DNA of nptII and/or nptIII positive

DNA of nptII and/or nptIII positive soil sampleswas concentrated
by vacuum centrifugation of 100 ml of the original PowerSoil eluate
for 30 min. The dried pellet was resuspended in 20 ml of H2O
(molecular biology grade; Sigma) and stored at 20 C for further
analysis. Two ml of the concentrated solution were used as template
for the quantitative nptII/nptIII TaqMan assay. Absolute quantification
was performed using semi-logarithmic dilutions of pCR2.1
plasmids containing either nptII (GenBank accession number
V00618) or nptIII (V01547) full length wild type gene inserts as
external standards. A check for PCR inhibition was performed with
1:5 and 1:25 serial dilutions of the template. Sample eluates which
showed inhibition were re-purified with the PowerClean Kit
(MoBio Laboratories) according to the manufacturer's instructions.
Copy number calculations were performed using the second derivative
maximum algorithm provided by the LightCycler LC480
software package (version 1.5) with default parameters. The samples
were tested at least in triplicates.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ดีเอ็นเอของ nptII หรือ nptIII sampleswas ดินบวกเข้มข้นโดยการหมุนเหวี่ยงสูญญากาศของ eluate PowerSoil เดิม 100 ml30 นาที เม็ดแห้งถูก resuspended ใน 20 ml ของ H2O(อณูชีววิทยาเกรด ซิกม่า) และเก็บไว้ที่ 20 C สำหรับเพิ่มเติมการวิเคราะห์ มล.ที่สองของการแก้ปัญหาที่เข้มข้นใช้เป็นแม่แบบสำหรับปริมาณ nptII/nptIII TaqMan วิเคราะห์ ด้านแน่นอนดำเนินการโดยใช้ dilutions กึ่งลอการิทึมของ pCR2.1ประกอบด้วยทั้ง nptII (เลขทะเบียน GenBank plasmidsV00618) หรือ nptIII (V01547) ยีนชนิดป่ายาวแทรกเป็นมาตรฐานภายนอก ดำเนินการตรวจสอบการ PCR ด้วย1:5 และ 1:25 อนุกรม dilutions ของแม่ ตัวอย่าง eluates ซึ่งยับยั้งการแสดงให้เห็นที่บริสุทธิ์อีกครั้ง ด้วยชุด PowerClean(ห้องปฏิบัติการ MoBio) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตดำเนินการคำนวณจำนวนการคัดลอกโดยใช้อนุพันธ์อันดับสองอัลกอริทึมสูงโดย LightCycler LC480แพคเกจซอฟต์แวร์ (รุ่น 1.5) กับพารามิเตอร์เริ่มต้น ตัวอย่างทดสอบน้อยใน triplicates

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ดีเอ็นเอของ nptII และ / หรือ nptIII ดินบวก sampleswas เข้มข้น
โดยการหมุนเหวี่ยงสูญญากาศ 100 มล. ของ eluate PowerSoil เดิม
เป็นเวลา 30 นาที เม็ดแห้งถูก resuspended ใน 20 มล. ของ H2O
(อณูชีววิทยาเกรด; ซิก) และเก็บไว้ที่ 20 องศาเซลเซียสเป็นเวลาเพิ่มเติมอีกหรือไม่?
การวิเคราะห์ สองมล. ของการแก้ปัญหาที่มีความเข้มข้นถูกนำมาใช้เป็นแม่แบบ
สำหรับปริมาณ nptII / nptIII TaqMan ทดสอบ ปริมาณแอบโซลูท
ได้รับการดำเนินการโดยใช้เจือจางกึ่งลอการิทึมของ pCR2.1
พลาสมิดที่มีทั้ง nptII (GenBank หมายเลขภาคยานุวัติ
V00618) หรือ nptIII (V01547) แทรกความยาวเต็มป่าประเภทยีนเป็น
มาตรฐานภายนอก การตรวจสอบในการยับยั้ง PCR ได้ดำเนินการกับ
1: 5 และ 1:25 เจือจางอนุกรมของแม่ eluates ตัวอย่างที่
แสดงให้เห็นว่าการยับยั้งเป็นอีกครั้งที่บริสุทธิ์กับชุด PowerClean
(Mobio ห้องปฏิบัติการ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต.
คัดลอกคำนวณตัวเลขได้ดำเนินการโดยใช้สองอนุพันธ์
อัลกอริทึมสูงสุดให้โดย LightCycler LC480
แพคเกจซอฟต์แวร์ (เวอร์ชั่น 1.5) โดยมีค่าเริ่มต้น กลุ่มตัวอย่างที่
ได้รับการทดสอบอย่างน้อยใน triplicates

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ดีเอ็นเอของ nptii และ / หรือ nptiii บวกดิน sampleswas เข้มข้นด้วยสูญญากาศปั่น 100 มิลลิลิตรของสารละลาย ( eluate ) powersoil ต้นฉบับเป็นเวลา 30 นาที แห้งเป็นเม็ด resuspended 20 ml H2O( อณูชีววิทยาเกรด ; Sigma ) และเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 20 C ต่อไปการวิเคราะห์ 2 มิลลิลิตรของสารละลายเข้มข้นที่ถูกใช้เป็นแม่แบบสำหรับปริมาณ nptii / nptiii taqman ตามลำดับ ปริมาณสัมบูรณ์การใช้วิธีการ pcr2.1 กึ่งลอการิทึมพลาสมิดที่มีให้ nptii ( ขนาดเข้าหมายเลขv00618 ) หรือ nptiii ( v01547 ) ความยาวเต็มป่ายีนชนิดแทรกเป็นมาตรฐานภายนอก การตรวจสอบเพื่อทำการตรวจด้วยการยับยั้ง1 : 5 และ 1 : 25 หมายเลขเจือจางของแม่แบบ ตัวอย่าง eluates ซึ่งทำให้การได้อีกครั้ง กับชุด powerclean บริสุทธิ์( mobio ห้องปฏิบัติการ ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตการคำนวณจำนวนสำเนาการใช้อนุพันธ์ที่สองขั้นตอนวิธี lightcycler lc480 สูงสุดโดยแพคเกจซอฟต์แวร์ ( รุ่น 1 ) กับพารามิเตอร์เริ่มต้น ตัวอย่างทดสอบอย่างน้อย 3 ซ้ำ .