PCR amplification of extracted DNAP

PCR amplification of extracted DNA
PCR reaction was performed to determine the existence of inhibitor and interference during the
DNA extraction process by amplification of 16S rRNA gene and pheSgene. The PCR amplification of
16S rRNA gene (1,500 bp) was performed with universal eubacteria primers designed by Giovannoni
(1991) [5]. Eub B; 5´-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3´was used as a forward primer and Eub A;
5´-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3´ was used as a reverse primer (Science Pacific Co. Ltd.). The
PCR amplification of pheS gene (723 bp) was performed with 5´- GATTAAGGAGTAGTGGCACG
-3´ as a forward primer and 5-´ TTGAGATCGCCCATTGAAAT -3´ as a reverse primer (Science
Pacific Co. Ltd.). These primers have been designed by Jones et al. (2003) [6]. Each reaction mixture
contained of DNA template of DNA sample either from LiOAc-SDS lysis method or lysozyme/SDS/
Proteinase K method, 1.25 U Taq DNA polymerase enzyme (FERMENTAS®
, Canada), 1X PCR buffer
(FERMENTAS®
, Canada), 3 mM MgCl2
(FERMENTAS®
, Canada), 0.2 mM of each dNTPs and 0.1 mM
of each primers. The PCR reaction was carried out using DNA Engine PTC-200 thermal cycle (BIORAD,
USA). The cycling conditions initialed denaturation at 94ºC for 4 min, followed by 40 cycles of
denaturation at 94ºC for 30 s, primer annealing at 55ºC for 45 s and extension at 72ºC for 1 min. After
amplification, PCR products were electrophoresed with the constant voltage of 90 voltages, 400 mA by
1.5% agarose gel, then stained with ethidium bromide and determined under UV light.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ขยาย PCR ของดีเอ็นเอที่แยกปฏิกิริยา PCR เพื่อตรวจสอบการมีอยู่ของผลและมีการรบกวนในระหว่างดำเนินการกระบวนการสกัดดีเอ็นเอ โดยการขยายยีน 16S rRNA และ pheSgene ขยาย PCR ของยีน 16S rRNA (1500 bp) ทำกับไพรเมอร์ eubacteria สากลออกแบบ โดย Giovannoni(1991) [5] Eub B 5´-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3´was ใช้เป็นรองพื้นไปข้างหน้าและ Eub A5´-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3´ ใช้เป็นแนวทางสำหรับการย้อนกลับ (วิทยาศาสตร์แปซิฟิก จำกัด) ที่ขยาย PCR ของยีน pheS (723 bp) ทำกับ 5´-GATTAAGGAGTAGTGGCACG-3´ เป็นรองพื้นไปข้างหน้าและ 5 ´ TTGAGATCGCCCATTGAAAT-3´ เป็นแนวทางสำหรับการย้อนกลับ (วิทยาศาสตร์แปซิฟิก จำกัด) ไพรเมอร์เหล่านี้ได้ถูกออกแบบโดย Jones et al. (2003) [6] ส่วนผสมแต่ละปฏิกิริยาประกอบด้วยแม่แบบดีเอ็นเอของดีเอ็นเอตัวอย่างได้ จากวิธีการ lysis LiOAc SDS หรือ lysozyme/องค์กร /วิธี proteinase K เอนไซม์ 1.25 U Taq DNA พอลิเมอเรส (FERMENTAS ®แคนาดา), 1 X PCR บัฟเฟอร์(FERMENTAS ®แคนาดา), MgCl2 3 มม.(FERMENTAS ®แคนาดา), 0.2 mM ของ dNTPs ละและ 0.1 มม.ของไพรเมอร์แต่ละ ปฏิกิริยา PCR ถูกดำเนินการโดยใช้ดีเอ็นเอเครื่อง PTC-200 รอบความร้อน (BIORADสหรัฐอเมริกา) การขี่จักรยานสภาพ initialed denaturation ที่ 94ºC สำหรับ 4 นาที ตาม ด้วยรอบ 40 ของdenaturation ที่ 94ºC สำหรับ 30 s การอบเหนียวที่ 55ºC s 45 และ 72ºC ใน 1 นาทีหลังจากสีรองพื้นขยาย ผลิตภัณฑ์ PCR ได้ electrophoresed ด้วยแรงดันคงที่ของแรงดัน 90, 400 mA โดย1.5% agarose เจล สีกับโบรไมด์ ethidium แล้ว และกำหนดภายใต้แสง UV

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ขยาย PCR
ของการสกัดดีเอ็นเอปฏิกิริยาPCR
ได้ดำเนินการเพื่อตรวจสอบการดำรงอยู่ของยับยั้งและการรบกวนในระหว่างขั้นตอนการสกัดดีเอ็นเอจากการขยายของ16S rRNA ของยีนและ pheSgene ขยาย PCR ของ
rRNA ยีน 16S (1,500 bp) ได้ดำเนินการกับไพรเมอร์ Eubacteria สากลออกแบบโดย Giovannoni
(1991) [5] EUB B; 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'was ใช้เป็นไพรเมอร์ไปข้างหน้าและ EUB;
5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3'-ใช้เป็นไพรเมอร์กลับ (วิทยาศาสตร์แปซิฟิก จำกัด )
ขยาย PCR ของยีน pheS (723 bp) ได้ดำเนินการกับ 5'- GATTAAGGAGTAGTGGCACG
-3' เป็นไพรเมอร์ไปข้างหน้าและ 5 'TTGAGATCGCCCATTGAAAT -3' เป็นไพรเมอร์กลับ
(วิทยาศาสตร์แปซิฟิกจำกัด ) ไพรเมอร์เหล่านี้ได้รับการออกแบบโดยโจนส์และอัล (2003) [6] ผสมปฏิกิริยาแต่ละคนที่มีแม่แบบดีเอ็นเอของตัวอย่างดีเอ็นเอทั้งจาก LiOAc SDS-วิธีการสลายหรือไลโซไซม์ / SDS / โปรวิธี K, 1.25 U Taq เอนไซม์ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ (FERMENTAS®, แคนาดา) บัฟเฟอร์ 1X PCR (FERMENTAS®, แคนาดา) 3 มิลลิ MgCl2 (FERMENTAS®, แคนาดา) 0.2 มิลลิ dNTPs ของแต่ละคนและ 0.1 มิลลิของไพรเมอร์ในแต่ละ ปฏิกิริยา PCR ได้รับการดำเนินการโดยใช้ดีเอ็นเอเครื่องยนต์ PTC-200 วงจรความร้อน (Biorad, สหรัฐอเมริกา) ขี่จักรยานเงื่อนไข initialed denaturation ที่94ºC 4 นาทีตามด้วย 40 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่94ºC 30 วินาที, หลอมไพรเมอร์ที่55ºC 45 และส่วนขยายที่72ºCเป็นเวลา 1 นาที หลังจากที่ขยายผลิตภัณฑ์ PCR ถูก electrophoresed กับแรงดันคงที่ 90 แรงดันไฟฟ้า 400 มิลลิแอมป์โดย 1.5% agarose เจล, สีแล้วด้วย ethidium bromide และความมุ่งมั่นภายใต้แสงยูวี