- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
Enhancement of operational stabilit
Enhancement of operational stability of an enzyme biosensor for
glucose and sucrose using protein based stabilizing agents
M.D. Gouda a, M.A. Kumar b, M.S. Thakur a, N.G. Karanth a,*
a Central Food Technological Research Institute, Mysore 570013, India
b Central Instrument Facility and Services, Central Food Technological Research Institute, Mysore 570013, India
Received 7 March 2001; received in revised form 7 November 2001; accepted 19 December 2001
Abstract
With the incorporation of lysozyme during the immobilization step, considerable enhancement of the operational stability of a
biosensor has been demonstrated in the case of an immobilized single enzyme (glucose oxidase) system for glucose and multienzyme
(invertase, mutarotase and glucose oxidase) system for sucrose. Thus an increased number of repeated analyses of 750 samples
during 230 days for glucose and 400 samples during 40 days of operation for sucrose have been achieved. The increased operational
stability of immobilized single and multienzyme system, will improve the operating cost effectiveness of the biosensor. # 2002
Elsevier Science B.V. All rights reserved.
Keywords: Biosensor; Immobilized enzymes; Operational stability; Protein based stabilizing agents; Detachable membrane unit
1. Introduction
Immobilized enzyme based biosensors have been
widely used for analyses in food and fermentation
industries (Coulet and Bertrand, 1979; Scheller and
Karsten, 1983; Sheper, 1992), in environmental monitoring
(Schmidt and Scheller, 1989) and in clinical
diagnosis (Mason and Townshend, 1984).Biosensors for
glucose and sucrose have been widely used for food and
fermentation sample analysis (Danielsson, 1994; Hundech
et al., 1992; Scheller and Renniberg, 1983; Xu et
al., 1989; Matsumoto et al., 1988). An important
consideration in the practical application of biosensors
is the operational life of the sensing element particularly
while monitoring the food and fermentation analysis
where the substrate concentrations are high. When
immobilized enzymes are used for this purpose, the
activity loss due to denaturation and deactivation of the
enzyme diminishes the life of the sensor. Therefore
techniques to enhance the storage and operational
stability of the enzyme electrode are important in the
application of electrochemical biosensors. Attempts to
stabilize enzymes reported in literature include the use of
cationic polyelectrolytes (Gavalas and Channiotakis,
2000), polyelectrolytes and sugar alcohols (Gibson et
al., 1992), immobilization of enzyme and polyelectrolyte
complex on CPG (Appleton et al., 1997) and immobilization
of enzyme on carbon paste electrodes in the
presence of various additives (Lutz et al., 1995).
One of the suitable enzyme immobilization methods
for biosensor applications is crosslinking by using
glutaraldehyde. Glutaraldehyde being a strong bifunctional
reagent, modifies the enzyme drastically, leads to
conformational changes and loss of activity (Broun,
1976). This deleterious effect can be minimized by using
inert proteins like BSA, gelatin, thrombin and lysine.
These proteins avoid excessive of intramolecular crosslinkages
within the enzyme and enhance the intermolecular
linkages between the enzyme and inert proteins
(Broun et al., 1973). While it is known that inert proteins
can act as enzyme stabilizing agents, its application has
been restricted to BSA and gelatin. In view of the
reported observations that complimentary surface protein
(Chang and Mahoney, 1995) and durability of
carrier protein (Gabel et al., 1970; Gabel, 1973) play an
important role in stabilization of enzymes, it is quite
possible that stable proteins other than BSA and gelatin
* Corresponding author. Tel.: 91-821-513-658; fax: 91-821-517-
233.
E-mail address: ferm@cscftri.ren.nic.in (N.G. Karanth).
Biosensors and Bioelectronics 17 (2002) 503/507
www.elsevier.com/locate/bios
0956-5663/02/$ - see front matter # 2002 Elsevier Science B.V. All rights reserved.
PII: S 0 9 5 6 - 5 6 6 3 ( 0 2 ) 0 0 0 2 1 - 0
showing better complimentarity with the enzyme provide
a better stability of free as well as immobilized
enzyme preparations. Stabilization of desired enzyme
can be achieved by using certain proteins, which may be
catalytically active or inactive. In this paper we refer to
them as protein based stabilizing agents (PBSA). However,
one should keep in mind, that if the PBSA is an
enzyme, its products should not interfere with the
biochemical reaction of the desired enzyme electrode.
