incubated for 1 hat RT. After washi

incubated for 1 hat RT. After washing, 20 µl QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate was added to each well and the fluorescence was measured at an excitation wavelength of 320 nm and an emission wavelength of 430 nM after 15 min using the GENios Plus plate reader (Tecan).

[00178] The evaluation was performed as follows: free hPCSK9 หรือ the hPCSK.9_D374Y mutant concentration c(hPCSK9)free I c(hPCSK9_D374Y)free was calculated from relative fluorescence signals . using the standard curve determined in parallel and plotted versus the ไลโปคาลิน มิวทีน concentration, c(SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, หรือ benchmark antibody of SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 33). To obtain the ไลโปคาลิน มิวทีน concentration at which การประกอบขึ้น of the PCSK9/LDL-R complex was blocked by 50% (IC50), the curves were fitted by nonlinear regression with a single-ตำแหน่ง binding แบบจำลอง according to c(PCSK.9)free
=c(PCSK9)tot/(1+c(ไลโปคาลิน มิวทีน)/IC50)), with the total tracer concentration c(PCSK9)tot and the IC50 value obtained above as free parameters. Curve fitting was performed using GraphPad Prism 4 software.

[00179] In summary, the negative control SEQ ID NO: 2 did not ยึดเกาะto PCSK9; in contrast, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 showed strong competitive binding to hPCSK9 and hPCSK9_D374Y mutant, when competed against hLDL-R. The fitted IC50 values are shown in Table 2 below as well as in Figure2 (A and B). Competitive mode of action for the ไลโปคาลิน มิวทีน (SEQ ID NO: 3, 4 and 6-9) was shown with both, wildtype and mutant PCSK9. The IC50 values in the competition ELISA using hPCSK.9are solely influenced by the fixed concentration of 25 nM. In the competition ELISA using 0.25 nM hPCSK9_D374Y mutant, IC50 values are affected by ไลโปคาลิน มิวทีน' แอฟฟินิตี้ as well as by the fixed mutant concentration.
[00180] Table 2:

+++
[00181] Example 8: Specificity and species crossreactivity of representative ไลโปคาลิน มิวทีน to PCSK9
[00182] Specificity and species crossreactivity (Figures 3 (A-D)) of ไลโปคาลิน มิวทีน was assayed in a binding ELISA, the principle of which was as follows: Biotinylated ลิแกนด์s
c
(ฮิวเมน PCSK9, human PCSK9_D374Y, mouse PCSK9, and ไซโนมอลกัส PCSK9) were

captured on นิวทราวิดิน-coated ELISA plates and variable concentrations of ไลโปคาลิน มิวทีน were added. Bound ไลโปคาลิน มิวทีน were detected with rabbit anti-Streptag II antibody (GenScript, Cat. No. A00626) and HRP-labeled anti-rabbit-IgG antibody (Jackson ImmunoResearch, Cat. No. 211-035-109).

[00183] In the following detailed experimental protocol, incubation and washing steps were performed as described above in the competition ELISA protocol of Example 7. A 384- well plate suitable for fluorescence measurements (Greiner FLUOTRAC™ 600, black flat bottom, high-binding) was coated with 20 µl ofนิวทราวิดิน at a concentration of 5 µg/ml in PBS over night at 4°C. After washing, the นิวทราวิดิน-coated wells were blocked with 100 µl blocking buffer (PBS-T/BSA) for 1 h at room temperature. After washing again, 20 µl biotinylated ลิแกนด์, either ฮิวเมน PCSK9, ฮิวเมน PCSK9.9_D374Y, mouse PCSK9 หรือ ไซโนมอลกัส PCSK.9,at a concentration of 1 µg/ml in PBS-T/BSA was added for 1 hat room temperature. Excess ลิแกนด์ was removed by a further washing step.

[00184] Concentration of ไลโปคาลิน มิวทีน solutions was adjusted to 100 nM and then solutions were serially diluted at a 1 :3 ratio down to 2 nM in PBS-T/BSA. A volume of 20 µl of the dilution was transferred to the 384-well plate and allowed to ยึดเกาะfor 1 h at room temperature.

[00185] After incubation, the residual supematants were discarded and 20 µl of the anti-Streptagll antibody in a 1 :5.000 dilution in PBS-T/BSA was added and incubated for 1 h at room temperature. Supematants were discarded again. To detect bound anti-Streptag II antibody, 20 µl of the mouse anti-rabbit IgG-HRP were added and incubated for 1 h at room temperature. After washing, 20 µl fluorogenic HRP substrate (Quantablue, Pierce) was added to each well, and the reaction was allowed to proceed for 15 min. The fluorescence intensity in relative fluorescence units (RFU) of every well on the plate was read using a Satire Microplate reader (Tecan). To obtain the ไลโปคาลิน มิวทีน concentration at which the maximum fluorescence signal is reached by 50% (EC50), the curves were fitted by nonlinear regression with a single-ตำแหน่ง binding แบบจำลอง according to RFU = RFUmax•c(ไลโปคาลิน มิวทีน)/(EC50+c(ไลโปคาลิน มิวทีน)), with the maximum relative fluorescenc RFUmax and the EC50 value as free parameters. Curve fitting was performed using GraphPad Prism 4 software.

(00186] In summary, binding of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 to ฮิวเมน PCSK9.9, ฮิวเมน PCSK9.9_D374Y mutant, mouse PCSK9 and ไซโนมอลกัส PCKS9 could be detected, whereas negative control SEQ ID NO: 2 showed no binding to any of these targets. The fitted EC50 values are shown in Table 3 below. The EC50 values for ฮิวเมน PCSK9.9 and ไซโนมอลกัส PCSK9 are comparable, showing that the ไลโปคาลิน มิวทีน are fully crossreactive with ไซโนมอลกัส มังกี้ PCSK9. แอฟฟินิตี้ to mouse PCSK9 are similar หรือ up to 10-fold lower while EC50 values for ฮิวเมน PCSK9 D374Y mutant are similar to those obtained for ฮิวเมน PCSK9.

