Example 2: DPPIV ActivityTissue fro

Example 2: DPPIV Activity
Tissue from the jejunum and colon of rats fed according to Example 1 was quantified
for ไดเปปทิดิล เปปทิเดส IV (DPPIV) activity using a commercial kit (Kit BML-AK498, ENZO 20 Life Sciences, USA). Tissue samples (50 mg) were homogenised in Tris (100 mM, pH 8)
and quantified by the addition of Gly-Pro-4-Nitroanilide (Sigma) >ไดเปปทิดิล เปปทิเดส>Gly-
Pro + p-Nitroaniline incubated in Tris (100 mM, pH 8) for 15 minutes at 37 °C. The reaction
was stopped with acetate buffer (1M, pH 4.2) and the absorbance read in a plate reader at
405 nm and compared to a reference standard curve (Sigma) to calculate activity. One unit produces 1.0 mM of 4-Nitroaniline from Gly-Pro-4-nitroaniline per minute in 0.1 M Trls/HCI at pH 8.0 at 37 °C. The results, shown in Tables 2 to 4 and in Figures 1 to 3, clearly indicate that beta-casein A1 increases DPPIV activity in the jejunum. DPPIV activity is
5 expressed in units of nmol/min/pg protein. Note that the rats used for the study of varying
ratios of beta-casein A1 and beta-casein A2 (Table 4) were conditioned differently (purified
rat diet A1N-76A),


Table 2: Jejunum DPPIV activity
Std Std
Al Dev A2 Dev
Saline 12 39,19 9.05 29.94 4.66
Naloxone 12 35.43 6.68 30.38 10.25
Saline 60 37.35 7.92 26.15 3.58
Naloxone 60 39.39 6.43 36.56 14.18
10
Table 3; Colon DPPIV activity
Std Std
Al Dev A2 Dev
Saline 12 6.53 1.18 6.79 0.74
Naloxone 12 6.52 1.33 6.68 0.70
Saline 60 6.94 0.81 7.19 0.63
Naloxone 60 7.03 1.33 6.87 0.64

Table 4: Jejunum DPPIV activity for varying A1:A2 ratios
Jejunum
DPPIV Std
activity Dev
1000/0 Al 9.03 1.89
75% A1:250/0 A2 9.27 1.68
50% A1:50% A2 8.53 2.26
25% Al:750/0 A2 8,31 1.32
1000/0 A2 8,36 1.18

15
Example 3: Effect of BCM-7 on DNA เมธิเลชัน Levels
Shifts in global DNA เมธิเลชัน patterns induced by BCM-7 were investigated using
methyl-CpG binding domain (MBD) protein-enriched genome sequencing (MBD-seq) as
described previously (Trivedi M., et al., Mol. Pharm. 2014), whereas mRNA translation
20 microarray data was obtained using an Agilent V3 microarray chip, from non-treated control
SH-SY5Y cells and cells treated for 4 hours with 1 pM BCM-7.
Genomic DNA was extracted from samples using the Easy DNA kit (Invitrogen K1800-01) using the appropriate protocol for cell lines. Fragmentation was performed on a
Covaris S2 ultrasonicator using the following settings: duty cycle 100/0, intensity 5, 200 cycles per burst during 200 sec. Fragments were obtained having an average length of 200
bp. The power mode is frequency sweeping, temperature 6-8 °C, water level 12. A
maximum of 5 pg was loaded in 130 pl TrIs- EDTA in a microtube with AFA intensifier. For 5 samples with less DNA input (down to 500 ng) the DNA was diluted 1:5 in TrisEDTA. DNA
with an input from 5-3 pg was analysed on the Agilent 2100 using a DNA 1000 chip. DNA
with an input lower than 3 pg was concentrated in a rotary evaporator to 25 pl and the
fragment distribution was checked on a high sensitivity DNA chip. Methylated DNA was
captured using the MethylCap kit (Diagenode, Belgium). The yield was typically between 10 0.5 and 8 ng of total captured DNA. Fragments were subsequently sequenced using an
Illumina Genome Analyzer II. The concentrations of fragmented and captured DNA were determined on a Fluostar Optima plate reader with the Quant-IT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen P7589) at 480/520nm.
