นโพรบกำหนดเองตัวเลือกสำหรับ Assays qPCR PrimeTime ®

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การออกแบบการทดลองสำหรับมัลติมีความซับซ้อนมากกว่าปฏิกิริยาเดียว qPCR การขยายของเป้าหมายหลายแห่งในตัวอย่างเดียวสามารถได้รับอิทธิพลจากปัจจัยรวมทั้งระดับการแสดงออกของยีนปฏิสัมพันธ์ไพรเมอร์และการแข่งขันสำหรับสารเคมีเกิดปฏิกิริยา ดังนั้นไพรเมอร์อย่างระมัดระวังและการออกแบบการสอบสวนและการเพิ่มประสิทธิภาพของการขยายมีความสำคัญ. ตรวจสอบและสอบสวนไพรเมอร์ปฏิสัมพันธ์ลำดับ ใช้ซอฟต์แวร์ฟรีราชกิจจานุเบกษาOligoAnalyzer® (www.idtdna.com/SciTools) เพื่อให้แน่ใจว่าชุดไพรเมอร์และสอบสวนขาดปักและ homo- และการมีปฏิสัมพันธ์ heterodimer จากนั้นคุณสามารถเชื่อมโยงโดยตรงกับระเบิดเพื่อวิเคราะห์ปฏิสัมพันธ์ลำดับที่เป็นไปได้ สำหรับความช่วยเหลือเกี่ยวกับการใช้เครื่องมือระเบิดให้ดูเคล็ดลับการใช้ระเบิดเพื่อค้นหาตำแหน่งไพรเมอร์ PCR ในราชกิจจานุเบกษาถอดรหัส 1.1 เมษายน 2011 จดหมายข่าว. ใช้สีย้อมนักข่าวที่ไม่ซ้ำกันในการระบุเป้าหมายแต่ละ กำหนดสีที่เครื่องมือ qPCR ของคุณได้รับการสอบเทียบหรือมีความสามารถในการปรับเทียบของการตรวจสอบครั้งเดียว ผู้ผลิตสามารถให้เครื่องมือที่ใช้ในการกระตุ้นและความยาวคลื่นที่ปล่อยก๊าซเรือนกระจกที่ตรวจพบ เลือกสีที่มีความยาวคลื่นกระตุ้นที่เหมาะสมมีน้อยที่จะซ้อนทับกันในสเปกตรัมของพวกเขาไม่ปล่อยก๊าซเรือนกระจก (ตารางที่ 1 ข้างต้น) คำนึงถึงความเข้มของแสงโดยรวมได้เป็นอย่างดี ยกตัวอย่างเช่น FAM เป็นทางเลือกที่ดีสำหรับการย้อมสำเนาใบรับรองผลการเรียนต่ำเพราะมีความเข้มของสัญญาณเรืองแสงสูง fluorophores กับความเข้มของสัญญาณที่ต่ำกว่านั้นจะสามารถใช้สำหรับใบรับรองผลการเรียนมากขึ้น โปรดจำไว้ว่าคุณอาจจำเป็นต้องปรับเครื่องมือของคุณสำหรับสีย้อมโดยเฉพาะอย่างยิ่งก่อนที่จะใช้. ลดสัญญาณข้ามพูดโดยใช้ยานสำรวจที่ดับอย่างดี ที่มีประสิทธิภาพสูงที่มืด quenchers โดยเฉพาะอย่างยิ่งผู้ที่ใช้ร่วมกับรองดับเช่น ZEN ™ดับ (www.idtdna.com/primetime) มีประโยชน์เพิ่มปฏิกิริยาหลาย พวกเขาลดแสงพื้นหลังที่นำไปสู่ความไวที่เพิ่มขึ้นและสัญญาณจุดสิ้นสุดเช่นเดียวกับก่อนหน้านี้ค่า Cq. เพิ่มประสิทธิภาพในการเกิดปฏิกิริยาของแต่ละบุคคล ตรวจสอบให้แน่ใจว่าการทดสอบปฏิกิริยาของแต่ละคนคือ> 