2.8. Western blot analysisCells in

2.8. Western blot analysis
Cells in each group were lysed with RIPA lysis buffer for extracting cell total protein
The lysates were centrifuged at 12,000 g for 10 min at
Then the supernatants were assayed for protein concentration using the BCA method
After solubilized in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels (SDS-PAGE) sample buffer and heated in boiling water for 10 min, 100 μg protein was separated on 10% SDS-PAGE
and transferred onto nitrocellulose (NC) membranes
Then the membranes
were blocked with 5% skimmed milk powder in TBST for 1 h
followed by incubation with primary antibodies (ACC, FAS, AMPK, pAMPK, CPT-1,mTOR, TSC1, LC3II) for 2 h at room temperature and overnight at 4 1C. Wash the membranes with PBST three times for 10 min each and incubate the membranes with horseradish peroxidase (HRP) conjugated secondary antibodies

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.8 วิเคราะห์น้าแบบตะวันตกเซลล์ในแต่ละกลุ่มได้นาทีที่ 37uc กับป้า lysis บัฟเฟอร์สำหรับการแยกโปรตีนทั้งหมดของเซลล์ Lysates ได้จากที่ 12,000 g 10 นาทีที่แล้ว supernatants ถูก assayed สำหรับความเข้มข้นของโปรตีนโดยวิธี BCA หลังจาก solubilized ในบัฟเฟอร์ตัวอย่างการตรวจสอบวิเคราะห์เจ (SDS-หน้า) โซเดียม dodecyl ซัลเฟต และอุ่นในน้ำ 10 นาทีเดือด 100 μโปรตีนแบ่งออก 10% SDS-หน้า และโอนย้ายบนเยื่อไนโตรเซลลูโลส (NC)จากนั้นเยื่อหุ้มได้ถูกบล็อก ด้วยผงนมขาดมันเนย 5% ใน TBST สำหรับ 1 h ตาม ด้วยการบ่มกับแอนติบอดีหลัก (ACC, FAS, AMPK, pAMPK, CPT-1, mTOR, TSC1, LC3II) สำหรับ 2 ชม. ที่อุณหภูมิห้อง และพักค้างคืน ที่ 4 1C. ล้างเยื่อกับ PBST สามครั้งสำหรับ 10 นาที และฟักเยื่อกับแอนติบอดีรองฮอส (HRP) ผันเด็ด ๆ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.8 เวสเทิร์วิเคราะห์ blot
เซลล์ในแต่ละกลุ่มถูก lysed กับ RIPA lysis บัฟเฟอร์สำหรับการสกัดโปรตีนเซลล์รวม
lysates ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 กรัมเป็นเวลา 10 นาทีที่
แล้ว supernatants ถูก assayed สำหรับความเข้มข้นของโปรตีนโดยใช้วิธีการเก็บกวาด
หลังจากละลายโซเดียมเจลโดเดซิลซัลเฟตอะคริเลต ( ระบบ SDS-PAGE) บัฟเฟอร์ตัวอย่างและให้ความร้อนในน้ำเดือด 10 นาที 100 โปรตีนไมโครกรัมถูกแยกออกมาเมื่อวันที่ 10% SDS-PAGE
และโอนไปยัง nitrocellulose (NC) เยื่อ
แล้วเยื่อ
ถูกบล็อก 5% ผงนมไขมันต่ำใน TBST เป็นเวลา 1 ชั่วโมง
ตามด้วยการบ่มกับแอนติบอดีปฐมภูมิ (ACC, FAS, AMPK, pAMPK, CPT-1 mTOR, TSC1, LC3II) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องและค้างคืนที่ 4 1C ล้างเยื่อด้วย PBST สามครั้งเป็นเวลา 10 นาทีในแต่ละครั้งและฟักไข่เยื่อกับมะรุม peroxidase (HRP) แอนติบอดีรองผัน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

โอเคเฮ้ ฉันมีความสุข