In our laboratory we have constructed a batch biosensor
for glucose using immobilized GOD and for sucrose
using immobilized multienzyme system (invertase, mutarotase
and glucose oxidase) and tested for repeated
use. In an attempt to enhance the operating stability of
the biosensor, we have found that incorporation of
lysozyme as PBSA can achieve this objective substantially,
and the results are reported in this paper.
2. Materials and methods
2.1. Materials
Glucose oxidase (E.C. 1.1.3.4.) from Aspergillus niger
(specific activity*/180 IU/mg), invertase (E.C. 3.2.1.26)
from yeast (specific activity*/400 IU/mg), mutarotase
(E.C. 5.1.3.3.) from hog kidney (specific activity*/2500
IU/mg), lysozyme, BSA, gelatin and glutaraldehyde
were procured from M/s sigma, USA, the cellophane
membrane molecular weight cut-off 6000/8000 from
Spectra/por, USA and oxygen permeable teflon membrane
from WTW, Germany. For the biosensor, the
dissolved oxygen was measured by an oxygen meter
(EDT, UK) containing a Clark electrode.
2.2. Enzyme immobilization
Glucose oxidase as well as the multienzyme system
was immobilized by crosslinking method reported by
Wilson (1990), modified slightly. Ten milligrams of
glucose oxidase (1800 IU), 1 mg of each invertase (852
IU) and mutarotase (2500 IU) were dissolved in 1 ml of
0.05 M phosphate buffer, pH 6.0. Two hundred milligrams
of each PBSA was dissolved in 1 ml of 0.05 M
sodium phosphate buffer, pH 6.0. Glutaraldehyde solution
(2.5% (w/v)) was prepared by appropriate dilution
of 70% (w/v) glutaraldehyde. On a 2/2 cm cellophane
membrane, predetermined concentration of the invertase,
mutarotase and GOD and 30 ml (6mg) of the PBSA
were placed and mixed thoroughly using a glass rod.
Fifty microlitres of 2.5% glutaraldehyde was then added
and mixed thoroughly again so that enzyme and the
PBSA got distributed uniformly throughout the enzyme
membrane. After 1 h, the enzyme membrane was
washed three times with 0.05 M phosphate buffer, pH
7.0, to remove the excess glutaraldehyde. For the
immobilization of glucose oxidase, instead of using
multienzymes, single enzyme was used.
2.3. Enzyme electrode construction
The details of the construction of the enzyme electrode
and operation have been reported earlier (Gouda
et al., 1997). A detachable membrane unit (DMU)
consisting of a teflon membrane and a cellophane
membrane with the enzyme layer, held in a sandwich
form and secured tightly with an ‘O’ ring fitted on to the
electrode surface as reported by Gouda et al. (2001) has
been used.
2.4. Operational stability studies
The operational stability studies on the single and
multienzyme system immobilized with different PBSAs
was carried out at 259/1 8C. The enzyme activity was
measured by immersing the enzyme sensing element in a
25 ml glass container having 5 ml buffer, kept agitated
continuously with air bubbled through an aquarium
pump. After bubbling of air for 2 min (for saturation)
the dissolved oxygen meter was set by fixing the
dissolved oxygen at 100%. Fifty microlitres of 10%
glucose or sucrose solution was now injected and
decrease in the % dissolved oxygen at the end of 3
min (time taken to reach steady state)was monitored,
which represents the activity of the immobilized enzyme
for that concentration of glucose or sucrose. If the first
analysis response in % dissolved oxygen is ‘a’ and
response at any time on the nth analysis is ‘b’, then %
activity retained is calculated as [b/a]/100. In order to
quantify the operational stability of several PBSAs
incorporated into the immobilized enzyme preparations
simultaneously, a DMU was constructed for each PBSA
separately. The DMU containing the immobilized enzyme
membrane system was then fixed to the electrode
and the change in the response in % dissolved oxygen
was measured by injecting 50 ml of 10% glucose and 100
ml of 10% sucrose, respectively, for the single and
multienzyme membrane system. After analysing about
six samples of the same concentration of the sugar, the
DMU was now kept in 10 ml of buffer at 279/1 8C.
Another DMU containing a different PBSA now
replaced the earlier one and the activity was measured.
The same procedure was repeated for all the DMUs,
every day until the activity fell down to less than 40% of
the initial value.
