Identi¢cation of proteins binding t

Identi¢cation of proteins binding to sugar moieties of
sulfatide
Biotinylated galactose 3-sulfate probe (Seikagaku Industries
Co., Ltd., Tokyo, Japan) in 100 Wl of PBS was mixed
with 50 Wl of streptavidin agarose gels (ImmunoPure Immobilized
Streptavidin, Pierce) and then incubated for 2 h
at 4³C. After centrifugation, the gel was washed three
times with PBS followed by washing with 20 mmol l31
phosphate bu¡er containing 150 mmol l31 NaCl and
0.01% Triton X-100 (binding bu¡er). The non-labeled
OGP extracts (100 Wl) from intact cells were added to
the gel immobilized biotinylated galactose 3-sulfate probe
and the mixture was incubated for 2 h at 4³C under a
rotating head over tail. The agarose gel was harvested
by centrifugation (10 000Ug, 2 min), washed three times
with the binding bu¡er, and once with PBS. The binding
protein was eluted by heating the agarose gel immobilized
biotinylated galactose 3-sulfate probe in 50 Wl of 2U concentrated
reducing SDS sample bu¡er (100 mM Tris^HCl,
pH 6.8, 4% SDS, 10% glycerol, 0.02% bromophenol blue,
200 mmol l31 dithiothreitol) at 95³C for 5 min. After
centrifugation, the supernatant was subjected to SDS^
PAGE analysis using 10% acrylamide gel [18]. For N-terminal
sequence analysis, the proteins on the gel were
transferred to a polyvinylidene di£uoride membrane followed
by staining with Coomassie brilliant blue. The target
band was excised and subjected to an Applied Biosystems
491 gas phase sequencer (PE Applied Biosystems

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Identi cation หมายของผูกกับชูการ์ moieties ของโปรตีนsulfatideกาแล็กโทสซัลเฟต 3 โพรบ Biotinylated (อุตสาหกรรม SeikagakuCo., Ltd. โตเกียว ญี่ปุ่น) ใน 100 Wl PBS ถูกผสมกับ 50 Wl ของ streptavidin agarose เจ (ImmunoPure หาStreptavidin เพียร์ซ) แล้ว incubated สำหรับ 2 hที่ซี 4³ หลังจาก centrifugation เจถูกล้างสามครั้งกับ PBS ตามล้างกับ 20 mmol l31bu¡er ฟอสเฟตประกอบด้วย 150 mmol l31 NaCl และ0.01% ไตรตั้น X-100 (ผูก bu¡er) ไม่ใช่ป้ายสารสกัดจาก OGP (100 Wl) จากเซลล์เหมือนเดิมถูกเพิ่มเข้าไปเจ biotinylated เอนไซม์กาแล็กโทสซัลเฟต 3 โพรบและส่วนผสมที่ incubated สำหรับ 2 h ที่ 4³C ภายใต้ความหมุนหัวไปหาง เจ agarose ถูกเก็บเกี่ยวโดย centrifugation (10 000Ug, 2 นาที), ล้าง 3 ครั้งรวม bu¡er และครั้งเดียวกับ PBS การรวมโปรตีนถูก eluted โดยความร้อนเจ agarose หาเข้มข้นของโพรบ biotinylated กาแล็กโทสซัลเฟต 3 ใน 50 ส่งคลุม 2Uลด SDS อย่าง bu¡er (100 มม.ทริสเรทติ้ง ^ HClpH 6.8, SDS 4%, 10% กลีเซอร สีฟ้า bromophenol 0.02%200 mmol l31 dithiothreitol) ที่ 95³ C สำหรับ 5 นาทีหลังจากcentrifugation, supernatant ถูกยัดเยียดให้ SDS ^วิเคราะห์หน้าที่ใช้ 10% อะคริลาไมด์เจล [18] สำหรับเทอร์มินัล Nวิเคราะห์ โปรตีนบนเจได้โอนย้ายไป polyvinylidene di£ uoride เมมเบรนตามโดยการย้อมสีด้วยสีฟ้าสดใส Coomassie เป้าหมายวง excised และต้องการ Biosystems ใช้sequencer ระยะก๊าซ 491 (PE ใช้ Biosystems

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

identi ¢ประจุของโปรตีนจับกับโมเลกุลน้ำตาลกาแลคโตส

sulfatide ของไล 3-sulfate โพรบ ( seikagaku อุตสาหกรรม
Co . , Ltd . , โตเกียว , ญี่ปุ่น ) 100 WL ของ PBS ผสม
กับ 50 WL ของ streptavidin โรสเจล ( immunopure ตรึง
streptavidin แทง ) แล้วบ่ม 2 H
ที่ 4 หลังจาก³ C ปั่น , เจลล้างสามครั้งกับ PBS ตามด้วย

l31 ซัก 20 มิลลิโมลฟอสเฟตบู¡ ER ที่มี 150 มิลลิโมล l31 โซเดียมคลอไรด์และ
0.01 % Triton X-100 ( ผูกบู¡เอ้อ ) ไม่ติดป้าย
ogp สกัด ( 100 ชุด ) จากของเซลล์ที่ถูกตรึง 3-sulfate เจลไล

และกาแลคโตสเครื่องผสมบ่ม 2 ชั่วโมง 4 ³ C ภายใต้
หมุนหัวหาง ส่วนเจลเก็บเกี่ยว
โดยการเหวี่ยงแยก ( 10 000ug 2 นาที ) , ล้างสามครั้ง
กับการบู¡เอ้อ และอีกครั้งกับ PBS โปรตีนผูกพัน
คือตัวอย่างโดยร้อนเจลไล 3-sulfate ตรึง
กาแลคโตสตรวจ 50 WL 2U เข้มข้น
ลด SDS ตัวอย่างบู¡ ER ( 100 มม. สำหรับ

HCl , pH 6.8 , 4 % SDS , 10% กลีเซอรอล , 0.02 % โบรโมฟีนอลสีฟ้า
200 มิลลิโมล l31 บัตรแข็ง ) 95 ³ c 5 นาทีหลังจาก
3 , นำภายใต้ SDS

การวิเคราะห์หน้าโดยใช้ 10% อะคริลาไมด์เจล [ 18 ] การวิเคราะห์ลำดับของกรดอะมิโนโปรตีนบนเจล

โอนไปเป็นีน di ง uoride เยื่อตาม
โดยการศึกษาเหล่านี้น่าจะเป็นสดใสสีฟ้า วงเป้าหมาย
ถูกตัดและภายใต้การประยุกต์ Biosystems
491 ก๊าซระยะซีเควน ( PE Applied Biosystems