[00187] Table 3:
+++

[00188] Example 9: ไลโปคาลิน มิวทีน mediated restorage of downregulation of

Dil-labeled LDL uptake in a cell-based assay


[00189] A cell-based assay was employed to demonstrate the ability of PCSK.9-binding ไลโปคาลิน มิวทีน (SEQ NO: 3, SEQ NO: 4, SEQ NO: 6, SEQ NO: 7 and SEQ NO: 8) to neutralize the PCSK9-mediated reduction of number of surface LDL-R molecules and in consequence restore downregulated LDL uptake in HepG2 cells. SEQ ID NO: 2 served as negative control.

[00190] In this regard, HepG2 cells were plated in a 96-well poly-d-lysine-coated plate (Greiner, 955946) at a density of 60,000 cells/well in 100 µI/well DMEM (PAN P04-045 l 0) containing 10% FCS (Fetal calf serum). After 24 h the medium was switched to DMEM containing 1 % FCS (100 µI/well). After 18 h the medium was removed and switched (without washing step) to 50 µ1 DMEM containing 20 µg/ml LDL-Bodipy® FL (Invitrogen, L3483) but without FCS. Serial 1 :2 dilution of ไลโปคาลิน มิวทีน starting at a concentration of 4000 nM was performed. One dilution series was prepared in DMEM containing 15 µg/ml PCSK.9 and another one, as a control, in pure DMEM. ไลโปคาลิน มิวทีน and PCSK9 were preincubated for 30 min. at room temperature and then 50 µ1 was added to the cells resulting in a final PCSK9 concentration of 100 nM. Total sample volume on the plate was 100 µI and all samples were measured in 5x replicates. Cells in DMEM without LDL and PCSK.9, DMEM with LDL and PCSK9, and DMEM with LDL but without PCSK9 were used as controls.

[00191] Plates with samples were incubated at 37°C for 6 h before cells were washed with PBS. Wells were filled with 100 µ1 PBS and fluorescence of cells was read at 485/535 nm using a BMG PheraStar reader.

[00192] To determine IC50 values the highest and the lowest value of the 5 replicates were excluded and the mean and standard deviation for each remaining data point was calculated. The curves were fitted by GraphPad Prism 4 using nonlinear regression “sigmoidal dose - response, variable slope” แบบจำลอง (5PL fit). Data were normalized by the value of stimulated and non-stimulated cells (cells with/without PCSK9). The fitted curves are shown in figure 4 and calculated IC50 values are summarized in Table 4 below.

+++
[00194] Example 10: แอฟฟินิตี้ of additional ไลโปคาลิน มิวทีน to PCSK9


[00195] To measure the binding แอฟฟินิตี้ of additional ไลโปคาลิน มิวทีน to biotinylated ฮิวเมน PCSK9 (hPCSK9-Bio), a Surface Plasmon Resonance (SPR) based assay was employed utilizing a Biacore T200 instrument (GE Healthcare). For the SPR แอฟฟินิตี้ assay (Figure S (A-C)), the Biotin CAPture ชุดอุปกรณ์ (GE Healthcare) was used.

[00196] In each measurement, cycle Biotin CAPture Reagent (GE Healthcare) was applied to the reference and measurement channels of Sensor Chip CAP (GE Healthcare) for
5 min at a flow rate of 2 µ1/min.hPCSK9-Bio at a concentration of 1 µg/ml was injected on the measurement channel for 2 min at a flow rate of 10 µl/min. To determine the แอฟฟินิตี้, three to four dilutions of ไลโปคาลิน มิวทีน of SEQ ID NO: 13-28 (see Table S) were prepared in HBS-EP+ buffer and applied to the chip surface, using concentrations of 128, 32,
8 and 2 nM for said มิวทีน. The binding assay was carried out with a contact time of 3 min, dissociation time of 15 min and applying a flow rate of 30 µ1/min. All measurements were performed at 25°C. Regeneration of the Sensor Chip CAP surface was achieved with an injection of 6 M กัวนิดีน-HCl with 0.25 M NaOH (2 min) followed by an extra wash with running buffer and a stabilization period of 2 min. Prior to the measurements,

