2.8. Western blot analysis
Cells in each group were lysed with RIPA lysis buffer for extracting cell total protein
The lysates were centrifuged at 12,000 g for 10 min at
Then the supernatants were assayed for protein concentration using the BCA method
After solubilized in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels (SDS-PAGE) sample buffer and heated in boiling water for 10 min, 100 μg protein was separated on 10% SDS-PAGE
and transferred onto nitrocellulose (NC) membranes
Then the membranes
were blocked with 5% skimmed milk powder in TBST for 1 h
followed by incubation with primary antibodies (ACC, FAS, AMPK, pAMPK, CPT-1,mTOR, TSC1, LC3II) for 2 h at room temperature and overnight at 4 1C. Wash the membranes with PBST three times for 10 min each and incubate the membranes with horseradish peroxidase (HRP) conjugated secondary antibodies
2.8 วิเคราะห์น้าแบบตะวันตกเซลล์ในแต่ละกลุ่มได้นาทีที่ 37uc กับป้า lysis บัฟเฟอร์สำหรับการแยกโปรตีนทั้งหมดของเซลล์ Lysates ได้จากที่ 12,000 g 10 นาทีที่แล้ว supernatants ถูก assayed สำหรับความเข้มข้นของโปรตีนโดยวิธี BCA หลังจาก solubilized ในบัฟเฟอร์ตัวอย่างการตรวจสอบวิเคราะห์เจ (SDS-หน้า) โซเดียม dodecyl ซัลเฟต และอุ่นในน้ำ 10 นาทีเดือด 100 μโปรตีนแบ่งออก 10% SDS-หน้า และโอนย้ายบนเยื่อไนโตรเซลลูโลส (NC)จากนั้นเยื่อหุ้มได้ถูกบล็อก ด้วยผงนมขาดมันเนย 5% ใน TBST สำหรับ 1 h ตาม ด้วยการบ่มกับแอนติบอดีหลัก (ACC, FAS, AMPK, pAMPK, CPT-1, mTOR, TSC1, LC3II) สำหรับ 2 ชม. ที่อุณหภูมิห้อง และพักค้างคืน ที่ 4 1C. ล้างเยื่อกับ PBST สามครั้งสำหรับ 10 นาที และฟักเยื่อกับแอนติบอดีรองฮอส (HRP) ผันเด็ด ๆ
การแปล กรุณารอสักครู่..
2.8 เวสเทิร์วิเคราะห์ blot
เซลล์ในแต่ละกลุ่มถูก lysed กับ RIPA lysis บัฟเฟอร์สำหรับการสกัดโปรตีนเซลล์รวม
lysates ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 กรัมเป็นเวลา 10 นาทีที่
แล้ว supernatants ถูก assayed สำหรับความเข้มข้นของโปรตีนโดยใช้วิธีการเก็บกวาด
หลังจากละลายโซเดียมเจลโดเดซิลซัลเฟตอะคริเลต ( ระบบ SDS-PAGE) บัฟเฟอร์ตัวอย่างและให้ความร้อนในน้ำเดือด 10 นาที 100 โปรตีนไมโครกรัมถูกแยกออกมาเมื่อวันที่ 10% SDS-PAGE
และโอนไปยัง nitrocellulose (NC) เยื่อ
แล้วเยื่อ
ถูกบล็อก 5% ผงนมไขมันต่ำใน TBST เป็นเวลา 1 ชั่วโมง
ตามด้วยการบ่มกับแอนติบอดีปฐมภูมิ (ACC, FAS, AMPK, pAMPK, CPT-1 mTOR, TSC1, LC3II) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องและค้างคืนที่ 4 1C ล้างเยื่อด้วย PBST สามครั้งเป็นเวลา 10 นาทีในแต่ละครั้งและฟักไข่เยื่อกับมะรุม peroxidase (HRP) แอนติบอดีรองผัน
การแปล กรุณารอสักครู่..