MATERIALS AND METHODSImagingImages

MATERIALS AND METHODS
Imaging

Images were captured on an Epson GT-X820 A4 scanner with the supplied software without image enhancement and saved as TIFF (tagged image file format) files. Seeds are spread uniformly on the glass (Supplemental Fig. S3, A–D), scanned at 600 dpi (23.6 mm−1; Fig. 1A), and removed. This takes only a few minutes, allowing us to process several hundred batches of seeds in a day.

Software Implementation

SmartGrain has been written in Visual C++ in the Microsoft Visual Studio 2010 software creation tool and runs under Microsoft Windows XP, Vista, and 7. The Open Computer Vision Library (OpenCV; http://sourceforge.net/projects/opencvlibrary/) is used for image input and output and some imaging processes (median filtering, morphological operations, finding perimeters, and calculating AS and PL). SmartGrain is free for academic purposes (Supplemental Program S1 and Supplemental Data Set S1).

Plant Materials

To perform QTL analyses for seed shape, we tested 127 cv Koshihikari/Nipponbare BILs (Matsubara et al., 2008) bred with cv Koshihikari as the recurrent parent. We also used three CSSLs (Hori et al., 2010) with cv Nipponbare chromosome segments on chromosome 11 in a cv Koshihikari background to verify the allelic effects of the QTL detected.

Measurement of Rice Seeds

We measured at least 58 grains per BIL, and more than 200 grains per plant of parents and CSSLs (five plants each), and used mean values of each seed parameter in the QTL analyses. Thousand-grain weight was measured on a gauge.

QTL Analyses and DNA Markers

We genotyped the BILs for 150 simple sequence repeat markers and 647 SNP markers from the Rice Genome Resource Center at NIAS (http://www.rgrc.dna.affrc.go.jp/index.html.en; Matsubara et al., 2008; Hori et al., 2012).

A linkage map was constructed in MAPMAKER/EXP 3.0 software (Lander et al., 1987), and the Kosambi mapping function was used to calculate genetic distances (in centimorgans). The genotypes of residual heterozygous regions in the BILs were treated as missing data. QTL analyses were performed by composite interval mapping (Zeng, 1993, 1994), as implemented by the Zmapqtl module (model 6) provided by version 2.5 of the QTL Cartographer software (http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm; Basten et al., 2005). Genome-wide threshold values (α = 0.05) were used to detect putative QTLs based on the results of 1,000 permutations (Churchill and Doerge, 1994).

We used a PCR-based SNP marker, SNP3403, to differentiate cv Koshihikari and Nipponbare (Yamamoto et al., 2010). The forward primers for the detection of the cv Nipponbare allele (5′-TAATTTTTCGGCCCATCAATCGT-3′) and the cv Koshihikari allele (5′-TTTTTCGGCCCATCAATCGC-3′) and the common reverse primer (5′-TGTTGCACCATTTCTTTTTCC-3′) were constructed by Rizo.

Supplemental Data

The following materials are available in the online version of this article.

Supplemental Figure S1. Log-likelihood (top) and additive-effect plots (bottom) across the 12 rice chromosomes from the QTL analyses for seed shape parameters of cv Koshihikari/Nipponbare BILs.
Supplemental Figure S2. L, as measured by caliper, of recurrent parent (cv Koshihikari) and three CSSLs (SL635, SL636, and SL637) with a cv Nipponbare segment of chromosome 11 in the cv Koshihikari background.
Supplemental Figure S3. Scanning of seeds on a desktop scanner.
Supplemental Program S1. SmartGrain software program.
Supplemental Data Set S1. Test data set for SmartGrain software program.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิธีการและวัสดุ
ภาพ

ภาพถูกจับบนสแกนเนอร์ Epson GT - X 820 A4 การกับซอฟต์แวร์โดยเพิ่มประสิทธิภาพของภาพ และบันทึกเป็นแฟ้ม TIFF (ติดแท็กรูปแฟ้มรูปแบบ) เมล็ดจะกระจายสม่ำเสมอเมื่อเทียบเคียงบนกระจก (ฟิกเพิ่มเติม S3, A – D), การสแกนที่ 600 dpi (23.6 mm−1 Fig. 1A), และลบออก นี้ใช้เวลาเพียงไม่กี่นาที ทำให้เราสามารถประมวลผลชุดหลายร้อยของเมล็ดพันธุ์ในวัน.