3. Results and discussion
Fig. 1 demonstrates the operational stability of the
enzyme electrode for glucose containing GOD immobilized
with different PBSAs in 50 mM phosphate buffer,
504 M.D. Gouda et al. / Biosensors and Bioelectronics 17 (2002) 503/507
pH 6.0. Lysozyme was found to be the best for the
stabilization of GOD among the PBSAs tested, followed
by BSA and gelatin. Immobilization without any
additive gave virtually no enzyme activity. Repeated
measurements with 30 ml of 10% glucose solution were
carried out. For GOD immobilized with lysozyme, it
was possible to analyse 750 samples during 230 days of
operation at the end of which 50% of the initial activity
of the immobilized GOD was retained. With BSA as
PBSA it was possible to analyse slightly reduced number
of 520 samples during 150 days of operation and with
gelatin as PBSA it was possible to analyse only 245
samples during 60 days of operation. Another significant
observation from Fig. 1 is that the reproducibility
of the biosensor signal for GOD immobilized with BSA
is poor. Corresponding behaviour of GOD immobilized
with lysozyme as PBSA was very stable.
Fig. 2 demonstrates the operational stability of the
sensin
glucose and sucrose using protein based stabilizing agents
M.D. Gouda a, M.A. Kumar b, M.S. Thakur a, N.G. Karanth a,*
a Central Food Technological Research Institute, Mysore 570013, India
b Central Instrument Facility and Services, Central Food Technological Research Institute, Mysore 570013, India
Received 7 March 2001; received in revised form 7 November 2001; accepted 19 December 2001
Abstract
With the incorporation of lysozyme during the immobilization step, considerable enhancement of the operational stability of a
biosensor has been demonstrated in the case of an immobilized single enzyme (glucose oxidase) system for glucose and multienzyme
(invertase, mutarotase and glucose oxidase) system for sucrose. Thus an increased number of repeated analyses of 750 samples
during 230 days for glucose and 400 samples during 40 days of operation for sucrose have been achieved. The increased operational
stability of immobilized single and multienzyme system, will improve the operating cost effectiveness of the biosensor. # 2002
Elsevier Science B.V. All rights reserved.
Keywords: Biosensor; Immobilized enzymes; Operational stability; Protein based stabilizing agents; Detachable membrane unit
1. Introduction
Immobilized enzyme based biosensors have been
widely used for analyses in food and fermentation
industries (Coulet and Bertrand, 1979; Scheller and
Karsten, 1983; Sheper, 1992), in environmental monitoring
(Schmidt and Scheller, 1989) and in clinical
diagnosis (Mason and Townshend, 1984).Biosensors for
glucose and sucrose have been widely used for food and
fermentation sample analysis (Danielsson, 1994; Hundech
et al., 1992; Scheller and Renniberg, 1983; Xu et
al., 1989; Matsumoto et al., 1988). An important
consideration in the practical application of biosensors
is the operational life of the sensing element particularly
while monitoring the food and fermentation analysis
where the substrate concentrations are high. When
immobilized enzymes are used for this purpose, the
activity loss due to denaturation and deactivation of the
enzyme diminishes the life of the sensor. Therefore
techniques to enhance the storage and operational
stability of the enzyme electrode are important in the
application of electrochemical biosensors. Attempts to
stabilize enzymes reported in literature include the use of
cationic polyelectrolytes (Gavalas and Channiotakis,
2000), polyelectrolytes and sugar alcohols (Gibson et
al., 1992), immobilization of enzyme and polyelectrolyte
complex on CPG (Appleton et al., 1997) and immobilization
of enzyme on carbon paste electrodes in the
presence of various additives (Lutz et al., 1995).
One of the suitable enzyme immobilization methods
for biosensor applications is crosslinking by using
glutaraldehyde. Glutaraldehyde being a strong bifunctional
reagent, modifies the enzyme drastically, leads to
conformational changes and loss of activity (Broun,
1976). This deleterious effect can be minimized by using
inert proteins like BSA, gelatin, thrombin and lysine.
These proteins avoid excessive of intramolecular crosslinkages
within the enzyme and enhance the intermolecular
linkages between the enzyme and inert proteins
(Broun et al., 1973). While it is known that inert proteins
can act as enzyme stabilizing agents, its application has
been restricted to BSA and gelatin. In view of the
reported observations that complimentary surface protein
(Chang and Mahoney, 1995) and durability of
carrier protein (Gabel et al., 1970; Gabel, 1973) play an
important role in stabilization of enzymes, it is quite
possible that stable proteins other than BSA and gelatin
* Corresponding author. Tel.: 91-821-513-658; fax: 91-821-517-
233.
