or/and in combination with 0, 0.01,

or/and in combination with 0, 0.01, 0.1, หรือ 1.0 ttg/mL โพลีฮิสทิดีน-tagged
รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน OX4OL (in the presence of 1:5 molar ratio mouse แอนติ-
โพลีฮิสทิดีน antibody; R&D Systems) at 37°C/5% CO2 for 6 days. After 6 days, cell
การเพิ่มจำนวน was measured using the colorimetric (BrdU incorporation) Cell
25 การเพิ่มจำนวน ELISATM (Roche) and an ELISA reader (BioRad) at A450 nm.


As shown in รูป 8 (mean ± SD, n=4 using one donor), mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 and mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 20E5 dose-dependently induced การเพิ่มจำนวน in PHA-stimulated
T ลิมโฟไซต์ ที่แสดงออก ฮิวเมน CD134 . Mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล 30 antibody clone 12H3 induced การเพิ่มจำนวน at 0.25, 2.5, and 25 Rg/mL. Mouse แอนติ-
ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 induced การเพิ่มจำนวน at 2.5 and 25
ttg/mL. In addition, ฮิวเมน OX4OL also dose dependently induced การเพิ่มจำนวน in
T ลิมโฟไซต์ ที่แสดงออก ฮิวเมน CD134 ที่กระตุ้นด้วย PHA . ฮิวเมน OX4OL induced การเพิ่มจำนวน at 0.1 and 1.0 lig/mL. Resting (without PHA stimulation) ฮิวเมน
CD134.egative T ลิมโฟไซต์ did not show any proliferative responses after
treatment with mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3, mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 20E5, หรือ ฮิวเมน OX4OL (data not
5 shown).
As shown in รูป 9 (mean ± SD, n=2 using one donor), mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 (at 2.5 and 25 gg/mL), mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 20E5 (at 2.5 and 25 fig/mL), and ฮิวเมน OX4OL
(at 1.0 ug/mL) induced การเพิ่มจำนวน in PHA-stimulated ฮิวเมน CD134 expressing 10 T ลิมโฟไซต์. Non treated (medium only) หรือ treatment with mouse IgGlx ไอโซไทป์
control (at 2.5 and 25 ug/mL; BD Biosciences) did not demonstrate any effect on
T ลิมโฟไซต์ ที่แสดงออก ฮิวเมน CD134 ที่กระตุ้นด้วย PHA การเพิ่มจำนวน. The
combination of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 at 2.5
and 25 ug/mL (or at lower concentrations; data not shown)) หรือ mouse แอนติ-ฮิวเมน 15 CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 20E5 at 2.5 and 25 tg/mL (or at lower
concentrations; data not shown) with ฮิวเมน OX4OL at 1.0 lig/mL (or at lower
concentrations; data not shown) did not demonstrate any reciprocal (i.e.,
synergistic หรือ additive, หรือ even inhibitory) effects on การเพิ่มจำนวน in PHA-
stimulated T ลิมโฟไซต์ ที่แสดงออก ฮิวเมน CD134 .
20
(b). การเพิ่มจำนวน of แอนติ-ฮิวเมน CD3/แอนติ-CD28 beads-stimulated ฮิวเมน CD134 expressing T เอฟเฟคเตอร์ and T regulator ลิมโฟไซต์ after treatment with mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibodies clones 12H3 and 20E5
ฮิวเมน CD4 T ลิมโฟไซต์ were purified from PBMCs by เนกาทีฟ selection 25 using a cocktail of mouse antibodies (BD BioSciences) directed against ฮิวเมน CD8
(clone RPA-T8), CD14 (clone M5E2), CD16 (clone 3G8), CD19 (clone 4G 7) , CD33
(clone P67.6), CD56 (clone B159), and CD235a (IIIR2). After incubation with
Dynabeadse-conjugated sheep แอนติ-mouse IgG (Invitrogen), unbound CD4 T
ลิมโฟไซต์ were collected from the Dynal Magnetic Particle Concentrator,
30 MPCTM6 (Invitrogen). From these enriched CD4 T ลิมโฟไซต์, CD25high Tregs
and CD25เนกาทีฟ Teffs were separated by MACS-sorting using 10 li,L microbeads-
conjugated mouse แอนติ-ฮิวเมน CD25 antibodies (Miltenyi Biotec)/107 cells and
MiniMACSTM Magnet/MS columns (Miltenyi Biotec VarioMACSTm Magnet/LS
columns (Miltenyi Biotec). This resulted in enrichments of >90% Teffs and of >90%
Tregs. Teffs and Tregs were put on 0.25x106 cells/mL in RPMI-1640/glutamax
culture medium (Gibco) supplemented with 0.02 mM pyruvate (Gibco), 100 U/mL
เพนิซิลลิน (Gibco), 100 pg/mL สเตร็ปโตไมซิน (Gibco), and 10% HPSi. Then, Teffs and 5 Tregs were seeded at 2.5x104 cells/200 gL/well (i.e., 0.125x106 cells/mL) in 96-wells
round-bottom plates (Greiner), and were stimulated with CD3/CD28 beads
(Invitrogen) at 1 bead/5 cells with หรือ without 5.0 lig/mL mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134
โมโนโคลนอล antibody clone 12H3, 5.0 tig/mL mouse anti ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล
antibody clone 20E5, 1.0 ttg/mL โพลีฮิสทิดีน-tagged รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน OX4OL 10 (in the presence of 1:5 molar ratio mouse แอนติ-โพลีฮิสทิดีน antibody; R&D
Systems), a combination of 5.0 ug/mL mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล
antibody clone 12H3 with 1.0 tig/mL โพลีฮิสทิดีน-tagged รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน
OX4OL (in the presence of 1:5 molar ratio mouse แอนติ-โพลีฮิสทิดีน antibody), หรือ a
combination of 5.0 pi.g/mL mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone
15 20E5 with 1.0 gg/mL โพลีฮิสทิดีน tagged รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน OX4OL (in the
presence of 1:5 molar ratio mouse แอนติ-โพลีฮิสทิดีน antibody) at 37°C/5% CO2 for 4
or 5 days. After 4 หรือ 5 days, cell การเพิ่มจำนวน was measured using 0.5 pCi tritiated
thymidine (Perkin & Elmer) incorporation and a 6-counter (Canberra-Packard).