To prepare the DNA library, a DNA Sample Prep Master Mix Set 1 (NEB E6040) was 15 used in combination with a Multiplexing Sample Preparation Oligo Kit (96 samples, Illumina
PE-400-1001). The entire fragmented DNA was utilised and followed the NEB protocols,
using the multiplexing sequencing adapters provided in the Multiplexing Sample Preparation
Oligo Kit. Size selection of the library was carried out on a 2% agarose gel (Low Range
Ultra Agarose Biorad 161-3107). A 1Kb Plus ladder (Invitrogen 10787-018) was used and a
20 gel was run at 120 V for 2 hrs. A fragment of 300 bps +/- 50bps was excised and eluted on
a Qiagen Gel Extraction Kit column (Qiagen 28704) and eluted in 23 pl EB.
The Illumina library amplification index protocol was used with the following
alterations: 22 pl DNA was used and performed 21 cycles run. The sample was purified on
a Qiaquick PCR Purification column (Qiagen 28101) and eluted In 50 pl EB, 1:5 diluted, and
25 concentrated in a rotary evaporator to 10 pl. 1 pl was applied to an Agilent 2100 HS DNA
chip and the concentration was determined by smear analysis on the Agilent 2100. The samples were diluted to 10 nM. After denaturation with NaOH the samples were diluted to
16 pM. The Paired-End flow cell was prepared according to the Cluster Station User Guide.
Sequencing was performed according to the HiSeq user guide (performing a Multiplexed PE 30 Run), with 2 x 51 cycles for the paired end runs.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ตัวอย่างที่ 2: DPPIV กิจกรรมเนื้อเยื่อจาก jejunum และลำไส้ใหญ่ของหนูที่เลี้ยงตามตัวอย่างที่ 1 คือวัด ไดเปปทิดิลเปปทิเดส IV (DPPIV) กิจกรรมใช้ชุดพาณิชย์ (BML Kit-AK498 เอ็น 20 ชีวิตวิทยาศาสตร์ สหรัฐอเมริกา) ตัวอย่างเนื้อเยื่อ (50 มิลลิกรัม) ได้นี้ในทริ (100 มม. ค่า pH 8) และวัดนอกของ Gly-Pro-4-Nitroanilide (Sigma) > ไดเปปทิดิลเปปทิเดส > Gly - โปร + p Nitroaniline ได้รับการกกในทริ (100 มม. ค่า pH 8) 15 นาทีที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส การเกิดปฏิกิริยา หยุดมีบัฟเฟอร์อะซิเตท (1M ค่า pH 4.2) และ absorbance ที่อ่านในเครื่องอ่านแผ่น405 nm เปรียบเทียบกับเส้นโค้งมาตรฐานอ้างอิง (Sigma) ในการคำนวณกิจกรรม หนึ่งหน่วยผลิต 1.0 mM 4 Nitroaniline จาก Gly-Pro-4-nitroaniline ต่อนาทีใน 0.1 M Trls/ของ HCI ที่ pH 8.0 ที่ 37 องศาเซลเซียส ผล แสดงในตารางที่ 2-4 และในตัวเลข 1 ถึง 3 ระบุอย่างชัดเจนว่า A1 เบต้า-เคซีนเพิ่มกิจกรรม DPPIV jejunum กิจกรรม DPPIV5 ที่แสดงในหน่วยของโปรตีนนาโน โมล/นาที/pg หมายเหตุว่า หนูใช้สำหรับการศึกษาแตกต่างกันของอัตราส่วนของ A1 เบต้า-เคซีนและเบต้า-เคซีน A2 (ตาราง 4) ถูกปรับแตก (บริสุทธิ์หนูอาหาร A1N 76A),ตารางที่ 2: Jejunum DPPIV กิจกรรมมาตรฐาน StdAl Dev A2 Devเกลือ 12 39,19 9.05 29.94 4.66Naloxone 12 ยัง 35.43 6.68 30.38 10.25เกลือ 60 37.35 7.92 26.15 3.58Naloxone 