ใช้งานซอฟต์แวร์

SmartGrain ถูกเขียนใน Visual C ในเครื่องมือการสร้างซอฟต์แวร์ Microsoft Visual Studio 2010 และทำงานภายใต้การ Microsoft Windows XP, Vista และ 7 เปิดคอมพิวเตอร์วิชั่นรี (OpenCV; http://sourceforgeสุทธิ/โครงการ/opencvlibrary /) ใช้สำหรับป้อนข้อมูล และแสดงผลรูปภาพและกระบวนการบางอย่างเกี่ยวกับภาพ (มัธยฐานการกรอง การดำเนินงานของ ขอบ เขตการค้นหา และคำนวณเป็น และ PL) SmartGrain เป็นฟรีสำหรับวัตถุประสงค์ทางวิชาการ (เพิ่มเติมโปรแกรม S1 และ S1 ชุดข้อมูลเพิ่มเติม) .

วัสดุโรงงาน

ทำ QTL วิเคราะห์สำหรับรูปร่างเมล็ด เราทดสอบ 127 cv Koshihikari/Nipponbare BILs (บาระ et al., 2008) bred กับ cv Koshihikari เป็นหลักการเกิดซ้ำ เราใช้ CSSLs สาม (Hori et al., 2010) กับ cv Nipponbare โครโมโซมส่วนบนโครโมโซม 11 ใน cv เป็นพื้นหลัง Koshihikari เพื่อตรวจสอบผล allelic QTL พบ

วัดเมล็ดข้าว

เราวัดน้อย 58 ธัญพืชต่อบิล และมากกว่า 200 เกรนต่อโรงงานของพ่อแม่ และ CSSLs (ห้าพืชแต่ละ), และใช้ค่าเฉลี่ยของพารามิเตอร์แต่ละเมล็ดในวิเคราะห์ QTL น้ำหนักเมล็ดพันที่วัดบนเป็นวัด

QTL วิเคราะห์และดีเอ็นเอเครื่องหมาย

เรา BILs สำหรับ 150 ลำดับซ้ำเครื่องหมายและเครื่องหมาย SNP 647 จากศูนย์ทรัพยากรกลุ่มข้าวที่ NIAS (http://www.rgrc.dna.affrc.go.jp/index.html.en; genotyped Al. บาระร้อยเอ็ด 2008 Hori et al., 2012) .

แผนที่เชื่อมโยงถูกสร้างใน MAPMAKER/EXP 3.0 ซอฟต์แวร์ (Lander et al., 1987), และฟังก์ชันแมปโกสัมพีถูกใช้ในการคำนวณระยะทางพันธุกรรม (ใน centimorgans) ศึกษาจีโนไทป์ของภูมิภาคเหลือ heterozygous ใน BILs ถูกถือว่าเป็นข้อมูลที่ขาดหายไป QTL วิเคราะห์ดำเนิน โดยช่วงที่แมป (เซนเซง 1993, 1994), คอมโพสิต ที่ดำเนินการ โดย Zmapqtl โม (รุ่น 6) โดยเวอร์ชัน 2.5 ของซอฟแวร์ QTL Cartographer (http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm; Basten et al., 2005) ค่าขีดจำกัดทั้งจีโนม (α = 0.05) ใช้ตรวจหา QTLs putative ตามผลลัพธ์ของสับ 1000 (เคิร์ดโซว์และ Doerge, 1994)

เราใช้เครื่อง PCR โดย SNP หมาย SNP3403 เพื่อแบ่งแยกประวัติ Koshihikari และ Nipponbare (ยามาโมโตะ et al., 2010) ไพรเมอร์ไปข้างหน้าตรวจประวัติ allele Nipponbare (5′ TAATTTTTCGGCCCATCAATCGT 3′) และประวัติ allele Koshihikari (5′-TTTTTCGGCCCATCAATCGC-3′) และรองพื้นกลับทั่วไป (5′ TGTTGCACCATTTCTTTTTCC 3′) ถูกสร้าง โดย Rizo