As shown in รูป 10 (mean ± SD), although CD3/CD28 stimulator beads 20 alone induced considerable การเพิ่มจำนวน in ฮิวเมน CD134 expressing Teffs (i.e.
medium), mouse anti ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 หรือ ฮิวเมน
OX4OL induced additional การเพิ่มจำนวน in CD3/CD28 beads-stimulated ฮิวเมน
CD134 expressing Teffs. Mouse anti ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone
20E5 did not induce additional การเพิ่มจำนวน in CD3/CD28 beads-stimulated ฮิวเมน
25 CD134 expressing Teffs.
As shown in รูป 11 (mean ± SEM from 5 donors), mouse แอนติ-ฮิวเมน
CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 and mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล
antibody clone 20E5 did not induce หรือ induced low การเพิ่มจำนวน in CD3/CD28
beads-stimulated ฮิวเมน CD134 expressing Tregs, whereas ฮิวเมน OX4OL induced 30 very strong การเพิ่มจำนวน in CD3/CD28 beads stimulated ฮิวเมน CD134 expressing
Tregs.
As shown in รูป 12A (mean ± SD), mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 in combination with ฮิวเมน OX4OL did not demonstrate any


reciprocal (i.e., inhibitory, synergistic หรือ additive) effects in CD3/CD28 beads-
stimulated ฮิวเมน CD134 expressing Teffs. Furthermore, mouse แอนติ-ฮิวเมน
CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 20E5 in combination with ฮิวเมน OX4OL did. not
demonstrate any reciprocal (i.e., inhibitory, synergistic หรือ additive) effects in
5 CD3/CD28 beads-stimulated ฮิวเมน CD134 expressing Teffs (data not shown).
As shown in รูป 12B (mean ± SD), in contrast to the (lack of any) effect
observed with ฮิวเมน OX40L-mediated proliferative responses in CD3/CD28 beads-
stimulated ฮิวเมน CD134 expressing Teffs, mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล.
antibody clone 12H3 strongly suppressed ฮิวเมน OX40L-mediated proliferative
10 responses in CD3/CD28 beads stimulated ฮิวเมน CD134 expressing Tregs.
(c). Suppression function of แอนติ-ฮิวเมน CD3/แอนติ-CD28 beads-stimulated ฮิวเมน CD134 expressing T regulator ลิมโฟไซต์ after treatment with mouse แอนติ-
ฮิวเมน CD134 antibodies clones 12H3 and 20E5
15 ฮิวเมน CD4 T ลิมโฟไซต์ were purified from PBMCs, and Teffs and Tregs
were enriched as described in Example 3(b) above. Teffs and Tregs were put on
0.25x106 cells/mL in RPMI 1640/glutamax culture medium (Gibco) supplemented
with 0.02 mM pyruvate (Gibco), 100 U/mL เพนิซิลลิน (Gibco), 100 fig/mL
สเตร็ปโตไมซิน (Gibco), and 10% HPSi. Then, Teffs were seeded at 2.5x104 cells/200 20 4/well (i.e., 0.125x106 Teffs/mL) and co-cultured with 2.5x104 suppressive
Tregs/200 4/well (i.e., 0.125x106Tregs/mL; Teffs/Tregs ratio = 1:1) in 96-wells
round-bottom plates (Greiner). These Teffs/Tregs co-cultures were stimulated with
CD3/CD28 beads (Invitrogen) at 1 bead/10 cells with หรือ without 5.0 tig/mL mouse
แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3, 5.01.ig/mL mouse แอนติ-ฮิวเมน 25 CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 20E5, and 1.0 gg/mL โพลีฮิสทิดีน-tagged
รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน OX4OL (in the presence of 1:5 molar ratio mouse แอนติ-
โพลีฮิสทิดีน antibody; R&D Systems) at 37°C/5% CO2 for 5 days. After 5 days, cell
การเพิ่มจำนวน was measured using 0.5 fiCi tritiated thymidine (Perkin & Elmer)
incorporation and a B-counter (Canberra-Packard).