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

incubated สำหรับ 1 หาดใหญ่ RT. หลังจากซักผ้า 20 µl QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase พื้นผิวถูกเพิ่มในแต่ละบ่อและ fluorescence ที่เป็นวัดที่มีความยาวคลื่นในการกระตุ้นของ 320 nm และความยาวคลื่นการเล็ดรอดของ 430 nM หลังจาก 15 นาทีใช้บวก GENios แผ่นอ่าน (Tecan)[00178] ดำเนินการประเมินเป็นดังนี้: ฟรีหรือ hPCSK9 hPCSK.9_D374Y สมาธิกลายพันธุ์ c (hPCSK9) ฟรีฟรีฉัน c (hPCSK9_D374Y) คำนวณจากสัญญาณ fluorescence ญาติ ใช้เส้นโค้งมาตรฐานกำหนดขนาน และพล็อตเทียบกับไลโปคาลินมิวทีนความเข้มข้น c (ลำดับ ID ไม่: 3 เลขรหัสลำดับ: 4 ไม่มีรหัสของลำดับ: 6 ลำดับ ID ไม่: 7 ไม่มีรหัสของลำดับ: แอนติบอดี 8 หรือเกณฑ์มาตรฐานของลำดับ ID ไม่: 29 และไม่มีรหัสของลำดับ: 33) เพื่อให้ได้ความเข้มข้นมิวทีนไลโปคาลินที่ว่าการประกอบขึ้น PCSK9/LDL-R คอมเพล็กซ์ถูกบล็อก โดย 50% (IC50), เส้นโค้งถูกติดตั้ง โดยถดถอยไม่เชิงเส้นกับการแบบจำลองรวมตำแหน่งเดียวตาม c (PCSK.9) ฟรี= c (PCSK9) ทีโอที / (1 + c(ไลโปคาลิน มิวทีน)/IC50)), รวมติดตามความเข้มข้น c (PCSK9) ทีโอทีและค่า IC50 ได้กล่าวเป็นพารามิเตอร์ฟรี เส้นโค้งกระชับที่ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad ปริซึม 4สรุปใน [00179] ควบคุมลบเลขลำดับ ID: 2 ได้ไม่ ยึดเกาะto PCSK9 ในความคมชัด ไม่มีรหัสของลำดับ: 3 เลขรหัสลำดับ: 4 ลำดับ ID ไม่: 6 ลำดับ ID ไม่: 7 และเลขรหัสลำดับ: 8 พบเมื่อร่วมแข่งขันกับอาร์ hLDL ผูกแข็งแรงแข่งขันกับ mutant hPCSK9 และ hPCSK9_D374Y ค่า IC50 จัดแสดงในตารางที่ 2 ข้างล่างเช่นใน Figure2 (A และ B) โหมดการแข่งขันของการดำเนินการสำหรับไลโปคาลินมิวทีน (ลำดับ ID ไม่: 3, 4 และ 6-9) ได้แสดงทั้ง wildtype และ mutant PCSK9 ค่า IC50 ในการแข่งขันผล ELISA ที่ใช้ hPCSK.9are แต่เพียงผู้เดียว โดยความเข้มข้นคงที่ 25 nM ในการแข่งขันใช้ 0.25 nM hPCSK9_D374Y mutant ELISA ค่า IC50 ได้รับผลกระทบ โดยไลโปคาลินมิวทีน' แอฟฟินิตี้เป็นดีเป็น โดยความเข้มข้นการกลายพันธุ์ถาวร [00180] ตารางที่ 2:+++[00181] ตัวอย่าง 8: Specificity และพันธุ์ crossreactivity ของพนักงานไลโปคาลินมิวทีนถึง PCSK9[00182] specificity และพันธุ์ crossreactivity (ตัวเลข 3 (A-D)) ของไลโปคาลินมิวทีนถูก assayed ในการผูกข้อมูล ELISA หลักซึ่งมีดังนี้: Biotinylated ลิแกนด์sc(ฮิวเมน PCSK9, PCSK9_D374Y มนุษย์ เมาส์ PCSK9 และไซโนมอลกัส PCSK9) ได้จับบนเคลือบนิวทราวิดิน ELISA แผ่น และมีเพิ่มตัวแปรความเข้มข้นของไลโปคาลินมิวทีน มิวทีนไลโปคาลินผูกพบกับกระต่ายป้องกัน Streptag II แอนติบอดี (GenScript แมว ไม่ใช่ A00626) และป้าย HRP ป้องกัน-rabbit-IgG แอนติบอดี (Jackson ImmunoResearch แมว หมายเลข 211-035-109)[00183] ต่อไปนี้รายละเอียดทดลองโพรโทคอ คณะทันตแพทยศาสตร์และการล้างขั้นตอนดำเนินตามที่อธิบายไว้ข้างต้นในโพรโทคอล ELISA การแข่งขันของ 7 อย่างนี้ เหมาะสำหรับวัด fluorescence (Greiner FLUOTRAC ™ 600 ก้นดำ สูงผูก) 384-ดีจานถูกเคลือบ ด้วย 20 µl ofนิวทราวิดิน ที่ความเข้มข้นของไมโครกรัมเป็นเครื่อง 5 ml ใน PBS ผ่านคืนที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจากซักผ้า บล็อกบ่อเคลือบนิวทราวิดิน 100 µl บล็อกบัฟเฟอร์ (PBS-T/บี เอสเอ) สำหรับ h 1 ที่อุณหภูมิห้อง หลังจากซักผ้าอีก 20 µl biotinylated ลิแกนด์ ฮิวเมนทั้ง PCSK9 ฮิวเมน PCSK9.9_D374Y เมาส์ PCSK9 หรือไซโนมอลกัส PCSK.9,at ที่เพิ่มความเข้มข้นของไมโครกรัมเป็นเครื่อง 1 ml ใน PBS-T/บี เอสเอในอุณหภูมิห้อง 1 หาดใหญ่ ลิแกนด์ส่วนเกินถูกเอาออก โดยการซักผ้าเพิ่มเติมขั้นตอนการมีการปรับปรุงความเข้มข้น [00184] ไลโปคาลินมิวทีนโซลูชั่น 100 nM และโซลูชั่นถูก serially diluted ที่อัตรา 1:3 ลงไป 2 nM ใน PBS-T/บี เอสเอ ปริมาตรของ 20 µl ของเจือจางที่ถูกโอนย้ายไปจาน 384-ดี และอนุญาตให้ ยึดเกาะfor h 1 ที่อุณหภูมิห้อง[00185] หลังจากคณะทันตแพทยศาสตร์ supematants ส่วนที่เหลือได้ถูกละทิ้ง และ 20 µl ของแอนติบอดีต่อต้าน Streptagll ในแบบ 1:5.000 เจือจางใน PBS-T/บี เอสเอเพิ่ม และ incubated สำหรับ h 1 ที่อุณหภูมิห้อง Supematants ได้ถูกยกเลิกอีกครั้ง การตรวจหาแอนติบอดีต่อต้าน-Streptag ผูก II, 20 µl เมาส์ป้องกันกระต่าย IgG HRP ถูกเพิ่ม และ incubated สำหรับ h 1 ที่อุณหภูมิห้อง หลังจากซักผ้า 20 µl fluorogenic HRP พื้นผิว (Quantablue เพียร์ซ) ถูกเพิ่มเข้าไปด้วยแต่ละ และปฏิกิริยาที่ได้รับอนุญาตให้ดำเนินต่อใน 15 นาที ความเข้ม fluorescence ในหน่วยสัมพัทธ์ fluorescence (RFU) ดีทุกในจานถูกอ่านโดยใช้ตัวอ่าน Microplate เสียดสี (Tecan) เพื่อให้ได้ความเข้มข้นมิวทีนไลโปคาลินที่ถึงสัญญาณ fluorescence สูงสุด 50% (EC50), เส้นโค้งถูกติดตั้ง โดยถดถอยไม่เชิงเส้นกับแบบจำลองผูกกับตำแหน่งเดียวตาม RFU = RFUmax•c (ไลโปคาลินมิวทีน) / (EC50 + c (ไลโปคาลินมิวทีน)), fluorescenc สัมพัทธ์สูงสุด RFUmax และค่า EC50 เป็นพารามิเตอร์ฟรี เส้นโค้งกระชับที่ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad ปริซึม 4(00186] ในสรุป รวมลำดับ ID NO: 3 ลำดับ ID NO: 4 ลำดับ ID NO: 5 ลำดับ ID NO: 6 ลำดับ ID NO: 7 ลำดับ ID NO: 8 และลำดับ ID NO: 9 ฮิวเมน PCSK9.9 ฮิวเมน PCSK9.9_D374Y mutant เมาส์ PCSK9 ไซโนมอลกัสและ PCKS9 พบ ในขณะที่ไม่มีรหัสควบคุมลบลำดับ: 2 พบไม่ผูกพันใด ๆ เป้าหมายเหล่านี้ได้ ค่า EC50 จัดแสดงในตารางที่ 3 ด้านล่าง ค่า EC50 ของฮิวเมน PCSK9.9 และไซโนมอลกัส PCSK9 เทียบได้ แสดงว่า ไลโปคาลินมิวทีนมีพร้อม crossreactive กับไซโนมอลกัสมังกี้ PCSK9 แอฟฟินิตี้กับเมาส์ PCSK9 มีหรือคล้ายถึงล่าง 10-fold ค่า EC50 mutant PCSK9 D374Y ฮิวเมนจะคล้ายกับได้ฮิวเมน PCSK9[00187] ตาราง 3:+++ [00188] ตัวอย่าง 9: ไลโปคาลินมิวทีน mediated restorage downregulation ของป้าย Dil LDL ที่ดูดซับในการวิเคราะห์ที่ใช้เซลล์ทดสอบใช้เซลล์ A [00189] ถูกจ้างงานแสดงให้เห็นถึงความสามารถของมิวทีนไลโปคาลิน PCSK.9 ผูก (เลขลำดับ: 3 เลขลำดับ: 4 ลำดับเลข: 6 เลขลำดับ: 7 และเลขลำดับ: 8) การแก้จำนวนพื้นผิวโมเลกุล LDL R ลด PCSK9 mediated ในผล ดูดซับ downregulated LDL ในเซลล์ HepG2 ลำดับ ID ไม่: 2 ทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมค่าลบ[00190] ในการนี้ เซลล์ HepG2 ถูกชุบดี 96 โพลีดีแอล-ไลซีนเคลือบจาน (Greiner, 955946) ที่ความหนาแน่นของ 60000 เซลล์/ดีใน µI 100 ดี DMEM (PAN P04-045 l 0) ประกอบด้วย 10% FCS (เซรั่มลูกครรภ์) หลังจาก 24 ชม สื่อถูกสลับไปยัง DMEM ประกอบด้วย 1% FCS (100 µI/ดี) หลังจาก 18 h สื่อถูกเอาออก และสลับ (โดยขั้นตอนการซักผ้า) µ1 50 DMEM ประกอบด้วยไมโครกรัมเป็นเครื่อง 20 ml LDL Bodipy ® FL (Invitrogen, L3483) แต่ไม่ มี FCS ลำดับการเจือจาง 1:2 ของมิวทีนไลโปคาลินราคาเริ่มต้นที่ความเข้มข้นของ 4000 nM ที่ดำเนินการ ชุดหนึ่งเจือจางที่เตรียมใน DMEM ไมโครกรัมเป็นเครื่อง 15 ml PCSK.9 และอีกหนึ่ง เป็นตัวควบคุม DMEM บริสุทธิ์ ไลโปคาลินมิวทีนและ PCSK9 ได้ preincubated ใน 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง และ 50 µ1 ถูกเพิ่มไปยังเซลล์ในความเข้มข้น PCSK9 สุดท้าย 100 nM ปริมาตรตัวอย่างทั้งหมดในจานมี 100 µI และตัวอย่างทั้งหมดที่วัดเหมือนกับ x 5 เซลล์ใน DMEM ไม่ มี LDL และ PCSK.9, DMEM กับ LDL และ PCSK9 และ DMEM กับ LDL แต่ไม่ มี PCSK9 ถูกใช้เป็นตัวควบคุมแผ่น [00191] ด้วยตัวอย่างที่ incubated ที่ 37° C สำหรับ 6 h ก่อนเซลล์ถูกล้าง ด้วย PBS บ่อเต็มไป ด้วย 100 µ1 PBS และ fluorescence ของเซลล์ถูกอ่านที่ 485/535 นาโนเมตรที่ใช้อ่าน BMG PheraStar[00192] กำหนด IC50 ค่าสูงสุด และค่าต่ำสุดของ 5 เหมือนกับถูกแยกออก และคำนวณค่าเฉลี่ยและส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานในแต่ละจุดข้อมูลที่เหลือ เส้นโค้งถูกติดตั้ง โดย GraphPad ปริซึม 4 ใช้ถดถอยไม่เชิงเส้น "sigmoidal ยา - ตอบสนอง ความชันตัวแปร" แบบจำลอง (5PL พอดี) ข้อมูลได้ตามปกติตามค่าของเซลล์ขาวกระตุ้น และไม่ถูกกระตุ้น (เซลล์ กับ/โดย PCSK9) เส้นโค้งที่จัดแสดงในรูปที่ 4 และคำนวณค่า IC50 ได้สรุปไว้ในตาราง 4 ด้านล่าง+++ 10 อย่าง [00194]: แอฟฟินิตี้ของไลโปคาลินเพิ่มเติมมิวทีนเพื่อ PCSK9[00195] วัดแอฟฟินิตี้รวมของไลโปคาลินเพิ่มเติมมิวทีนเพื่อ biotinylated ฮิวเมน PCSK9 (hPCSK9-ชีวภาพ), วิเคราะห์ผิว Plasmon การสั่นพ้อง (คอฟฟี่ช็อป/) โดยมีพนักงานใช้เครื่องมือ Biacore T200 (GE สุขภาพ) สำหรับคอฟฟี่ช็อป/แอฟฟินิตี้ assay (รูป S (A-C)), มีใช้ชุดอุปกรณ์จับไบโอติน (GE สุขภาพ)[00196] ในแต่ละการประเมิน ไบโอตินจับรีเอเจนต์ (GE สุขภาพ) วงจรใช้สถานีวัดและอ้างอิงของเซ็นเซอร์ชิหมวก (GE สุขภาพ) สำหรับ5 นาทีที่อัตราการไหลของ 2 µ1/min.hPCSK9-ชีวภาพที่เข้มข้นของมล 1 ไมโครกรัมเป็นเครื่องถูกฉีดบนสถานีวัดใน 2 นาทีที่อัตราการไหล 10 µl/นาที การกำหนดแอฟฟินิตี้ dilutions 3-4 ของมิวทีนไลโปคาลินของลำดับ ID ไม่: 13-28 (ดูตาราง S) ถูกเตรียมใน HBS-EP + บัฟเฟอร์ และใช้พื้นผิว ชิใช้ความเข้มข้นของ 128, 328 และ 2 nM สำหรับมิวทีนกล่าวว่า วิเคราะห์ผูกถูกดำเนินเวลาติดต่อนาที 3, dissociation เวลา 15 นาทีและใช้อัตราการไหลของ µ1 30 นาที ดำเนินการประเมินทั้งหมดที่ 25 องศาเซลเซียส ฟื้นฟูผิวหมวกเซนเซอร์ชิสำเร็จกับฉีดของ HCl กัวนิดีน 6 M กับ 0.25 M NaOH (2 นาที) ตาม ด้วยการซักเพิ่มเติมบัฟเฟอร์และเสถียรภาพระยะเวลา 2 นาทีก่อนการวัด