ข้อมูลเพิ่มเติม

วัสดุต่อไปนี้จะพร้อมใช้งานในรุ่นออนไลน์ของบทความนี้

S1 รูปเพิ่มเติม ล็อกโอกาส (บน) และผลบวกลงจุด (ด้านล่าง) ระหว่าง chromosomes ข้าว 12 จากวิเคราะห์ QTL สำหรับพารามิเตอร์รูปร่างเมล็ดของ cv BILs Koshihikari/Nipponbare.
S2 รูปเพิ่มเติม L วัดจากปั้ม แม่เกิดซ้ำ (cv Koshihikari) และสาม CSSLs (SL635, SL636 และ SL637) กับ cv เป็น Nipponbare ส่วนของโครโมโซม 11 ใน cv Koshihikari พื้นหลัง.
S3 รูปเพิ่มเติม การสแกนของเมล็ดบนแบบตั้งโต๊ะสแกนเนอร์
S1 โปรแกรมเพิ่มเติม โปรแกรมซอฟต์แวร์ SmartGrain.
S1 ชุดข้อมูลเพิ่มเติม ทดสอบโปรแกรม SmartGrain กำหนด

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการ
ถ่ายภาพภาพที่ถูกจับในสแกนเนอร์ของเอปสัน GT-X820 A4 กับซอฟต์แวร์ที่ให้มาโดยไม่ต้องเพิ่มประสิทธิภาพของภาพและบันทึกเป็น TIFF (รูปแบบไฟล์ภาพที่ติดแท็ก) ไฟล์ เมล็ดจะกระจายอย่างสม่ำเสมอบนกระจก (เพิ่มเติมรูป S3,-D). สแกนที่ 600 dpi (23.6 มม. 1; 1A รูป) และลบออก นี้จะใช้เวลาเพียงไม่กี่นาทีทำให้เราสามารถดำเนินการหลายร้อยกระบวนการของเมล็ดพันธุ์ในวันที่การดำเนินงานซอฟท์แวSmartGrain ได้รับการเขียนใน c ++ ใน Microsoft Visual Studio 2010 เครื่องมือสร้างซอฟแวร์และการทำงานภายใต้ Microsoft Windows XP, Vista, และ 7 เปิดวิสัยทัศน์คอมพิวเตอร์ห้องสมุด (OpenCV; http://sourceforge.net/projects/opencvlibrary/) ถูกนำมาใช้สำหรับการป้อนข้อมูลภาพและการส่งออกและบางกระบวนการถ่ายภาพ (การกรองแบ่งการดำเนินงานก้านหาปริมณฑลและคำนวณ AS และ PL) SmartGrain เป็นบริการฟรีสำหรับวัตถุประสงค์ทางวิชาการ (เพิ่มเติมโปรแกรม S1 และเพิ่มเติมข้อมูลชุด S1) วัสดุพืชในการปฏิบัติ QTL วิเคราะห์สำหรับรูปร่างเมล็ดเราทดสอบ 127 พันธุ์ Koshihikari / Nipponbare Bils (Matsubara et al., 2008) พันธุ์กับพันธุ์ Koshihikari เป็นกำเริบ ผู้ปกครอง นอกจากนี้เรายังใช้สาม CSSLs (Hori et al., 2010) ด้วยส่วนพันธุ์ Nipponbare โครโมโซมบนโครโมโซม 11 พันธุ์พื้นหลัง Koshihikari เพื่อตรวจสอบผลกระทบ allelic ของ QTL ที่ตรวจพบการวัดของเมล็ดพันธุ์ข้าวเราวัดอย่างน้อย 58 เมล็ดต่อ BIL และ กว่า 200 เมล็ดต่อโรงงานของพ่อแม่และ CSSLs (ห้าพืชแต่ละ) และใช้ค่าเฉลี่ยของพารามิเตอร์แต่ละเมล็ดในการวิเคราะห์ QTL น้ำหนักพันเม็ดวัดที่วัดการวิเคราะห์ QTL และเครื่องหมายดีเอ็นเอเรา genotyped Bils 150 เครื่องหมายทำซ้ำลำดับที่ง่ายและ 647 เครื่องหมาย SNP จากศูนย์ทรัพยากรจีโนมข้าวที่ Nias (http: //www.rgrc.dna.affrc go.jp/index.html.en; Matsubara et al, 2008.. Hori, et al, 2012) แผนที่การเชื่อมโยงที่ถูกสร้างขึ้นใน mapmaker / ซอฟแวร์ EXP 3.0 (Lander, et al, 1987) และฟังก์ชั่นการทำแผนที่ Kosambi. ถูกนำมาใช้ในการคำนวณระยะทางพันธุกรรม (ใน centimorgans) ยีนของภูมิภาค heterozygous ตกค้างใน Bils ได้รับการรักษาเป็นข้อมูลที่ขาดหายไป การวิเคราะห์ QTL ได้ดำเนินการโดยการทำแผนที่ช่วงประกอบ (Zeng, 1993, 1994) ในขณะที่ดำเนินการโดยโมดูล Zmapqtl (รุ่นที่ 6) โดยรุ่น 2.5 ของซอฟต์แวร์ QTL Cartographer (http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart HTM. เท่ et al, 2005) ค่าเกณฑ์จีโนมทั้ง (α = 0.05) ถูกนำมาใช้ในการตรวจสอบ QTLs สมมุติขึ้นอยู่กับผลของการเพิ่มเงิน 1,000 (เชอร์ชิลและ Doerge, 1994) เราใช้วิธี PCR-based SNP เครื่องหมาย SNP3403 เพื่อแยกความแตกต่างพันธุ์ Koshihikari และ Nipponbare (ยามาโมโต et al., 2010) ไพรเมอร์ไปข้างหน้าสำหรับการตรวจสอบพันธุ์ Nipponbare อัลลีล (5'-TAATTTTTCGGCCCATCAATCGT-3 ') และพันธุ์ Koshihikari อัลลีล (5'-TTTTTCGGCCCATCAATCGC-3) และไพรเมอร์ที่กลับกัน (5'-TGTTGCACCATTTCTTTTTCC-3') ถูกสร้างขึ้น โดย Rizo เปิดเผยข้อมูลต่อไปนี้วัสดุที่มีอยู่ในเวอร์ชั่นออนไลน์ของบทความนี้เพิ่มเติมเต็มตัว S1 เข้าสู่ระบบความน่าจะเป็น (บน) และแปลงสารผลกระทบ (ด้านล่าง) ข้ามโครโมโซมข้าว 12 จาก QTL วิเคราะห์สำหรับพารามิเตอร์รูปร่างเมล็ดพันธุ์ Koshihikari / Nipponbare Bils เพิ่มเติมเต็มตัว S2 L ที่วัดจากคาลิปเปอร์ของผู้ปกครองกำเริบ (พันธุ์ Koshihikari) และสาม CSSLs (SL635, SL636 และ SL637) กับพันธุ์ส่วน Nipponbare ของโครโมโซมที่ 11 ในพันธุ์พื้นหลัง Koshihikari เพิ่มเติมเต็มตัว S3 การสแกนของเมล็ดบนเครื่องสแกนสก์ท็อปโปรแกรมเสริม S1 โปรแกรมซอฟต์แวร์ SmartGrain เพิ่มเติมข้อมูลชุด S1 การทดสอบชุดข้อมูลสำหรับโปรแกรมซอฟต์แวร์ SmartGrain