30 As shown in รูป 13 (mean ± SD), ฮิวเมน Tregs suppressed CD3/CD28
beads-induced ฮิวเมน Teffs proliferative responses (i.e., medium).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

หรือ / และร่วมกับ 0, 0.01, 0.1 หรือ 1.0 ttg/mL แท็กโพลีฮิสทิดีน รีคอมบิแนนต์ฮิวเมน OX4OL (ในต่อหน้าของ 1:5 อัตราส่วนสบเมาส์แอนติ- โพลีฮิสทิดีนแอนติบอดี R & D ระบบ) ที่ 37°C/5% CO2 6 วัน หลังจากวันที่ 6 เซลล์ การเพิ่มจำนวนถูกวัดโดยใช้การเทียบเคียง (BrdU ประสาน) เซลล์ 25 การเพิ่มจำนวน ELISATM (Roche) และการอ่าน ELISA (BioRad) ที่ A450 nmดังแสดงในรูปที่ 8 (หมายถึง ± SD, n = 4 ใช้บริจาคหนึ่ง), เมาส์แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 และเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5 ยา dependently เกิดการเพิ่มจำนวนในถูกกระตุ้นผาT ลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน CD134 เม้าส์แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล 30 แอนติบอดีโคลน 12H 3 เกิดการเพิ่มจำนวนที่ 0.25, 2.5 และ Rg 25 mL เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 เกิดการเพิ่มจำนวนที่ 2.5 และ 25 ttg/mL นอกจากนี้ ฮิวเมน OX4OL นอกจากนี้ยาอาจ dependently การเพิ่มจำนวนใน T ลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมนที่กระตุ้นด้วย CD134 ผา ฮิวเมน OX4OL เกิดการเพิ่มจำนวนที่ 0.1 และ 1.0 lig/mL ฮิวเมนพักผ่อนโดยไม่ต้องผากระตุ้น)CD134.egative T ลิมโฟไซต์ไม่ได้แสดงการตอบสนองใด ๆ proliferative ต้นหลังจากการรักษา ด้วยแอนติบอดีเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลโคลน 12H 3 เมาส์แอนติฮิวเมน 20E5 โคลน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดี หรือฮิวเมน OX4OL (ข้อมูลไม่5 แสดง)ดังแสดงในรูป 9 (หมายถึง ± SD, n = 2 ใช้บริจาคหนึ่ง), เมาส์แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 (ที่ 2.5 และ 25 gg/มล), เมาส์แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5 (ที่ 2.5 และ 25 ฟิก/มล.), และฮิวเมน OX4OL(ที่ยูจี 1.0/มล) ทำให้เกิดการเพิ่มจำนวนในฮิวเมนผาถูกกระตุ้น CD134 แสดง 10 T ลิมโฟไซต์ ไม่บำบัด (กลางเท่านั้น) หรือรักษา ด้วยเมาส์ IgGlx ไอโซไทป์ ควบคุม (ที่ 2.5 และ 25 ยู จี/mL เวลาออก BD) ไม่แสดงผลใด ๆ บน T ลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน CD134 ที่กระตุ้นด้วยผาการเพิ่มจำนวน ที่ ชุดของเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 ที่ 2.5 และยูจี 25 mL (หรือที่ความเข้มข้นต่ำ ข้อมูลไม่แสดง)) หรือเมาส์แอนติ-ฮิวเมน 15 CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5 2.5 และ 25 tg/mL (หรือต่ำกว่า ความเข้มข้น ข้อมูลไม่แสดง) กับฮิวเมน OX4OL lig 1.0 mL (หรือต่ำกว่า ความเข้มข้น ข้อมูลไม่แสดง) ได้ไม่แสดงใด ๆ ซึ่งกันและกัน (เช่น พลังหรือ additive หรือแม้แต่ลิปกลอสไข) ผลการเพิ่มจำนวนในพระ - T ลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมนถูกกระตุ้น CD13420(ข) . การเพิ่มจำนวนแอนติฮิวเมน CD3 แอนติ-CD28 ถูกกระตุ้นประคำฮิวเมน CD134 แสดง T เอฟเฟคเตอร์และ T ลิมโฟไซต์ควบคุมหลังจากรักษา ด้วยแอนตี้ CD134 แอนติ-ฮิวเมนเมาส์ clones 12H 3 และ 20E5ลิมโฟไซต์ฮิวเมน CD4 T ได้บริสุทธิ์จาก PBMCs โดยเลือกเนกาทีฟ 25 ใช้ค็อกเทลของแอนตี้เมาส์ (เวลาออก BD) โดยตรงกับฮิวเมน CD8 (โคลน RPA T8), CD14 (โคลน M5E2), CD16 (โคลน 3G 8), CD19 (โคลน 4G 7), CD33 (โคลน P67.6), CD56 (โคลน B159), และ CD235a (IIIR2) หลังจากบ่มด้วย แกะ Dynabeadse กลวง IgG แอนติเมาส์ (Invitrogen) ผูก CD4 T ลิมโฟไซต์ได้รวบรวมจากที่ Dynal แม่เหล็กอนุภาคอาทิตย์หัว 30 MPCTM6 (Invitrogen) จากเหล่านี้อุดมไป CD4 T ลิมโฟไซต์ CD25high Tregs และ CD25เนกาทีฟ Teffs ถูกแยกจากกัน โดยเรียงลำดับแม็คใช้ 10 li, microbeads L - กลวงเมาส์แอนติ-ฮิวเมน CD25 แอนตี้ (Miltenyi Biotec) / 107 เซลล์ และ คอลัมน์ MiniMACSTM แม่ เหล็ก/MS (Miltenyi ไบโอเทค VarioMACSTm แม่ เหล็ก/LSคอลัมน์ (Miltenyi ไบโอเทค) ทำให้ enrichments ของ > 90% Teffs และ > 90% Tregs ใส่ Teffs และ Tregs ในเซลล์/มล.ใน RPMI 1640/glutamax 0.25x106 สื่อวัฒนธรรม (Gibco) เสริม ด้วย 0.02 มม. pyruvate (Gibco), 100 U/mL เพนิซิลลิน (Gibco), 100 สเตร็ปโตไมซิน pg/mL (Gibco), และ 10% HPSi แล้ว Teffs และ 5 Tregs ถูก seeded ที่ 2.5x104 200 เซลล์ gL/ดี (เช่น 0.125x106 เซลล์/มล.) ในบ่อ 96 รอบล่างแผ่น (Greiner), และถูกขาวกระตุ้นกับประคำ CD3/CD28 (Invitrogen) ในเซลล์ลูกปัด 1/5 หรือโดย lig 5.0 mL เมาส์ CD134 แอนติ-ฮิวเมน แอนติบอดีโมโนโคลนอลโคลน 12H 3, tig 5.0 mL เมาส์ต่อต้านฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล 20E5 โคลนแอนติบอดี 1.0 ttg/mL แท็กโพลีฮิสทิดีนรีคอมบิแนนต์ฮิวเมน OX4OL 10 (ในต่อหน้าของ 1:5 อัตราส่วนสบเมาส์แอนติบอดีแอนติ-โพลีฮิสทิดีน R & Dระบบ), ยูจี 5.0 mL ใช้เมาส์ CD134 แอนติ-ฮิวเมนโมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 กับ 1.0 tig/mL แท็กโพลีฮิสทิดีนรีคอมบิแนนต์ฮิวเมนOX4OL (ในต่อหน้าของ 1:5 อัตราส่วนสบเมาส์แอนติ-โพลีฮิสทิดีนแอนติบอดี), หรือการ ชุดของ pi.g/mL 5.0 เมาส์แอนติฮิวเมนโมโนโคลนอล CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 15 กับ 1.0 gg/mL โพลีฮิสทิดีนแท็กรีคอมบิแนนต์ฮิวเมน OX4OL (ในการ สถานะของแอนติบอดีแอนติ-โพลีฮิสทิดีนเมาส์ของสบอัตราส่วน 1:5) ที่ 37°C/5% CO2 4 หรือ 5 วัน หลังจาก 5 วันหรือ 4 การเพิ่มจำนวนเซลล์ถูกวัดโดยใช้ 0.5 pCi tritiated ประสาน thymidine (เพอร์แอนด์เอลเมอ) และ 6-เคาน์เตอร์ (แคนเบอร์รา-Packard)ดังแสดงในรูป 10 (หมายถึง ± SD), ถึงแม้ว่าลูกปัดเครื่องกระตุ้น CD3/CD28 20 คนเดียวเกิดการเพิ่มจำนวนมากในฮิวเมน CD134 แสดง Teffs (เช่น เมาส์ขนาดกลาง), anti ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12 H 3 หรือฮิวเมน OX4OL เกิดการเพิ่มจำนวนเพิ่มเติมในฮิวเมนถูกกระตุ้นประคำ CD3/CD28 CD134 แสดง Teffs เมาส์ต่อต้านแอนติบอดีโมโนโคลนอล CD134 ฮิวเมนโคลน 20E5 ได้ก่อให้เกิดการเพิ่มจำนวนเพิ่มเติมในฮิวเมนถูกกระตุ้นประคำ CD3/CD2825 CD134 แสดง Teffsดังแสดงในรูปที่ 11 (เฉลี่ย± SEM จากผู้บริจาค 5), เมาส์แอนติ-ฮิวเมนแอนติบอดีโมโนโคลนอล CD134 โคลน 12H 3 และเมาส์ CD134 แอนติ-ฮิวเมนโมโนโคลนอล 20E5 โคลนแอนติบอดีได้ก่อให้เกิดหรือเกิดการเพิ่มจำนวนต่ำใน CD3/CD28 แสดง CD134 ถูกกระตุ้นประคำฮิวเมน Tregs ในขณะที่ทำให้เกิด OX4OL ฮิวเมน การเพิ่มจำนวน 30 แรงมากในลูกปัดของ CD3/CD28 ถูกกระตุ้นฮิวเมน CD134 แสดง Tregsดังแสดงในรูปที่ 12A (เฉลี่ย± SD), เมาส์แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H ชุดใน 3 กับฮิวเมน OX4OL ไม่ได้สาธิตใด ๆผลกระทบซึ่งกันและกัน (เช่น ลิปกลอสไข พลังหรือ additive) ในลูกปัดของ CD3/CD28-ถูกกระตุ้นแสดง CD134 ฮิวเมน Teffs นอกจากนี้ เมาส์แอนติ-ฮิวเมนCD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5 ร่วมกับฮิวเมน OX4OL ไม่ได้ ไม่ แสดงให้เห็นถึงผลกระทบซึ่งกันและกัน (เช่น หรือลิปกลอสไข พลังบวก) ใด ๆ ใน 5 CD3/CD28 ถูกกระตุ้นประคำฮิวเมน CD134 แสดง Teffs (ข้อมูลไม่แสดง) ดังแสดงในรูป 12B (หมายถึง ± SD), ในทางตรงกันข้ามกับผลกระทบ (ไม่มีของ)พบกับฮิวเมน OX40L mediated proliferative ต้นตอบใน CD3/CD28 ลูกปัด ถูกกระตุ้นแสดง CD134 ฮิวเมน Teffs เมาส์ CD134 แอนติ-ฮิวเมนโมโนโคลนอล แอนติบอดีโคลน 12H 3 ขอระงับฮิวเมน OX40L mediated proliferative ต้น ตอบ 10 ในลูกปัดของ CD3/CD28 ถูกกระตุ้นแสดง CD134 ฮิวเมน Tregs(ค) การทำงานปราบปรามของแอนติ-ฮิวเมน CD3 แอนติ-CD28 ถูกกระตุ้นประคำฮิวเมน CD134 แสดง T ควบคุมลิมโฟไซต์หลังจากรักษาด้วยเมาส์แอนติ -แอนตี้ฮิวเมน CD134 clones 12H 3 และ 20E515 ฮิวเมน CD4 T ลิมโฟไซต์ได้บริสุทธิ์ PBMCs, Teffs และ Tregsอุดมไปตามที่อธิบายไว้ใน 3(b) ตัวอย่างข้างต้น ใส่ใน Teffs และ Tregsเซลล์/มล.ใน RPMI 1640/glutamax วัฒนธรรม (Gibco) เสริม 0.25x106 ด้วย 0.02 มม. pyruvate (Gibco), 100 เพนิซิลลิน U/mL (Gibco), ฟิก 100 mL HPSi สเตร็ปโตไมซิน (Gibco), และ 10% แล้ว Teffs seeded ที่ 2.5x104 200 เซลล์ 20 4/ดี (เช่น 0.125x106 Teffs/mL) และอ่างร่วมกับ 2.5x104 suppressive Tregs/200 4/ดี (เช่น 0.125x106Tregs/mL Teffs/Tregs อัตราส่วน = 1:1) ในบ่อ 96 แผ่นล่างกลม (Greiner) วัฒนธรรมเหล่านี้ร่วม Teffs/Tregs ที่ถูกกระตุ้นด้วย CD3/CD28 ประคำ (Invitrogen) ในเซลล์ 10 1 ลูกปัดหรือไม่มีเมาส์ tig/mL 5.0 แอนติบอดีแอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลโคลน 12H 3, 5.01.ig/mL เมาส์แอนติ-ฮิวเมน 25 CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5 และ 1.0 gg/mL แท็กโพลีฮิสทิดีน รีคอมบิแนนต์ฮิวเมน OX4OL (ในต่อหน้าของ 1:5 อัตราส่วนสบเมาส์แอนติ- โพลีฮิสทิดีนแอนติบอดี R & D ระบบ) ที่ 37°C/5% CO2 5 วัน หลังจาก 5 วัน เซลล์ การเพิ่มจำนวนถูกวัดโดยใช้ fiCi 0.5 tritiated thymidine (เพอร์แอนด์เอลเมอ) ประสานและ B-เคาน์เตอร์ (แคนเบอร์รา-Packard)30 เป็นแสดงในรูปที่ 13 (เฉลี่ย± SD), ฮิวเมน Tregs ถูกระงับ CD3/CD28เกิดจากลูกปัดฮิวเมน Teffs proliferative ต้นตอบ (เช่น กลาง)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

และ / หรือร่วมกับ 0, 0.01, 0.1, 1.0 หรือ TTG / mL โพลีฮิสทิดีน -tagged
รีคอมบิแนนต์ฮิวเมน OX4OL (ในการปรากฏตัวของ 1: 5 อัตราส่วนโดยโมลเมาส์แอนติ -
โพลีฮิสทิดีนแอนติบอดี้; R & D Systems) ที่ 37 ° C / CO2 5% เป็นเวลา 6 วัน หลังจากที่ 6 วัน,
มือถือการเพิ่มจำนวนวัดโดยใช้สี(รวมตัว BrdU) เซลล์
25 การเพิ่มจำนวน ELISATM (Roche) และอ่านวิธี ELISA (BioRad) ที่นาโนเมตร A450. ดังแสดงในรูปที่ 8 (mean ± SD, n = 4 โดยใช้หนึ่งในผู้บริจาค) เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 และเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลนยา dependently เหนี่ยวนำให้เกิด 20E5 การเพิ่มจำนวนใน PHA กระตุ้นT ลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน CD134 เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 30 12H3 เหนี่ยวนำให้เกิดการเพิ่มจำนวนที่ 0.25, 2.5 และ 25 Rg / มิลลิลิตร เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 เหนี่ยวนำให้เกิดการเพิ่มจำนวนที่ 2.5 และ 25 TTG / มิลลิลิตร นอกจากนี้ฮิวเมน OX4OL ยังเหนี่ยวนำยา dependently การเพิ่มจำนวนในทีลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมนCD134 ที่กระตุ้นด้วย PHA ฮิวเมน OX4OL เหนี่ยวนำให้เกิดการเพิ่มจำนวนที่ 0.1 และ 1.0 lig / มิลลิลิตร