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

บ่มเป็นเวลา 1 หมวก RT หลังจากล้าง 20 ไมโครลิตร QuantaBlu แจงเปอร์ออกซิเดพื้นผิวถูกบันทึกอยู่ในแต่ละดีและเรืองแสงได้รับการวัดที่ความยาวคลื่นกระตุ้น 320 นาโนเมตรและความยาวคลื่นปล่อย 430 นาโนเมตรหลังจาก 15 นาทีโดยใช้ GENios พลัสอ่านแผ่น (Tecan). [00178] ที่ การประเมินผลการดำเนินการดังต่อไปนี้: hPCSK9 ฟรีหรือ hPCSK.9_D374Y เข้มข้นกลายพันธุ์ค (hPCSK9) ฟรีฉัน c (hPCSK9_D374Y) ฟรีที่คำนวณได้จากสัญญาณการเรืองแสงญาติ โดยใช้เส้นโค้งมาตรฐานที่กำหนดไว้ในแบบขนานและพล็อตเมื่อเทียบกับไลโปคาลินมิวทีนเข้มข้นค (SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 หรือแอนติบอดีมาตรฐานของ SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 33) การขอรับไลโปคาลินมิวทีนเข้มข้นที่การประกอบขึ้นของ PCSK9 / LDL-R ที่ซับซ้อนถูกบล็อกโดย 50% (IC50) เส้นโค้งพอดีโดยการถดถอยเชิงเส้นเดียวกับตำแหน่งที่มีผลผูกพันแบบจำลอง ตามค (PCSK.9) ฟรี= c (PCSK9) ทีโอที / (1 ​​+ C (ไลโปคาลินมิวทีน) / IC50)) ที่มีความเข้มข้นครอยรวม (PCSK9) ทีโอทีและค่า IC50 ที่ได้รับดังกล่าวข้างต้นเป็นพารามิเตอร์ฟรี ปรับเส้นโค้งได้รับการดำเนินการโดยใช้ปริซึม GraphPad 4 ซอฟแวร์. [00179] โดยสรุปการควบคุมเชิงลบ SEQ ID NO: 2 ไม่ได้ยึดเกาะเพื่อ PCSK9; ในทางตรงกันข้าม, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 และ SEQ ID NO: 8 แสดงให้เห็นความแข็งแกร่งในการแข่งขันที่จะมีผลผูกพันและกลายพันธุ์ hPCSK9 hPCSK9_D374Y เมื่อแข่งขันกับ hLDL-R ค่า IC50 ติดตั้งแสดงในตารางที่ 2 ด้านล่างเช่นเดียวกับใน Figure2 (A และ B) โหมดการแข่งขันของการดำเนินการสำหรับไลโปคาลินมิวทีน (SEQ ID NO: 3, 4 และ 6-9) ถูกนำมาแสดงที่มีทั้งสอง wildtype และ PCSK9 กลายพันธุ์ ค่า IC50 ในการแข่งขันโดยใช้วิธี ELISA hPCSK.9are อิทธิพล แต่เพียงผู้เดียวโดยความเข้มข้นคงที่ 25 นาโนเมตร ในการแข่งขันโดยใช้วิธี ELISA 0.25 นาโนเมตรกลายพันธุ์ hPCSK9_D374Y ค่า IC50 รับผลกระทบจากไลโปคาลินมิวทีน 'แอฟฟินิตี้เช่นเดียวกับความเข้มข้นกลายพันธุ์คงที่. [00180] ตารางที่ 2: +++ [00181 ] ตัวอย่างที่ 8: ความจำเพาะและพันธุ์ crossreactivity ตัวแทนไลโปคาลินมิวทีนที่จะ PCSK9 [00182] จำเพาะและพันธุ์ crossreactivity (รูปที่ 3 (AD)) ของไลโปคาลินมิวทีนได้รับการวิเคราะห์ในผลผูกพัน วิธี ELISA หลักการซึ่งได้ดังนี้ biotinylated ลิแกนด์ s ค(ฮิวเมน PCSK9, PCSK9_D374Y มนุษย์ PCSK9 เมาส์และไซโนมอลกัส PCSK9) ถูกจับในนิวทราวิดินเคลือบแผ่นวิธี ELISA และความเข้มข้นของตัวแปรของไลโปคาลินมิวทีนที่ถูกเพิ่ม Bound ไลโปคาลินมิวทีนที่ตรวจพบกับกระต่ายต่อต้าน Streptag แอนติบอดีที่สอง (เจนสคริปต์, แมว. ฉบับที่ A00626) และ HRP ติดฉลากแอนติบอดีต่อต้านกระต่าย IgG (แจ็คสัน ImmunoResearch แมว. หมายเลข 211-035- 109). [00,183] ในการทดลองต่อไปนี้โปรโตคอลรายละเอียดและขั้นตอนการบ่มซักผ้าได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ข้างต้นในโปรโตคอล ELISA แข่งขันตัวอย่าง 7. แผ่นเดียว 384- เหมาะสำหรับการตรวจวัดการเรืองแสง (Greiner FLUOTRAC ™ 600, สีดำด้านล่างแบน มีผลผูกพันสูง) ถูกเคลือบด้วย 20 ไมโครลิตรของนิวทราวิดินที่ความเข้มข้น 5 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรในพีบีเอสในช่วงคืนที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจากล้างที่นิวทราวิดินเคลือบหลุมถูกบล็อกด้วย 