90% มีประสิทธิภาพ การทดสอบนี้โดยใช้การทดสอบปฏิกิริยาของแต่ละบุคคลแม้ว่าคุณจะใช้การวิเคราะห์ที่ได้รับการตีพิมพ์หรือการทดสอบในห้องปฏิบัติการอื่น ๆ ราชกิจจานุเบกษา dsDNA gBlocks ™ยีนเศษและยาว ssDNA Ultramer® oligonucleotides เหมาะเป็นเป้าหมายในการศึกษาดังกล่าว. ตรวจสอบปฏิกิริยาหลาย เรียกปฏิกิริยารวมควบคู่ไปกับปฏิกิริยาของแต่ละบุคคลเพื่อให้ประสิทธิภาพเทียบเคียง เปรียบเทียบโค้งมาตรฐานและตรวจสอบว่าค่า Cq มีความคล้ายคลึงกันตลอดช่วงแบบไดนามิกที่จะทดสอบ ในขณะที่สัญญาณเรืองแสงปลายทางมีแนวโน้มที่จะลดลงในหลายปฏิกิริยาเมื่อเทียบกับ singleplex ที่ค่า Cq ไม่ควรได้รับผลกระทบ (รูปที่ 2 ข้างต้น). เพิ่มประสิทธิภาพปฏิกิริยา multiplex. ผสมปริญญาโท ผลกระทบของจำนวนเป้าหมายอุดมสมบูรณ์เป้าหมายและระยะเวลาใน amplicon ในการบริโภคของชิ้นส่วนที่มีปฏิกิริยามากขึ้นสำหรับปฏิกิริยาหลายกว่า singleplex หากชิ้นส่วนปฏิกิริยาใด ๆ ที่จะ จำกัด ปฏิกิริยา multiplex สามารถแสดงทั้งความล่าช้า Cq อย่างมีนัยสำคัญในกรณีของ qPCR หรือการสูญเสียทั้งหมดของผลิตภัณฑ์ PCR โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับเป้าหมายของความอุดมสมบูรณ์ต่ำที่สุด. โทผสมสูตรเฉพาะสำหรับมัลติมีอยู่ในเชิงพาณิชย์ เมื่อผสมต้นแบบโฮมเมดเหมาะสำหรับ singleplex qPCR จะถูกปรับให้เหมาะสมกับปฏิกิริยา multiplex ให้พิจารณาอย่างรอบคอบในการปรับความเข้มข้นของส่วนประกอบเกิดปฏิกิริยา ปฏิกิริยาหลายจะต้องมีอย่างน้อยสองเท่าของโพลิเมอร์มากที่สุดเท่าที่จำนวนเงินขั้นต่ำปรับขนาดก่อนหน้านี้สำหรับ singleplex qPCR นอกจากนี้หาก dNTPs ไม่ได้อยู่ในส่วนเกินสำหรับปฏิกิริยา singleplex เข้มข้น dNTP จะต้องเพิ่มขึ้น จำนวนที่เพิ่มขึ้นของกรดนิวคลีอิกในการตอบสนอง (เช่นจากการเพิ่ม dNTPs เพิ่มเติมเช่นเดียวกับไพรเมอร์ / สอบสวนหรือโดยการสร้างแม่แบบเพิ่มเติม) จะลดลง Mg2 ฟรี + ใช้ได้สำหรับโพลิเมอร์ที่ต้องปรับกับความเข้มข้นของ Mg2 +. อัตราส่วนรองพื้น ถ้ามาตรฐานอัตราส่วน 2: 1 ไพรเมอร์เพื่อแสดงความคิดเห็นสำหรับแต่ละยีนวิเคราะห์ไม่ได้ให้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุดปรับความเข้มข้นของไพรเมอร์ สำหรับเป้าหมายการแสดงสูงใช้อัตราส่วน 1: 1 ไพรเมอร์เพื่อการสอบสวน