พักผ่อน (โดยไม่ต้องกระตุ้น PHA) ฮิวเมนCD134.egative ทีลิมโฟไซต์ไม่ได้แสดงการตอบสนองการเจริญใด ๆ หลังจากการรักษาด้วยเมาส์แอนติ- ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 เมาส์แอนติ - ฮิว เมน CD134 โมโนโคลนอล 20E5 โคลนแอนติบอดีหรือฮิวเมน OX4OL (ข้อมูลไม่ได้5 แสดง). ดังแสดงในรูปที่ 9 (mean ± SD, n = 2 โดยใช้หนึ่งในผู้บริจาค) เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโน โคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 (2.5 และ 25 GG / มิลลิลิตร) เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5 (2.5 และ 25 รูป / มิลลิลิตร) และฮิวเมน OX4OL (1.0 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร) เหนี่ยวนำให้เกิดการเพิ่มจำนวนใน PHA กระตุ้นฮิวเมน CD134 แสดง 10 T ลิมโฟไซต์ ได้รับการปฏิบัติที่ไม่ (กลางเท่านั้น) หรือการรักษาด้วยเมาส์ IgGlx ไอโซไทป์ควบคุม(2.5 และ 25 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร; BD ชีววิทยาศาสตร์) ไม่ได้แสดงให้เห็นถึงผลกระทบต่อทีลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมนCD134 ที่กระตุ้นด้วย PHA การ เพิ่มจำนวน การรวมกันของเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล 12H3 โคลนแอนติบอดีที่ 2.5 และ 25 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร (หรือที่ระดับความเข้มข้นต่ำกว่าไม่ได้แสดงข้อมูล)) หรือเมาส์แอนติ - ฮิวเมน 15 CD134 โมโนโคลน อล 20E5 โคลนแอนติบอดีที่ 2.5 และ 25 TG / มิลลิลิตร (หรือต่ำกว่าความเข้มข้น; ไม่ได้แสดงข้อมูล) กับฮิวเมน OX4OL 1.0 lig / มิลลิลิตร (หรือต่ำกว่าความเข้มข้น; ไม่ได้แสดงข้อมูล) ไม่ได้แสดงให้เห็นซึ่งกันและกันใด ๆ (เช่นสารเติมแต่งหรือเสริมฤทธิ์กัน, หรือแม้กระทั่งการยับยั้ง) มีผลต่อการเพิ่มจำนวนใน PHA- กระตุ้น T ลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน CD134. 20 (ข) การเพิ่มจำนวนของแอนติ - ฮิวเมน CD3 / แอนติ -CD28 ลูกปัดกระตุ้นฮิวเมน CD134 แสดงทีเอฟเฟคเตอร์และควบคุมทีลิมโฟไซต์หลังการรักษาด้วยเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โคลนแอนติบอดี 12H3 และ 20E5 ฮิวเมน CD4 ทีลิมโฟไซต์ถูกบริสุทธิ์จาก PBMCs โดยเนกาทีฟเลือก 25 โดยใช้ค๊อกเทลแอนติบอดีเมาส์ (BD ชีววิทยาศาสตร์) กำกับกับฮิวเมน CD8 (โคลน RPA-T8) CD14 (โคลน M5E2 ) CD16 (โคลน 3G8) CD19 (โคลน 4G 7), CD33 (โคลน P67.6) CD56 (โคลน B159) และ CD235a (IIIR2) หลังจากการบ่มด้วยDynabeadse-ผันแกะแอนติ -mouse IgG (Invitrogen) หลุด CD4 ทีลิมโฟไซต์ที่ถูกเก็บรวบรวมจากDynal Concentrator อนุภาคแม่เหล็ก, 30 MPCTM6 (Invitrogen) จากนี้อุดม CD4 ทีลิมโฟไซต์, CD25high Tregs และ CD25 เนกาทีฟ Teffs ถูกแยกจากกันโดยแม็คเรียงลำดับโดยใช้ 10 li, L microbeads- เมาส์ผันแอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD25 (Miltenyi Biotec) / 107 เซลล์และMiniMACSTM แม่เหล็ก / คอลัมน์ MS (Miltenyi Biotec VarioMACSTm แม่เหล็ก / LS คอลัมน์ (Miltenyi Biotec). นี้ส่งผลให้ใน enrichments ของ> 90% Teffs และ> 90% Tregs. Teffs Tregs และวางอยู่บน 0.25x106 เซลล์ / มิลลิลิตรใน RPMI-1640 / glutamax วัฒนธรรม ปานกลาง (Gibco) เสริมด้วยไพรูมิลลิ 0.02 (Gibco) 100 U / มิลลิลิตรเพนิซิลลิน(Gibco) 100 pg / มิลลิลิตรสเตร็ปโตไมซิน (Gibco) และ 10% HPSI. แล้ว Teffs และ 5 Tregs เมล็ดที่ 2.5x104 เซลล์ / 200 gL / ดี (เช่น 0.125x106 เซลล์ / มิลลิลิตร) ใน 96 หลุมจานด้านล่างรอบ(เกรนเนอร์) และถูกกระตุ้นด้วยลูกปัด