100 ไมโครลิตรปิดกั้นกันชน (PBS-T / บีเอสเอ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หลังจากล้างอีกครั้ง 20 ไมโครลิตรไบโอตินลิแกนด์ทั้งฮิวเมน PCSK9, ฮิวเมน PCSK9.9_D374Y, PCSK9 เมาส์หรือไซโนมอลกัส PCSK.9 ที่ความเข้มข้น 1 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรในพีบีเอส-T / การ บีเอสเอถูกเพิ่มเข้ามา 1 หมวกอุณหภูมิห้อง ส่วนเกินลิแกนด์ถูกลบออกโดยขั้นตอนการซักผ้าต่อไป. [00184] ความเข้มข้นของไลโปคาลินมิวทีโซลูชั่นนมีการปรับถึง 100 นาโนเมตรและจากนั้นการแก้ปัญหาที่ถูกปรับลดเป็นลำดับที่ 1: 3 อัตราส่วนลงไป 2 นาโนเมตรในพีบีเอส -T / บีเอสเอ ปริมาณ 20 ไมโครลิตรของการเจือจางที่ถูกถ่ายโอนไปยังแผ่น 384 เป็นอย่างดีและได้รับอนุญาตให้ยึดเกาะเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง. [00185] หลังจากการบ่มที่ supematants ที่เหลือถูกทิ้งและ 20 ไมโครลิตรของแอนติบอดีต่อต้าน Streptagll ใน 1: 5.000 เจือจางในพีบีเอส-T / บีเอสเอถูกบันทึกและบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง Supematants ถูกโยนทิ้งอีกครั้ง ในการตรวจสอบป้องกัน Streptag แอนติบอดีครั้งที่สองที่ถูกผูกไว้ 20 ไมโครลิตรเมาส์ต่อต้านกระต่าย IgG-HRP ที่ถูกเพิ่มเข้ามาและบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หลังจากล้าง 20 ไมโครลิตรแจงพื้นผิว HRP (Quantablue เพียร์ซ) ถูกบันทึกอยู่ในแต่ละดีและปฏิกิริยาที่ได้รับอนุญาตให้ดำเนินการต่อไปเป็นเวลา 15 นาที ความเข้มของแสงเรืองแสงในหน่วยญาติ (RFU) ของทุกอย่างดีในจานที่ถูกอ่านได้โดยใช้เครื่องอ่านถ้อยคำไมโคร (Tecan) การขอรับไลโปคาลินมิวทีนเข้มข้นที่สัญญาณการเรืองแสงได้สูงสุดถึง 50% (EC50) เส้นโค้งพอดีโดยการถดถอยเชิงเส้นเดียวกับตำแหน่งที่มีผลผูกพันแบบจำลองตาม RFU = RFUmax •ค (ไลโปคาลินมิวทีน) / (EC50 + C (ไลโปคาลินมิวทีน)) กับญาติสูงสุด fluorescenc RFUmax และความคุ้มค่า EC50 เป็นพารามิเตอร์ฟรี ปรับเส้นโค้งได้รับการดำเนินการโดยใช้ปริซึม GraphPad 4 ซอฟแวร์. (00186] โดยสรุปผลผูกพันของ SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 และ SEQ ID NO: 9 ฮิวเมน PCSK9.9, ฮิวเมน PCSK9.9_D374Y กลายพันธุ์ PCSK9 เมาส์และไซโนมอลกัส PCKS9 สามารถตรวจพบในขณะที่การควบคุมเชิงลบ SEQ ID NO: 2 พบว่าไม่มีผลผูกพัน ใด ๆ ของเป้าหมายเหล่านี้. ค่าติดตั้ง EC50 แสดงในตารางที่ 3 ด้านล่าง. ค่า EC50 สำหรับฮิวเมน PCSK9.9 และไซโนมอลกัส PCSK9 จะเปรียบแสดงให้เห็นว่าไลโปคาลินมิวทีน อย่างเต็มที่ crossreactive กับไซโนมอลกัสมังกี้ PCSK9. แอฟฟินิตี้ที่จะ PCSK9 เมาส์ที่มีความคล้ายคลึงหรือได้ถึง 10 เท่าต่ำกว่าในขณะที่ EC50 ค่าสำหรับฮิวเมน PCSK9 กลายพันธุ์ D374Y จะคล้ายกับที่ได้รับสำหรับฮิว เมน PCSK9. [00187] ตารางที่ 3: +++ [00,188] ตัวอย่าง 9: ไลโปคาลินมิวทีนพึ่ง restorage ของ downregulation ของการดูดซึมLDL ดิลที่มีข้อความในการทดสอบมือถือที่ใช้[00189] เซลล์ที่ใช้ ทดสอบถูกจ้างมาเพื่อแสดงให้เห็นถึงความสามารถของ PCSK.9 ผูกพันไลโปคาลินมิวทีน (SEQ NO: 3, SEQ NO: 4, SEQ NO: 6 SEQ NO: 7 และ SEQ NO: 8) ที่จะต่อต้าน การลด PCSK9 พึ่งจำนวนโมเลกุลของผิว LDL-R และผลในการคืนค่าการดูดซึม LDL downregulated ในเซลล์ HepG2 SEQ ID NO: 2 ทำหน้าที่ควบคุมเชิงลบ. [00,190] ในเรื่องนี้เซลล์ HepG2 ถูกชุบใน 96 หลุมแผ่นโพลี D-ไลซีนเคลือบ (เกรนเนอร์, 955946) ความหนาแน่น 60,000 เซลล์ / ดีใน 100 μI / ดี DMEM (PAN P04-045 