60 39.39 6.43 36.56 14.1810ตารางที่ 3 กิจกรรม DPPIV ลำไส้ใหญ่มาตรฐาน StdAl Dev A2 Devเกลือ 12 6.53 1.18 6.79 0.74Naloxone 12 6.52 1.33 6.68 0.70เกลือ 60 6.94 0.81 7.19 0.63Naloxone 60 7.03 1.33 6.87 0.64ตารางที่ 4: Jejunum DPPIV กิจกรรมแตกต่างกันของอัตราส่วน A1:A2Jejunumมาตรฐาน DPPIVกิจกรรมพัฒนา1000/0 อัล 9.03 1.89A1:250 75% / 0 A2 9.27 1.6850% A1:50% A2 8.53 2.2625% อัล: 750 / 0 A2 8,31 1.321000/0 A2 8,36 1.1815ตัวอย่างที่ 3: ผลของ BCM-7 ระดับเมธิเลชันดีเอ็นเอในรูปแบบเมธิเลชันดีเอ็นเอระดับโลกที่เหนี่ยวนำ โดย BCM-7 ถูกตรวจสอบโดยใช้เมทิล-CpG รวมโดเมน (MBD) ลำดับพันธุอุดมโปรตีน (MBD seq) เป็นอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Trivedi M., et al. Mol. Pharm. 2014), ในขณะที่แปลของ mRNAข้อมูล 20 microarray มาใช้แบบ Agilent V3 microarray ชิพ จากการไม่รับการรักษาควบคุมSH SY5Y เซลล์และเซลล์ปฏิบัติ 4 ชั่วโมงกับ 1 pM BCM-7ดีเอ็นเอการถูกแยกจากตัวอย่างที่ใช้ชุดง่ายดีเอ็นเอ (Invitrogen K1800-01) ที่ใช้โพรโทคอลที่เหมาะสมรายการเซลล์ ทำการกระจายตัวตามCovaris S2 ultrasonicator ใช้การตั้งค่าต่อไปนี้: วัฏจักรหน้าที่ 100 0 ความเข้ม 5, 200 รอบต่อเนื่องระหว่าง 200 วินาทีเศษได้รับมามีความยาวเฉลี่ย 200bp โหมดการใช้พลังงานความถี่กวาด อุณหภูมิ 6-8 ° C ระดับน้ำ 12 Aสูงสุด 5 pg การโหลดใน 130 pl ทริ - EDTA ใน microtube กับ intensifier น่า สำหรับตัวอย่างดีเอ็นเอน้อยกว่า 5 อินพุต (ลงไป 500 ฉบับ) ดีเอ็นเอถูกเจือจาง 1:5 ใน TrisEDTA ดีเอ็นเอ with an input from 5-3 pg was analysed on the Agilent 2100 using a DNA 1000 chip. DNA with an input lower than 3 pg was concentrated in a rotary evaporator to 25 pl and the fragment distribution was checked on a high sensitivity DNA chip. Methylated DNA was captured using the MethylCap kit (Diagenode, Belgium). The yield was typically between 10 0.5 and 8 ng of total captured DNA. Fragments were subsequently sequenced using anIllumina Genome Analyzer II. The concentrations of fragmented and captured DNA were determined on a Fluostar Optima plate reader with the Quant-IT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen P7589) at 480/520nm.To prepare the DNA library, a DNA Sample Prep Master Mix Set 1 (NEB E6040) was 15 used in combination with a Multiplexing Sample Preparation Oligo Kit (96 samples, Illumina PE-400-1001). The entire fragmented DNA was utilised and followed the NEB protocols, using the multiplexing sequencing adapters provided in the Multiplexing Sample Preparation Oligo Kit. Size selection of the library was carried out on a 2% agarose gel (Low Range Ultra Agarose Biorad 161-3107). A 1Kb Plus ladder (Invitrogen 10787-018) was used and a20 gel was run at 120 V for 2 hrs. A fragment of 300 bps +/- 50bps was excised and eluted ona Qiagen Gel Extraction Kit column (Qiagen 28704) and eluted in 23 pl EB.The Illumina