2.4. Extraction of soil DNADNA was

2.4. Extraction of soil DNA
DNA was extracted using Fast DNA SPIN Kit for soil (MP Biomedicals,
USA) following the manufacturer’s protocol.
2.5. Quantification of amoA genes by real-time PCR
An iCycler iQ5 Thermocycler (Bio-Rad, USA) was used for realtime
PCR. Bacterial amoA genes were quantified using the probe
A337 and the primer pair A189/amoA-2R0 [7]. Amplifications were
carried out as follows: 94 C for 2 min, followed by 40 cycles of 15 s
at 94 C, 1 min at 56 C. Primer pair Arch-amoAF/Arch-amoAR [8]
was used for quantification of archaeal amoA gene with SYBR Premix
Ex Taq™ (TaKaRa). Amplifications were carried out as follows:
94 C for 2 min, followed by 40 cycles of 30 s at 94 C, 30 s at 55 C,
1 min at 72 C, plate read at 83 C for 10 s, and 72 C for 2 min. The
standard curves were made according to He et al. [9].
2.6. Cloning and sequence analysis
The primer pairs which amplified amoA genes of AOA and AOB
were the same as described above. The purified PCR products were
ligated into the pGEM-T Easy Vector (Promega, USA) and then
transformed into E. coli JM109 (Takara Biotechnology, Japan)
according to the manufacturer’s instructions. Positive clones were
randomly selected and sequenced. The obtained sequences were
subjected to homology analysis and the sequences displaying more
than 96% identity with each other were grouped into the same
operational taxonomic units (OTUs). Only one representative sequence
of each OTU was used for phylogenetic tree construction.
Sequences were compared with GenBank sequences using BLASTN
searches, then some sequences closely related to the representative
sequences in this study and reference sequences from different
clusters were selected for phylogenetic tree construction using
MEGA version 4.0 .
2.7. Statistical analysis
All statistical analysis was performed using SPSS 11.5 (SPSS, Inc.
Chicago, IL). One-way analysis of variance (ANOVA) followed by SN-K-test
was used to check differences between treatments, and
bivariate correlation was used to link different parameters.
3. Resu

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4 การสกัดดีเอ็นเอดินดีเอ็นเอที่สกัดโดยใช้ชุดสปินดีเอ็นเอได้อย่างรวดเร็วในดิน (MP Biomedicalsสหรัฐอเมริกา) ต่อไปนี้ของโพรโทคอลการ2.5 การนับของ amoA โดย PCR แบบเรียลไทม์ICycler การใช้ Thermocycler iQ5 (Bio Rad สหรัฐอเมริกา) สำหรับเรียลไทม์PCR ยีนแบคทีเรีย amoA ถูก quantified โดยใช้โพรบA337 และพื้นที่คู่ A189/amoA-2R0 [7] Amplifications ได้ดำเนินการดังนี้: C 94 ใน 2 นาที ตาม ด้วยรอบ 40 15 sที่ 94 C, 1 นาทีที่ 56 C. รองพื้นคู่ประตู-amoAF/ประตู-amoAR [8]ใช้สำหรับนับของยีน amoA archaeal กับ SYBR Premixอดีต Taq ™ (TaKaRa) Amplifications ได้ดำเนินการดังนี้:C 94 ใน 2 นาที ตาม ด้วยรอบ 40 30 s ที่ 94 C, 30 s ที่ 