E-mail address: ferm@cscftri.ren.nic.in (N.G. Karanth).
Biosensors and Bioelectronics 17 (2002) 503/507
www.elsevier.com/locate/bios
0956-5663/02/$ - see front matter # 2002 Elsevier Science B.V. All rights reserved.
PII: S 0 9 5 6 - 5 6 6 3 ( 0 2 ) 0 0 0 2 1 - 0
showing better complimentarity with the enzyme provide
a better stability of free as well as immobilized
enzyme preparations. Stabilization of desired enzyme
can be achieved by using certain proteins, which may be
catalytically active or inactive. In this paper we refer to
them as protein based stabilizing agents (PBSA). However,
one should keep in mind, that if the PBSA is an
enzyme, its products should not interfere with the
biochemical reaction of the desired enzyme electrode.
In our laboratory we have constructed a batch biosensor
for glucose using immobilized GOD and for sucrose
using immobilized multienzyme system (invertase, mutarotase
and glucose oxidase) and tested for repeated
use. In an attempt to enhance the operating stability of
the biosensor, we have found that incorporation of
lysozyme as PBSA can achieve this objective substantially,
and the results are reported in this paper.
2. Materials and methods
2.1. Materials
Glucose oxidase (E.C. 1.1.3.4.) from Aspergillus niger
(specific activity*/180 IU/mg), invertase (E.C. 3.2.1.26)
from yeast (specific activity*/400 IU/mg), mutarotase
(E.C. 5.1.3.3.) from hog kidney (specific activity*/2500
IU/mg), lysozyme, BSA, gelatin and glutaraldehyde
were procured from M/s sigma, USA, the cellophane
membrane molecular weight cut-off 6000/8000 from
Spectra/por, USA and oxygen permeable teflon membrane
from WTW, Germany. For the biosensor, the
dissolved oxygen was measured by an oxygen meter
(EDT, UK) containing a Clark electrode.
2.2. Enzyme immobilization
Glucose oxidase as well as the multienzyme system
was immobilized by crosslinking method reported by
Wilson (1990), modified slightly. Ten milligrams of
glucose oxidase (1800 IU), 1 mg of each invertase (852
IU) and mutarotase (2500 IU) were dissolved in 1 ml of
0.05 M phosphate buffer, pH 6.0. Two hundred milligrams
of each PBSA was dissolved in 1 ml of 0.05 M
sodium phosphate buffer, pH 6.0. Glutaraldehyde solution
(2.5% (w/v)) was prepared by appropriate dilution
of 70% (w/v) glutaraldehyde. On a 2/2 cm cellophane
membrane, predetermined concentration of the invertase,
mutarotase and GOD and 30 ml (6mg) of the PBSA
were placed and mixed thoroughly using a glass rod.
Fifty microlitres of 2.5% glutaraldehyde was then added
and mixed thoroughly again so that enzyme and the
PBSA got distributed uniformly throughout the enzyme
membrane. After 1 h, the enzyme membrane was
washed three times with 0.05 M phosphate buffer, pH
7.0, to remove the excess glutaraldehyde. For the
immobilization of glucose oxidase, instead of using
multienzymes, single enzyme was used.
2.3. Enzyme electrode construction
The details of the construction of the enzyme electrode
and operation have been reported earlier (Gouda
et al., 1997). A detachable membrane unit (DMU)
consisting of a teflon membrane and a cellophane
membrane with the enzyme layer, held in a sandwich
form and secured tightly with an ‘O’ ring fitted on to the
electrode surface as reported by Gouda et al. (2001) has
been used.
2.4. Operational stability studies
The operational stability studies on the single and
multienzyme system immobilized with different PBSAs
was carried out at 259/1 8C. The enzyme activity was
measured by immersing the enzyme sensing element in a
25 ml glass container having 5 ml buffer, kept agitated
continuously with air bubbled through an aquarium
pump. After bubbling of air for 2 min (for saturation)
the dissolved oxygen meter was set by fixing the
dissolved oxygen at 100%. Fifty microlitres of 10%
glucose or sucrose solution was now injected and
decrease in the % dissolved oxygen at the end of 3
min (time taken to reach steady state)was monitored,
which represents the activity of the immobilized enzyme
for that concentration of glucose or sucrose. If the first
analysis response in % dissolved oxygen is ‘a’ and
response at any time on the nth analysis is ‘b’, then %
activity retained is calculated as [b/a]/100. In order to
quantify the operational stability of several PBSAs
incorporated into the immobilized enzyme preparations
simultaneously, a DMU was constructed for each PBSA
separately. The DMU containing the immobilized enzyme
membrane system was then fixed to the electrode
and the change in the response in % dissolved oxygen
was measured by injecting 50 ml of 10% glucose and 100
ml of 10% sucrose, respectively, for the single and
multienzyme membrane system. After analysing about
six samples of the same concentration of the sugar, the
DMU was now kept in 10 ml of buffer at 279/1 8C.