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการถ่ายภาพ


รูปที่ถูกจับใน gt-x820 A4 สแกนเนอร์ Epson กับการเพิ่มประสิทธิภาพของภาพและช่วยให้ซอฟต์แวร์โดยไม่เป็น TIFF ( Tagged Image File Format ) ไฟล์ เมล็ดจะถูกกระจายอย่างสม่ำเสมอบนกระจก ( เพิ่มเติมรูป s3 A ( D ) , สแกนที่ 600 dpi ( 23.6 มม. − 1 ; รูปที่ 1A ) , และลบออก นี้จะใช้เวลาเพียงไม่กี่นาทีให้เราดำเนินการหลายร้อยชุดของเมล็ดในวัน



smartgrain การติดตั้งซอฟต์แวร์ที่ถูกเขียนใน Visual C ใน Microsoft Visual Studio 2010 ซอฟต์แวร์สร้างเครื่องมือและทำงานภายใต้ Microsoft Windows XP , Vista และ 7 เปิดห้องสมุดคอมพิวเตอร์วิสัยทัศน์ ( เป็นการ ; http : / / sourceforge .สุทธิ / โครงการ / opencvlibrary / ) ใช้สำหรับใส่ภาพและผลผลิต และบางภาพกระบวนการ ( ค่ามัธยฐานกรองโดยการค้นหาปริมณฑล และคิดเป็นและ PL ) smartgrain ฟรีเพื่อการศึกษา ( โปรแกรมเสริม และเพิ่มเติมชุดข้อมูล S1 S1 ) .