55 C1 นาทีที่ 72 C แผ่นอ่านที่ 83 C 10 s และ 72 C 2 นาทีเส้นโค้งมาตรฐานขึ้นตามเขา et al. [9]2.6 การโคลน และการวิเคราะห์ลำดับคู่รองพื้นซึ่งขยายยีน amoA AOA และ AOBไม่เหมือนกับที่อธิบายไว้ข้างต้น ผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์ควบในการ pGEM-T ง่ายเวกเตอร์ (Promega สหรัฐอเมริกา) แล้วเปลี่ยนเป็น E. coli JM109 (Takara เทคโนโลยีชีวภาพ ญี่ปุ่น)ตามคำแนะนำของผู้ผลิต บวกโคลนได้สุ่มเลือก กตามลำดับ ลำดับที่ได้รับได้การวิเคราะห์ homology และลำดับการแสดงกว่า 96% ตัวกันถูกจัดกลุ่มเป็นเหมือนกันอนุกรมวิธานหน่วยงาน (OTUs) ตัวแทนลำดับเดียวเท่านั้นของแต่ละ OTU ถูกใช้สำหรับต้นไม้ phylogenetic ก่อสร้างลำดับเปรียบเทียบกับลำดับ GenBank ที่ใช้ BLASTNค้นหา แล้วบางลำดับที่สัมพันธ์ใกล้ชิดกับตัวแทนลำดับในลำดับนี้ศึกษาและอ้างอิงจากที่อื่นคลัสเตอร์ถูกเลือกสำหรับใช้ก่อสร้างทรี phylogeneticร็อคเวอร์ชัน 4.02.7. สถิติวิเคราะห์วิเคราะห์ทางสถิติทั้งหมดทำโดยใช้โปรแกรม 11.5 (โปรแกรม incชิคาโก IL) ทางเดียวการวิเคราะห์ของผลต่าง (การวิเคราะห์ความแปรปรวน) ตาม ด้วย SN-K-ทดสอบใช้ในการตรวจสอบความแตกต่างระหว่างรักษา และความสัมพันธ์ bivariate ถูกใช้เพื่อเชื่อมโยงพารามิเตอร์ต่าง ๆ3. Resu

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4 การสกัดดีเอ็นเอดิน
ดีเอ็นเอถูกสกัดโดยใช้ดีเอ็นเออย่างรวดเร็ว? ชุด SPIN ดิน (MP Biomedicals,
USA) ดังต่อไปนี้โปรโตคอลของผู้ผลิต.
2.5 ปริมาณของยีน AMOA โดย real-time PCR
ปฏิทินสาธารณะ IQ5 thermocycler (Bio-Rad, ประเทศสหรัฐอเมริกา) ที่ใช้สำหรับเรียลไทม์
พีซีอาร์ ยีน AMOA แบคทีเรียถูกวัดโดยใช้หัววัด
A337 และ A189 คู่ไพรเมอร์ / พิพิธภัณฑ์ศิลปะ 2R0 [7] เครื่องขยายเสียงได้รับการ
ดำเนินการดังต่อไปนี้: 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีตามด้วย 40 รอบ 15 วินาที
ที่ 94 C, 1 นาทีที่ 56 คู่ C. ประถมศึกษา Arch-amoAF / Arch-amoAR [8]
ที่ใช้สำหรับปริมาณของยีน archaeal AMOA กับ SYBR? พรีมิกซ์
Ex Taq ™ (TaKaRa) เครื่องขยายเสียงได้ดำเนินการดังต่อไปนี้:
94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีตามด้วย 40 รอบ 30 วินาทีที่ 94 C, 30 วินาทีที่ 55 C,
1 นาทีที่ 72 C, แผ่นอ่านได้ที่ 83 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 วินาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาที
เส้นโค้งมาตรฐานได้ทำตามที่เขาและคณะ [9].
2.6 การโคลนและวิเคราะห์ลำดับ
คู่ไพรเมอร์ที่ขยายยีน AMOA ของ AOA และ AOB
ได้เหมือนกันตามที่อธิบายไว้ข้างต้น บริสุทธิ์ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ถูก
ligated เป็น pGEM-T ง่ายเวกเตอร์ (Promega, ประเทศสหรัฐอเมริกา) และจากนั้น
กลายเป็นเชื้อ E. coli JM109 (Takara เทคโนโลยีชีวภาพ, ญี่ปุ่น)
ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โคลนบวกถูก
สุ่มเลือกและลำดับขั้นตอน ลำดับที่ได้มา
อยู่ภายใต้การวิเคราะห์ที่คล้ายคลึงกันและลำดับการแสดงมากขึ้น
กว่า 96% ตัวตนกับแต่ละอื่น ๆ ที่ถูกแบ่งออกเป็นเดียวกัน
หน่วยอนุกรมวิธานการดำเนินงาน (Otus) เพียงคนเดียวที่ลำดับที่เป็นตัวแทน
ของแต่ละ OTU ถูกนำมาใช้ในการก่อสร้าง phylogenetic ต้นไม้.