library amplification index protocol was used with the followingalterations: 22 pl DNA was used and performed 21 cycles run. The sample was purified ona Qiaquick PCR Purification column (Qiagen 28101) and eluted In 50 pl EB, 1:5 diluted, and25 concentrated in a rotary evaporator to 10 pl. 1 pl was applied to an Agilent 2100 HS DNAchip and the concentration was determined by smear analysis on the Agilent 2100. The samples were diluted to 10 nM. After denaturation with NaOH the samples were diluted to16 pM. The Paired-End flow cell was prepared according to the Cluster Station User Guide. Sequencing was performed according to the HiSeq user guide (performing a Multiplexed PE 30 Run), with 2 x 51 cycles for the paired end runs.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ตัวอย่างที่ 2: กิจกรรม DPPIV
เนื้อเยื่อจากลำไส้เล็กส่วนกลางและลำไส้ใหญ่ของหนูที่เลี้ยงตามตัวอย่างที่ 1 ได้รับการวัด
สำหรับไดเปปทิดิลเปป ทิเดส iv (DPPIV) โดยใช้ชุดการค้ากิจกรรม (Kit BML-AK498, ENZO 20 ชีวิต วิทยาศาสตร์, สหรัฐอเมริกา) ตัวอย่างเนื้อเยื่อ (50 มก.) ได้รับการ homogenised ทริส (100 มิลลิเมตรมีค่า pH 8)
และวัดโดยนอกเหนือจาก Gly-Pro-4-Nitroanilide (ซิกม่า)> การไดเปปทิดิลเปป ทิเดส > Gly-
Pro + P-nitroaniline บ่มทริส (100 มิลลิเมตรมีค่า pH 8) เป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ปฏิกิริยา
ก็หยุดกับบัฟเฟอร์อะซิเตท (1M ค่า pH 4.2) และการดูดกลืนแสงอ่านในเครื่องอ่านแผ่นที่
405 นาโนเมตรและเมื่อเทียบกับเส้นโค้งการอ้างอิงมาตรฐาน (ซิกม่า) เพื่อคำนวณกิจกรรม หนึ่งหน่วยผลิต 1.0 มิลลิเมตร 4 nitroaniline จาก Gly-Pro-4-nitroaniline ต่อนาทีใน 0.1 M Trls / HCI ที่ pH 8.0 ที่ 37 ° C ผลดังที่แสดงในตารางที่ 2-4 และรูปที่ 1-3 อย่างชัดเจนระบุว่าเบต้าเคซีน A1 เพิ่มกิจกรรม DPPIV ในลำไส้เล็กส่วนกลาง กิจกรรม DPPIV เป็น
5 แสดงในหน่วยของ nmol / นาที / โปรตีน PG โปรดทราบว่าหนูที่ใช้สำหรับการศึกษาที่แตกต่างกัน
อัตราส่วน A1 เบต้าเคซีนและเบต้าเคซีน A2 (ตารางที่ 4) ได้รับการปรับอากาศที่แตกต่างกัน (บริสุทธิ์
อาหารหนู A1N-76A) ตารางที่ 2: jejunum DPPIV กิจกรรมStd Std อัล Dev A2 Dev Saline 12 39,19 9,05 29,94 4,66 naloxone 12 35.43 6.68 30.38 10.25 Saline 60 37.35 7.92 26.15 3.58 naloxone 60 39.39 6.43 36.56 14.18 10 ตารางที่ 3; กิจกรรม DPPIV ลำไส้ใหญ่Std Std อัล Dev A2 Dev Saline 12 6.53 1.18 6.79 0.74 naloxone 12 6.52 1.33 6.68 0.70 Saline 60 6.94 0.81 7.19 0.63 naloxone 60 7.03 1.33 6.87 0.64 ตารางที่ 4: กิจกรรม DPPIV jejunum แตกต่างกันสำหรับ A1: อัตราส่วน A2 jejunum DPPIV Std กิจกรรม Dev 1000/0 อั 9.03 1.89 75% A1: 250/0 A2 9.27 1.68 50% A1: 50% A2 8.53 2.26 25% อัล 750/0 A2 8,31 1.32 1000/0 A2 8,36 1.18 15 ตัวอย่างที่ 3: ผล ของ BCM-7 ดีเอ็นเอเมธิเลชันระดับเลื่อนในดีเอ็นเอของโลกเมธิเลชันรูปแบบที่เกิดจาก BCM-7 ถูกตรวจสอบโดยใช้methyl-CpG ผูกพันโดเมน (MBD) โปรตีนที่อุดมลำดับจีโนม (MBD-seq) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า ( Trivedi M. , et al., Mol. Pharm. 