ลิตร 0) ที่มี 10% FCS (ซีรั่มของทารกในครรภ์น่อง) หลังจาก 24 ชั่วโมงขนาดกลางที่ถูกเปลี่ยนไป DMEM ที่มี 1% FCS (100 μI / กัน) 18 ชั่วโมงหลังจากที่สื่อจะถูกลบออกและเปลี่ยน (โดยขั้นตอนการซักผ้า) 50 μ1 DMEM ที่มี 20 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร LDL-Bodipy®ลอริด้า (Invitrogen, L3483) แต่ไม่มี FCS อนุกรม 1: 2 ลดสัดส่วนของไลโปคาลินมิวทีนเริ่มต้นที่ความเข้มข้นของ 4000 นาโนเมตรได้รับการดำเนินการ หนึ่งชุดเจือจางถูกจัดทำขึ้นใน DMEM ที่มี 15 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร PCSK.9 และอีกคนหนึ่งเป็นตัวควบคุมใน DMEM บริสุทธิ์ ไลโปคาลินมิวทีนและ PCSK9 ถูก preincubated เป็นเวลา 30 นาที ที่อุณหภูมิห้องแล้ว 50 μ1ถูกบันทึกอยู่ในเซลล์ที่เกิดขึ้นในความเข้มข้น PCSK9 สุดท้ายของ 100 นาโนเมตร ปริมาณตัวอย่างบนแผ่นรวมเป็น 100 μIและตัวอย่างทั้งหมดอยู่ในวัดซ้ำ 5x เซลล์ใน DMEM โดยไม่ต้อง LDL และ PCSK.9, DMEM ที่มีระดับ LDL และ PCSK9 และ DMEM ที่มีระดับ LDL แต่ไม่มี PCSK9 ถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุม. [00191] แผ่นกับกลุ่มตัวอย่างได้รับการบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 6 ชั่วโมงก่อนที่เซลล์ถูกล้างด้วยพีบีเอส เวลส์เต็มไปด้วย 100 μ1พีบีเอสและการเรืองแสงของเซลล์ได้อ่านที่ 485/535 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านสบาย PheraStar. [00192] การตรวจสอบค่า IC50 ค่าสูงสุดและต่ำสุดของ 5 ซ้ำและได้รับการยกเว้นค่าเฉลี่ยและค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน แต่ละจุดข้อมูลที่เหลือที่คำนวณได้ เส้นโค้งพอดีโดยปริซึม GraphPad 4 โดยใช้การถดถอยเชิงเส้น "ยา sigmoidal - ตอบสนองความลาดชันตัวแปร" แบบจำลอง (5PL พอดี) ข้อมูลปกติโดยมูลค่าของการกระตุ้นและไม่กระตุ้นเซลล์ (เซลล์มี / ไม่มี PCSK9) เส้นโค้งติดตั้งจะแสดงในรูปที่ 4 และคำนวณค่า IC50 ได้สรุปไว้ในตารางที่ 4 ด้านล่าง. +++ [00,194] ตัวอย่างที่ 10: แอฟฟินิตี้ของเพิ่มเติมไลโปคาลินมิวทีนที่จะ PCSK9 [00195] เพื่อ ตรวจจับแอฟฟินิตี้ของเพิ่มเติมไลโปคาลินมิวทีนที่จะไบโอตินฮิวเมน PCSK9 (hPCSK9 ไบโอ) ซึ่งเป็นพื้นผิว Plasmon Resonance (SPR) ทดสอบตามถูกจ้างมาใช้เป็นเครื่องมือ Biacore T200 (GE Healthcare ) สำหรับ SPR แอฟฟินิตี้ทดสอบ (รูปที่ S (AC)) ที่ไบโอตินจับภาพชุดอุปกรณ์ (GE Healthcare) ถูกนำมาใช้. [00,196] ในการวัดแต่ละวงจรไบโอตินจับภาพ Reagent (GE Healthcare) ถูกนำไปใช้อ้างอิงและ ช่องการวัดเซนเซอร์ CAP ชิป (GE Healthcare) สำหรับ5 นาทีที่อัตราการไหล 2 μ1 / min.hPCSK9 ไบโอที่ความเข้มข้น 1 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรฉีดในช่องทางวัดเป็นเวลา 2 นาทีในอัตราการไหลของ 10 ไมโครลิตร / นาที เพื่อตรวจสอบแอฟฟินิตี้, 03:57 เจือจางของไลโปคาลินมิวทีนของ SEQ ID NO: 13-28 (ดูตาราง S) ได้จัดทำขึ้น HBS-EP + กันชนและนำไปใช้กับพื้นผิวของชิป โดยใช้ความเข้มข้น 128, 32, 8 และ 2 นาโนเมตรสำหรับกล่าวว่ามิวทีน การวิเคราะห์ผลผูกพันได้รับการดำเนินการที่มีเวลาเป็นเพื่อนกับ 3 นาทีเวลาของการแยกตัวออก 15 นาทีและการใช้อัตราการไหล 30 μ1 / นาที วัดทั้งหมดได้ดำเนินการที่ 25 ° C การฟื้นฟูของพื้นผิวเซนเซอร์ CAP ชิปก็ประสบความสำเร็จด้วยการฉีด 6 M กัวนิดีน -HCl 0.25 M NaOH (2 นาที) ตามด้วยการล้างเป็นพิเศษกับการทำงานบัฟเฟอร์และระยะเวลาการรักษาเสถียรภาพของ 2 นาที ก่อนที่จะมีการวัดที่