ลำดับเปรียบเทียบกับลำดับ GenBank โดยใช้ไทด์
ค้นหาแล้วบางส่วนลำดับที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับตัวแทน
ลำดับในการศึกษาครั้งนี้และลำดับการอ้างอิงจากที่แตกต่างกัน
กลุ่มที่ถูกเลือกสำหรับการก่อสร้างต้นไม้สายวิวัฒนาการโดยใช้
MEGA รุ่น 4.0.
2.7 การวิเคราะห์ทางสถิติ
การวิเคราะห์ทางสถิติทั้งหมดได้รับการดำเนินการโดยใช้โปรแกรม SPSS 11.5 (SPSS, Inc
Chicago, IL) ผลวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA) ตามด้วย SN-K-ทดสอบ
ถูกใช้ในการตรวจสอบความแตกต่างระหว่างการรักษาและ
ความสัมพันธ์สองตัวแปรถูกใช้ในการเชื่อมโยงพารามิเตอร์ที่แตกต่าง.
3 Resu

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4 . การสกัดดีเอ็นเอดีเอ็นเอ
ดินถูกสกัดโดยใช้ดีเอ็นเอ  หมุนเร็วชุดดิน ( MP biomedicals
, USA ) ตามขั้นตอนของผู้ผลิต .
2.5 ปริมาณของยีนโดยวิธี PCR แบบเรียลไทม์ amoa
icycler iq5 เทอร์มอไซเคล ์ ( USA ไบแรด ) ใช้เรียลไทม์
PCR แบคทีเรีย amoa ยีน quantified ใช้โพรบ
a337 และไพรเมอร์คู่ a189 / amoa-2r0 [ 7 ] amplifications ถูก
ดำเนินการดังนี้ : 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาที ตามด้วย 40 รอบ 15 S
ที่ 94 องศาเซลเซียส 1 นาทีที่ 56 C . ไพรเมอร์คู่โค้ง amoaf / โค้ง amoar [ 8 ]
ใช้ปริมาณของ archaeal amoa ยีนกับ SYBR  พรีมิกซ์
อดีตได้ดี™ ( ทาการะ ) amplifications ทดลองดังนี้
94 องศาเซลเซียส 2 นาที ตามด้วย 40 รอบ 30 s ที่ 94 องศาเซลเซียส , 30 S 55 C ,
1 นาทีที่ 72 C , แผ่นอ่าน 83 C 10 , และ 72 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 2 นาที
เส้นโค้งมาตรฐานตามเขา et al . [ 9 ] .
2.6 การโคลนและวิเคราะห์ลำดับ
ไพรเมอร์คู่ซึ่งขยาย amoa และยีนของ AOA aob
เป็นเดียวกันตามที่อธิบายไว้ข้างต้น และเทคนิคผลิตภัณฑ์
ผูกเป็น pgem-t ง่ายเวกเตอร์ ( promega , USA ) และจากนั้น
เปลี่ยนเป็น E . coli ที่มี ( Takara เทคโนโลยีชีวภาพ , ญี่ปุ่น )
ตามคำแนะนำของผู้ผลิตโคลนบวกถูก
สุ่มเลือกนี้ ได้ลำดับถูก
ภายใต้การวิเคราะห์ลำดับและลำดับการแสดงมากขึ้น
กว่า 96% ตัวตนกับแต่ละอื่น ๆ แบ่งตามหมวดหมู่เดียวกัน
ปฏิบัติการหน่วย ( ใน ) เพียงหนึ่งตัวแทนของแต่ละลำดับ
otu ถูกใช้สำหรับการสร้าง phylogenetic ต้นไม้ .
) เปรียบเทียบกับลำดับ blastn
ขนาดใช้ค้นหา แล้วก็ลำดับที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับตัวแทน
ลำดับในการศึกษานี้อ้างอิงจากลำดับกลุ่มแตกต่างกัน
สุ่มสร้าง phylogenetic ต้นไม้ใช้ Mega เวอร์ชั่น 4.0
.
2.7 . การวิเคราะห์ทางสถิติ
ทั้งหมดสถิติวิเคราะห์ SPSS 11.5 ( SPSS , IL อิงค์
ชิคาโก ) การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียว ( ANOVA ) รองลงมา คือ sn-k-test
ถูกนำมาใช้เพื่อตรวจสอบความแตกต่างระหว่างการรักษา และใช้เพื่อเชื่อมโยงความสัมพันธ์
โดยใช้พารามิเตอร์ที่แตกต่างกัน .
3 resu