เพิ่มอัตราส่วนไพรเมอร์เพื่อแสดงความคิดเห็นสำหรับเป้าหมายแสดงในระดับที่ต่ำกว่า ไอดีทีมีตัวเลือกอัตราส่วนที่กำหนดเองไพรเมอร์เพื่อแสดงความคิดเห็นสำหรับPrimeTime® qPCR ตรวจ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การออกแบบการทดลองเพื่อการสื่อสารความซับซ้อนมากขึ้นกว่า qpcr ปฏิกิริยาเดี่ยว การเพิ่มเป้าหมายหลายๆอย่างเดียวจะได้รับอิทธิพลจากปัจจัย ได้แก่ ระดับการแสดงออกของยีนหลักปฏิสัมพันธ์และการแข่งขันสำหรับสารเคมีที่เกิดปฏิกิริยา เพราะฉะนั้น ระมัดระวังและตรวจสอบการออกแบบและการเพิ่มประสิทธิภาพของรองพื้นแบบ

มีความสําคัญตรวจสอบและตรวจสอบสำหรับไพรเมอร์เซอง quence การโต้ตอบ ใช้ฟรีไอดีที oligoanalyzer ®ซอฟต์แวร์ ( www.idtdna . com / scitools ) เพื่อให้แน่ใจว่า ไพรเมอร์ และสอบสวนชุดขาด hairpins และโฮโม - และ heterodimer การโต้ตอบ จากที่นั่น , คุณสามารถเชื่อมโยงโดยตรงกับระเบิดเพิ่มเติม วิเคราะห์ปฏิสัมพันธ์ลำดับเป็นไปได้ เพื่อช่วยให้กับเครื่องมือที่ใช้ระเบิด , เห็นเคล็ดลับสำหรับการใช้ระเบิดเพื่อค้นหา PCR ไพรเมอร์ ,ในไอดีที ถอดรหัส 1.1 เดือนเมษายน 2011 ข่าว .
ใช้ย้อมนักข่าวเฉพาะเพื่อระบุแต่ละเป้าหมาย ระบุสีที่ qpcr ของคุณได้รับการสอบเทียบเครื่องมือ หรือมีความสามารถในการตรวจสอบครั้งเดียวขนาด ผู้ผลิตสามารถให้ความตื่นเต้นและการใช้แสงได้ .เลือกสีที่มีความยาวคลื่นกระตุ้นที่เหมาะสมด้วยเล็กน้อยเพื่อไม่ทับซ้อนกันในการปล่อยสเปกตรัมของตน ( ตารางที่ 1 ข้างต้น ) พิจารณาความเข้มแสงโดยรวมได้เป็นอย่างดี ตัวอย่างเช่น ดูเป็นทางเลือกที่ดีสำหรับการบันทึกคัดลอกสีน้อย เพราะมันมีความเข้มสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ สูง fluorophores กับความเข้มของสัญญาณลดลงแล้วสามารถใช้สำหรับบันทึกมากมายเพิ่มเติมเก็บไว้ในใจที่คุณอาจต้องการที่จะสอบเทียบเครื่องมือของคุณสำหรับการย้อมโดยเฉพาะก่อนการใช้ cross-talk
ลดสัญญาณโดยใช้ probes ที่ดับแล้ว ที่มีประสิทธิภาพสูง , มืด quenchers โดยเฉพาะผู้ที่ใช้ในการรวมกันกับเครื่องดื่มมีอัลกอฮอล์ทุติยภูมิ เช่น เซน™ quencher ( www.idtdna . com / ไพร์มไทม์ ) ได้ประโยชน์จากการเพิ่มปฏิกิริยา multiplexพวกเขามากลดพื้นหลังเรืองแสงนำไปสู่ความไวเพิ่มขึ้น และความหมาย : สัญญาณเช่นเดียวกับก่อนหน้านี้ค่า CQ .