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

1 ) หมวก RT . หลังจากซัก 20 µผม quantablu fluorogenic peroxidase ( เพิ่ม กันและการวัดที่ความยาวคลื่น 320 nm และกระตุ้นการปล่อยความยาวคลื่น 430 nm หลัง 15 นาที ใช้ genios พลัสอ่านป้าย ( TECAN )

[ 00178 ] การประเมินผลการปฏิบัติ ดังนี้ ฟรี hpcsk9 ค็อคที่ hpcsk .9_d374y กลายพันธุ์ความเข้มข้น C ( hpcsk9 ) ฟรีฉัน C ( hpcsk9_d374y ) ฟรีคำนวณจากสัญญาณฟลูออเรสเซนต์สัมพัทธ์ การใช้เส้นโค้งมาตรฐานกำหนดในแบบขนานและวางแผนกับไลโปคาลินมิวทีนความเข้มข้น , C ( seq id ไม่ : 3 , seq id : 4 , seq id : 6 , seq id : 7 , seq id ไม่มี : 8 , ค็อคมาตรฐานแอนติบอดีของ seq ไม่มี ID : 29 ไม่มี seq id : 33 )เพื่อให้ได้ไลโปคาลินมิวทีนความเข้มข้นที่การประกอบขึ้นของ pcsk9 / ldl-r ซับซ้อนถูกบล็อกโดย 50% ( ic50 ) เส้นโค้งถูกติดตั้งโดยการถดถอยเชิงเส้นกับเดียว - ตำแหน่งผูกแบบจำลองตาม C ( pcsk . 9 ) ฟรี
= C ( pcsk9 ) ทีโอที / ( 1 C ( ไลโปคาลินมิวทีน ) / ic50 ) )ด้วยทั้งหมดติดตามความเข้มข้น C ( pcsk9 ) ทีโอที และ ic50 มูลค่าที่ได้รับข้างต้นเป็นพารามิเตอร์อิสระ เส้นโค้งแสดงการใช้ graphpad ปริซึม 4 ซอฟต์แวร์

[ 00179 ] สรุป ลบ seq ควบคุมไม่มี ID : 2 ไม่ได้ยึดเกาะเพื่อ pcsk9 ; ในทางตรงกันข้าม , seq id ไม่ : 3 , seq id ไม่มี seq id : 4 : 6 : 7 และ seq id ไม่มี seq id ไม่ :8 มีการแข่งขันที่แข็งแกร่งและผูก hpcsk9 hpcsk9_d374y กลายพันธุ์ ตอนที่แข่งกับ hldl-r. ติดตั้ง ic50 ค่าแสดงในตารางที่ 2 ด้านล่าง เป็นภาพที่ 2 ( A และ B ) โหมดการแข่งขันของการดำเนินการสำหรับไลโปคาลินมิวทีน ( seq id : 3 , 4 และ 6-9 ) แสดงกับทั้งสองและ pcsk9 wildtype กลายพันธุ์ . การ ic50 ค่านิยมในการแข่งขัน ELISA โดยใช้ hpcsk .9are แต่เพียงผู้เดียวที่ได้รับอิทธิพลจากคงที่ ความเข้มข้น 25 นาโนเมตร ในการแข่งขัน ELISA โดยใช้ 0.25 nm hpcsk9_d374y กลายพันธุ์ ic50 ค่า ได้รับผลกระทบจากไลโปคาลินมิวทีน ' แอฟฟินิตี้เช่นเดียวกับคงกลายพันธุ์ สมาธิ ตารางที่ 2 : 00180
[ ]


[ 00181 ] ตัวอย่าง 8 : ความจำเพาะและชนิด crossreactivity ของตัวแทนไลโปคาลินมิวทีนเพื่อ pcsk9
[ 00182 ] ความจำเพาะและชนิด crossreactivity ( ตัวเลข 3 ( AD ) ของไลโปคาลินมิวทีนซีรั่มในการจับ Elisa , หลักการซึ่งเป็นดังนี้ : ไลลิแกนด์ S
C
( ฮิวเมน pcsk9 pcsk9_d374y , มนุษย์ , pcsk9 เมาส์ และไซโนมอลกัส pcsk9 )

- วิธีนิวทราวิดินตัวเคลือบแผ่นและแปรความเข้มข้นของไลโปคาลินมิวทีนถูกเพิ่ม ผูกไลโปคาลินมิวทีนตรวจพบแอนติบอดีต่อต้านกับ streptag II กระต่าย ( genscript , แมว ไม่ a00626 ) และแอนติบอดี IgG anti HRP ระบุว่ากระต่าย ( แจ็คสัน immunoresearch , แมว ไม่ 211-035-109 )

[ 00183 ] ในต่อไปนี้รายละเอียดการทดลองพิธีสารการบ่มและขั้นตอนการล้าง มีการปฏิบัติที่อธิบายไว้ข้างต้นในการแข่งขัน ) โปรโตคอลของตัวอย่าง 7 มี 384 - จานเหมาะสำหรับการวัดการเรืองแสง ( ไกรเนอร์ fluotrac ™ 600 สีดำ ด้านล่างแบนสูง ผูกพัน ) ถูกเคลือบด้วยµ 20 ลิตรนิวทราวิดินที่ความเข้มข้น 5 µ g / ml ใน PBS ผ่านคืนที่ 4 องศา หลังจากซัก