วัสดุพืชแสดงการวิเคราะห์ QTL สำหรับรูปร่างเมล็ดเราทดสอบ 127 CV โคชิฮิคาริ / nipponbare bils ( บาระ et al . , 2008 ) พันธุ์กับพันธุ์โคชิฮิคาริเป็นหลักร่วมกัน เรายังใช้สาม cssls ( โฮริ et al . , 2010 ) และ nipponbare โครโมโซมกลุ่มบนโครโมโซมคู่ที่ 11 ในพันธุ์โคชิฮิคาริ พื้นหลังเพื่อตรวจสอบผลของยาฆ่าแมลง QTL พบ

วัดข้าวเมล็ด

เราวัดอย่างน้อย 58 เม็ดต่อบิล ,และกว่า 200 เม็ดต่อพืชของผู้ปกครองและ cssls ( ห้าพืชแต่ละ ) , และใช้ค่าเฉลี่ยของแต่ละเมล็ดพารามิเตอร์ในการวิเคราะห์ความ . น้ำหนักเมล็ดพันวัดในวัด

ความวิเคราะห์และเครื่องหมายดีเอ็นเอ

เรา genotyped ที่ bils 150 ง่ายเครื่องหมายเครื่องหมาย SNP และลำดับซ้ำแต่จากศูนย์ทรัพยากรพันธุกรรมข้าวที่ Nias ( http://www.rgrc.dna.affrc.go.jp/index.html.en ;มัตสึบาระ et al . , 2008 ; โฮริ et al . , 2012 ) .

การเชื่อมโยงแผนที่คือ สร้างคนสร้างแผนที่มา / EXP 3.0 ซอฟต์แวร์ ( Lander et al . , 1987 ) และฟังก์ชันที่ใช้ในการคำนวณโกสัมพีการทำแผนที่ทางพันธุกรรม ( ใน centimorgans ) การเปรียบเทียบคุณสมบัติการสร้างภูมิภาคใน bils ได้ถือว่าเป็นข้อมูลที่ขาดหายไป การวิเคราะห์ QTL แผนที่ได้แบบคอมโพสิต ( เซง , 1993 , 1994 )ที่ดำเนินการโดย zmapqtl โมดูล ( รุ่นที่ 6 ) โดยเวอร์ชัน 2.5 ของ QTL แผนซอฟต์แวร์ ( http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/wqtlcart.htm ; เบสเติ้น et al . , 2005 ) จีโนมกว้างค่าเกณฑ์ ( α = 0.05 ) ถูกใช้เพื่อตรวจสอบการแสดงออกของยีนจากผล 1000 วิธีเรียงสับเปลี่ยน ( เชอร์ชิลล์และ doerge , 1994 ) .

เราใช้ PCR SNP snp3403 เครื่องหมาย , ตาม ,ความแตกต่างของโคชิฮิการิ CV และ nipponbare ( Yamamoto et al . , 2010 ) ไพรเมอร์ไปข้างหน้าเพื่อตรวจหา CV nipponbare อัลลีล ( 5 ’ - ’ taatttttcggcccatcaatcgt-3 ) และพันธุ์โคชิฮิการิอัลลีล ( 5 ’ - ’ ttttt cggcccatcaatcgc-3 ) และร่วมกันย้อนกลับ ไพรเมอร์ ( 5 ’ - ’ tgttgcaccatttctttttcc-3 ) ถูกสร้างโดย ริโซ



เพิ่มเติมข้อมูลวัสดุต่อไปนี้มีอยู่ในรุ่นออนไลน์ของบทความนี้

เพิ่มเติมรูป S1 . โอกาสเข้าสู่ระบบ ( ด้านบน ) และปฏิกิริยาผลบวกแปลง ( ล่าง ) ทั้ง 12 โครโมโซมจากการวิเคราะห์ QTL ข้าวเมล็ดพันธุ์โคชิฮิคาริ / nipponbare รูปร่างพารามิเตอร์ bils .
เพิ่มเติมรูป S2 . ฉันเป็นวัดโดย Caliper ของพ่อแม่พันธุ์โคชิฮิการิกำเริบ ) และสาม cssls ( sl635 sl636 , ,และ sl637 ) กับพันธุ์ nipponbare ส่วนของโครโมโซมคู่ที่ 11 ใน CV โคชิฮิคาริ พื้นหลัง รูป S3
เสริม การสแกนของเมล็ดบนเดสก์ทอปสแกนเนอร์ .
โปรแกรมเสริม S1 . โปรแกรมซอฟต์แวร์ smartgrain .
ข้อมูลเพิ่มเติมชุด S1 . ทดสอบชุดข้อมูลสำหรับโปรแกรมซอฟต์แวร์ smartgrain .