ปรับปฏิกิริยาของแต่ละบุคคล ให้แน่ใจว่า แต่ละคน การทดสอบปฏิกิริยา > 90% ที่มีประสิทธิภาพ ทดสอบโดยใช้ปฏิกิริยาต่อบุคคลแม้ว่าคุณจะใช้วิธีการที่ได้รับการตีพิมพ์ หรือทดสอบในห้องปฏิบัติการอื่น ๆไอดีที dsdna gblocks ™ยีนกระจายตัวและนาน ssdna ultramer ®โอลิโกนิวคลีโอไทด์เหมาะเป็นเป้าหมายสำหรับการศึกษาดังกล่าว .
ตรวจสอบปฏิกิริยา multiplex วิ่งรวมปฏิกิริยาควบคู่ไปกับปฏิกิริยาแต่ละเพื่อให้แน่ใจว่าประสิทธิภาพเทียบเท่า เปรียบเทียบเส้นโค้งมาตรฐาน และตรวจสอบว่า CQ ค่าคล้ายกันตลอดช่วงแบบไดนามิกจะถูกทดสอบในขณะที่เกิดฟลูออเรสเซนต์สัญญาณอาจจะลดลงในมัลติมีปฏิกิริยาเมื่อเทียบกับ singleplex ค่าซีคิวไม่ควรกระทบ ( รูปที่ 2 ด้านบน ) .
ปรับปฏิกิริยา multiplex .
อาจารย์ผสม ผลของจำนวนเป้าหมาย อุดมสมบูรณ์ เป้าหมาย และระยะเวลาในการใช้องค์ประกอบและปฏิกิริยาเป็นปฏิกิริยา multiplex มากขึ้นกว่า singleplex .ถ้ามีปฏิกิริยาส่วนประกอบจำกัด ปฏิกิริยา multiplex สามารถแสดงให้พบ CQ ความล่าช้าในกรณีของ qpcr หรือการสูญเสียรวมของผลิตภัณฑ์ PCR , โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับเป้าหมายสุดมากมาย

อาจารย์ผสมสูตรเฉพาะสำหรับการมัลติเพล็กซ์ที่มีอยู่ในเชิงพาณิชย์ เมื่อผสมมาสเตอร์โฮมเมดเหมาะสำหรับ singleplex qpcr ถูกดัดแปลงสำหรับปฏิกิริยา multiplexให้รอบคอบในการปรับความเข้มข้นขององค์ประกอบปฏิกิริยา การมัลติเพล็กซ์จะต้องมีอย่างน้อยสองครั้งเป็นโดยมากเป็นจำนวนเงินขั้นต่ำที่ก่อนหน้านี้ตลอดเวลาสำหรับ singleplex qpcr . นอกจากนี้ ถ้า dntps ไม่เกินสำหรับ singleplex ปฏิกิริยา , dntp ความเข้มข้นจะต้องเพิ่มขึ้น เพิ่มปริมาณกรดนิวคลีอิกในปฏิกิริยา ( Eกรัม จากการเพิ่ม เพิ่มเติม dntps เช่นเดียวกับไพรเมอร์ / สอบสวน หรือโดยการสร้างแม่แบบมากกว่า ) จะลดฟรี mg2 ใช้ได้สำหรับการต้องปรับให้ mg2 สมาธิ

รองพื้นอัตราส่วน ถ้ามาตรฐานการสอบสวน 2 ไพรเมอร์อัตราส่วนของแต่ละยีนวิเคราะห์ไม่ได้ให้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุด การปรับเพิ่มความเข้มข้น สำหรับขอแสดงเป้าหมาย ใช้ 11 รองพื้นเพื่อตรวจสอบอัตรา เพิ่มสีเพื่อสอบสวนต่อเป้าหมายที่แสดงในระดับที่ต่ำกว่า ไอดีที เสนอเอง ไพรเมอร์เพื่อตรวจสอบตัวเลือกอัตราส่วน primetime ® qpcr ) .