CD3 / CD28 (Invitrogen) ณ วันที่ 1 ลูกปัด / 5 เซลล์ที่มีหรือโดยไม่ต้อง 5.0 lig / mL เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 5.0 TIG / mL เมาส์ต่อต้านฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน20E5 1.0 TTG / mL โพ ลีฮิสทิดีน -tagged รีคอมบิแนนต์ฮิวเมน OX4OL 10 (ในการปรากฏตัวของ 1: 5 เมาส์อัตราส่วนโดยโมลแอนติ - โพลีฮิสทิดีนแอนติบอดี้; การวิจัยและพัฒนาระบบ), การรวมกันของ 5.0 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน12H3 1.0 TIG / mL โพลีฮิสทิดีน -tagged รีคอมบิแนนต์ฮิวเมนOX4OL (ในการปรากฏตัวของ 1: 5 เมาส์อัตราส่วนโดยโมลแอนติ - โพลีฮิสทิดีนแอนติบอดี้) หรือการรวมกันของpi.g 5.0 / mL เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดี โคลน15 20E5 1.0 GG / mL โพลีฮิสทิดีนติดแท็กรีคอมบิแนนต์ฮิวเมน OX4OL (ในการปรากฏตัวของ1: 5 เมาส์อัตราส่วนโดยโมลแอนติ - โพลีฮิสทิดีนแอนติบอดี้) ที่ 37 ° C / CO2 5% เป็นเวลา 4 หรือ 5 วัน หลังจากที่ 4 หรือ 5 วันเซลล์การเพิ่มจำนวนได้รับการวัดโดยใช้ 0.5 pCi tritiated thymidine (เพอร์กินและเอลเมอ) การรวมตัวกันและ 6 เคาน์เตอร์ (Canberra-Packard). ดังแสดงในรูปที่ 10 (mean ± SD) แม้ว่า CD3 / กระตุ้น CD28 ลูกปัด 20 ชักนำคนเดียวมากการเพิ่มจำนวนในฮิวเมน CD134 แสดง Teffs (เช่นขนาดกลาง) เมาส์ต่อต้านฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอแอนติบอดีโคลนล 12H3 หรือฮิวเมนOX4OL ชักนำเพิ่มเติมการเพิ่มจำนวนใน CD3 / CD28 กระตุ้น-ลูกปัด ฮิวเมนCD134 แสดง Teffs เมาส์ต่อต้านฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน20E5 ไม่ได้ก่อให้เกิดการเพิ่มเติมการเพิ่มจำนวนใน CD3 / CD28 ลูกปัดกระตุ้นฮิวเมน25 CD134 แสดง Teffs. ดังแสดงในรูปที่ 11 (ค่าเฉลี่ย± SEM จาก 5 ผู้บริจาค) เมาส์ แอนติ - ฮิวเมนCD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 และเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน20E5 ไม่ได้ก่อให้เกิดหรือเหนี่ยวนำต่ำการเพิ่มจำนวนใน CD3 / CD28 ลูกปัดกระตุ้นฮิว เมน CD134 แสดง Tregs ขณะที่ฮิวเมน OX4OL เหนี่ยวนำ 30 ที่แข็งแกร่งมากการเพิ่มจำนวนในลูกปัด CD3 / CD28 กระตุ้นฮิวเมน CD134 แสดงTregs. ดังแสดงในรูป 12A (mean ± SD) เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 ร่วมกับฮิวเมน OX4OL ไม่ได้แสดงให้เห็นใด ๆซึ่งกันและกัน (เช่นยับยั้งสารเติมแต่งหรือเสริมฤทธิ์กัน) ผลกระทบใน CD3 / CD28 beads- กระตุ้นฮิวเมน CD134 แสดง Teffs นอกจากนี้เมาส์แอนติ - ฮิวเมนCD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5 ร่วมกับฮิวเมน OX4OL ได้ ไม่ได้แสดงให้เห็นซึ่งกันและกันใด ๆ (เช่นการยับยั้งการทำงานร่วมกันหรือสารเติมแต่ง) ผลกระทบใน 5 CD3 / CD28 ลูกปัดกระตุ้นฮิวเมน CD134 แสดง Teffs (ไม่ได้แสดงข้อมูล). ดังแสดงในรูป 12B (mean ± SD) ในทางตรงกันข้ามกับ ( ขาดการมี) ผลที่สังเกตกับฮิวเมนOX40L พึ่งการตอบสนองในการเจริญ CD3 / CD28 beads- กระตุ้นฮิวเมน CD134 แสดง Teffs เมาส์แอนติ -. ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล12H3 โคลนแอนติบอดีปราบปรามอย่างรุนแรงฮิว เมน OX40L พึ่งเจริญ10 การตอบสนองในลูกปัด CD3 / CD28 กระตุ้นฮิวเมน CD134 แสดง Tregs. (ค) ฟังก์ชั่นการปราบปรามของแอนติ - ฮิวเมน CD3 / แอนติ -CD28 ลูกปัดกระตุ้นฮิวเมน CD134 แสดงความควบคุมทีลิมโฟไซต์หลังการรักษาด้วยเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โคลนแอนติบอดี 12H3 และ 20E5 15 ฮิ วเมน CD4 ทีลิมโฟไซต์ถูกบริสุทธิ์จาก PBMCs และ Teffs และ Tregs ถูกอุดมไปตามที่อธิบายไว้ในตัวอย่างที่ 3 (ข) ข้างต้น Teffs Tregs และวางอยู่บน0.25x106 เซลล์ / มิลลิลิตรใน RPMI 1640 / glutamax กลางวัฒนธรรม (Gibco) เสริมด้วยไพรูมิลลิ0.02 (Gibco) 100 U / มิลลิลิตรเพนิซิลลิน (Gibco) 100 รูป / mL สเต ร็ปโตไมซิน (Gibco) และ 10% HPSI จากนั้น Teffs เมล็ดที่ 2.5x104 เซลล์ / 200 20 4 / ดี (เช่น 0.125x106 Teffs / มิลลิลิตร) และร่วมกับการเพาะเลี้ยง 2.5x104 ปราบTregs / 200 4 / ดี (เช่น 0.125x106Tregs / mL; อัตราส่วน Teffs / Tregs = 1: 1) ใน 96 หลุมจานด้านล่างรอบ(เกรนเนอร์) เหล่านี้ Teffs / Tregs ร่วมวัฒนธรรมที่ถูกกระตุ้นด้วยลูกปัดCD3 / CD28 (Invitrogen) ณ วันที่ 1 ลูกปัด / 10 เซลล์ที่มีหรือโดยไม่ต้อง 5.0 TIG / mL เมาส์แอนติ- ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3, 5.01.ig / mL เมาส์แอนติ - ฮิวเมน 25 CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5 และ 1.0 GG / mL โพลีฮิสทิดีน -tagged รีคอมบิแนนต์ฮิวเมน OX4OL (ในการปรากฏตัวของ 1 : 5 อัตราส่วนโดยโมลเมาส์แอนติ - โพลีฮิสทิดีนแอนติบอดี้; R & D Systems) ที่ 37 ° C / CO2 5% เป็นเวลา 5 วัน หลังจาก 5 วันเซลล์การเพิ่มจำนวนได้รับการวัดโดยใช้0.5 fiCi thymidine tritiated (เพอร์กินและเอลเมอ) การรวมตัวกันและ B เคาน์เตอร์ (Canberra-Packard). 30 ดังแสดงในรูปที่ 13 (mean ± SD) ฮิวเมน Tregs ปราบปราม CD3 / CD28 ลูกปัดที่เกิดฮิวเมน Teffs การตอบสนองการเจริญ (เช่นขนาดกลาง)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

และ / หรือในการรวมกันกับ 0 , 0.01 , 0.1 , 1.0 มิลลิลิตรโพลีฮิสทิดีนค็อคทีทีจี - แท็ก
รีคอมบิแนนต์ฮิวเมน ox4ol ( ในการแสดงตนของอัตราส่วน 1 : 5 แอนติโพลีฮิสทิดีนแอนติบอดีเมาส์ -
; R & D ระบบ ) ที่ 37 ° C / คาร์บอนไดออกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 6 วัน หลังจากที่ 6 วัน เซลล์
การเพิ่มจำนวนวัดใช้ 7.4 ( brdu ประสานเซลล์
25 การเพิ่มจำนวน elisatm ( โรช ) และเครื่องอ่านอีไล ( biorad ) ที่ a450 nm .

ตามที่แสดงในรูป 8 ( หมายถึง± SD , n = 4 โดยใช้หนึ่งในผู้บริจาค ) , เมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลนและ 12h3 แอนติ - เมาส์ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20e5 dose dependently ชักนำการเพิ่มจำนวนในผาน่าเร้าใจ
T ลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน cd134 . เมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอล 30 แอนติบอดีโคลน 12h3 ชักนำการเพิ่มจำนวนที่ 0.25 , 2.5 และ 25 มิลลิลิตรแอนติ RG / เมาส์ --
ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12h3 ชักนำการเพิ่มจำนวน 2.5 และ 25
ทีทีจี / มิลลิลิตร นอกจากนี้ฮิวเมน ox4ol ยังขนาด dependently ชักนำการเพิ่มจำนวนใน
t ลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน cd134 ที่กระตุ้นด้วยผา . ฮิวเมน ox4ol ชักนำการเพิ่มจำนวนที่ 0.1 และ 1.0 lig / มล. พัก ( โดยไม่มีการกระตุ้นผา ) ฮิวเมน cd134.egative T
ลิมโฟไซต์ไม่แสดงใด ๆการตอบสนองหลังจาก
proliferativeการรักษาด้วยแอนติ - เมาส์ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12h3 , เมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20e5 ค็อค , ฮิวเมน ox4ol ( ข้อมูลไม่แสดง

5 ) ดังแสดงในรูป 9 ( หมายถึง± SD , n = 2 โดยใช้หนึ่งในผู้บริจาค ) , เมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12h3 ( 2.5 และ 25 GG / มิลลิลิตร