2014) ในขณะที่การแปล mRNA 20 ข้อมูล microarray ได้จากการใช้ชิป microarray Agilent V3 จากการควบคุมที่ไม่ได้รับการรักษาเซลล์ SH-SY5Y และเซลล์ได้รับการรักษาเป็นเวลา 4 ชั่วโมงกับ 01:00 BCM- 7. จีโนมดีเอ็นเอที่สกัดจากกลุ่มตัวอย่างโดยใช้ชุดง่ายดีเอ็นเอ (Invitrogen K1800-01) โดยใช้โปรโตคอลที่เหมาะสมสำหรับสายมือถือ การกระจายตัวได้รับการดำเนินการบนultrasonicator Covaris S2 ใช้การตั้งค่าต่อไปนี้: รอบหน้าที่ 100/0 เข้ม 5, 200 รอบต่อออกมาในช่วง 200 วินาที ชิ้นส่วนที่ได้รับมีความยาวเฉลี่ยของ 200 bp โหมดพลังงานที่มีความถี่กวาดอุณหภูมิ 6-8 องศาเซลเซียสระดับน้ำ 12 สูงสุด 5 PG ถูกโหลดใน 130 PL tris- EDTA ใน Microtube กับ AFA intensifier สำหรับ 5 ตัวอย่างมีการป้อนข้อมูลดีเอ็นเอน้อย (ลดลงถึง 500 นาโนกรัม) ดีเอ็นเอถูกเจือจาง 1: 5 ใน TrisEDTA ดีเอ็นเอด้วยการป้อนข้อมูล 5-3 PG วิเคราะห์ใน Agilent 2100 โดยใช้ดีเอ็นเอ 1000 ชิป ดีเอ็นเอที่มีการป้อนข้อมูลต่ำกว่า 3 PG ถูกเข้มข้นในเครื่องระเหยแบบหมุน 25 PL และจัดจำหน่ายชิ้นส่วนได้รับการตรวจสอบบนชิปดีเอ็นเอความไวสูง สาร DNA ถูกจับโดยใช้ชุด MethylCap นี้ (Diagenode, เบลเยียม) อัตราผลตอบแทนเป็นปกติระหว่าง 10 0.5 และ 8 NG ของดีเอ็นเอที่ถูกจับทั้งหมด เศษมีลำดับขั้นตอนต่อมาใช้Illumina จีโนมวิเคราะห์ครั้งที่สอง ความเข้มข้นของการแยกส่วนและจับดีเอ็นเอได้รับการพิจารณาในการอ่านแผ่น Fluostar Optima กับควอนท์-IT PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen P7589) ที่ 480 / 520nm. เพื่อเตรียมความพร้อมห้องสมุดดีเอ็นเอดีเอ็นเอตัวอย่างเตรียมปริญญาโทผสมชุดที่ 1 (NEB E6040 ) เป็น 15 ใช้ร่วมกับการเตรียมสารตัวอย่าง Multiplexing Oligo Kit (96 ตัวอย่าง Illumina PE-400-1001) ดีเอ็นเอแยกส่วนทั้งหมดถูกนำมาใช้และปฏิบัติตามโปรโตคอล NEB ที่ใช้อะแดปเตอร์มัลติลำดับที่ให้ไว้ในการเตรียมสารตัวอย่าง Multiplexing Oligo Kit เลือกขนาดของห้องสมุดได้รับการดำเนินการเกี่ยวกับเจล agarose 2% (ช่วงต่ำอัลตร้า Agarose Biorad 161-3107) 1KB พลัสบันได (Invitrogen 10787-018) ถูกนำมาใช้และเจล 20 ก็วิ่งที่ 120 V สำหรับ 2 ชั่วโมง ส่วนของ 300 bps +/- 50bps ถูกตัดและชะบนQiagen เจลสกัด Kit คอลัมน์ (Qiagen 28704) และชะใน 23 PL EB. Illumina โปรโตคอลดัชนีห้องสมุดขยายถูกนำมาใช้กับการดังต่อไปนี้การเปลี่ยนแปลง: 22 PL ดีเอ็นเอถูกนำมาใช้และ ดำเนินการ 21 รอบการทำงาน ตัวอย่างบริสุทธิ์บนบริสุทธิ์คอลัมน์ Qiaquick PCR (Qiagen 28101) และชะ 50 PL EB, 1: 5 เจือจางและ25 เข้มข้นในเครื่องระเหยแบบหมุน 10 PL 1 PL ถูกนำไปใช้กับ Agilent 2100 HS ดีเอ็นเอชิปและความเข้มข้นที่ถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์ละเลงบน Agilent 2100 ตัวอย่างที่ถูกปรับลดถึง 10 นาโนเมตร หลังจากที่สูญเสียสภาพธรรมชาติด้วย NaOH ตัวอย่างที่ถูกลดลงเหลือ16 pm เซลล์ไหลคู่-End ได้รับการจัดทำขึ้นตามคู่มือการใช้งานสถานีคลัสเตอร์. ลำดับที่ได้ดำเนินการตามคู่มือผู้ใช้ HiSeq (การดำเนินการ Multiplexed PE 30 Run) มี 2 x 51 รอบสำหรับส่วนวิ่งจับคู่