Another DMU containing a different PBSA now
replaced the earlier one and the activity was measured.
The same procedure was repeated for all the DMUs,
every day until the activity fell down to less than 40% of
the initial value.
3. Results and discussion
Fig. 1 demonstrates the operational stability of the
enzyme electrode for glucose containing GOD immobilized
with different PBSAs in 50 mM phosphate buffer,
504 M.D. Gouda et al. / Biosensors and Bioelectronics 17 (2002) 503/507
pH 6.0. Lysozyme was found to be the best for the
stabilization of GOD among the PBSAs tested, followed
by BSA and gelatin. Immobilization without any
additive gave virtually no enzyme activity. Repeated
measurements with 30 ml of 10% glucose solution were
carried out. For GOD immobilized with lysozyme, it
was possible to analyse 750 samples during 230 days of
operation at the end of which 50% of the initial activity
of the immobilized GOD was retained. With BSA as
PBSA it was possible to analyse slightly reduced number
of 520 samples during 150 days of operation and with
gelatin as PBSA it was possible to analyse only 245
samples during 60 days of operation. Another significant
observation from Fig. 1 is that the reproducibility
of the biosensor signal for GOD immobilized with BSA
is poor. Corresponding behaviour of GOD immobilized
with lysozyme as PBSA was very stable.
Fig. 2 demonstrates the operational stability of the
sensin
0/5000
เพิ่มประสิทธิภาพของงานความมั่นคงของ biosensor มีเอนไซม์สำหรับกลูโคสและซูโครสที่ใช้โปรตีนจากตัวแทนสมัยมีเสถียรภาพสเกาดานพ. a, b M.A. Kumar เด้นกวาน Thakur N.G. Karanth a, a, *การอาหารกลางเทคโนโลยี สถาบันวิจัย มัย 570013 อินเดียb กลางเครื่องมือสิ่งอำนวยความสะดวกและบริการ อาหารกลางเทคโนโลยีวิจัย สถาบัน มัย 570013 อินเดียได้รับ 7 2001 มีนาคม ได้รับในแบบฟอร์มการปรับปรุง 7 2544 พฤศจิกายน รับ 19 2544 ธันวาคมบทคัดย่อด้วยการประสานของ lysozyme ระหว่างขั้นตอนตรึงโป เพิ่มประสิทธิภาพมากของความมั่นคงการดำเนินงานของการbiosensor มีการสาธิตในกรณีระบบเอนไซม์เอนไซม์เดี่ยว (กลูโคส oxidase) กลูโคสและ multienzymeระบบ (oxidase invertase, mutarotase และกลูโคส) ซูโครส ดังนั้นการเพิ่มจำนวนวิเคราะห์ซ้ำอย่าง 750ระหว่าง 230 วันน้ำตาลกลูโคสและ 400 ตัวอย่างในระหว่างการดำเนินการสำหรับซูโครส 40 วันได้ได้เกิดขึ้น การเพิ่มการดำเนินงานเสถียรภาพของเอนไซม์เดียว และ multienzyme ระบบ จะปรับปรุงประสิทธิภาพต้นทุนดำเนินงานของ biosensor # 2002วิทยาศาสตร์ Elsevier b.v สงวนลิขสิทธิ์ทั้งหมดคำสำคัญ: Biosensor เอนไซม์เอนไซม์ ความมั่นคงปฏิบัติ โปรตีนตามตัวแทนสมัยมีเสถียรภาพ เมมเบรนออกได้หน่วย1. บทนำBiosensors เอนไซม์เอนไซม์ที่ใช้ได้ใช้สำหรับวิเคราะห์ในอาหารหมักดองอุตสาหกรรม (Coulet และเบอร์ทรานด์ 1979 Scheller และKarsten, 1983 Sheper, 1992) ในการตรวจสอบสิ่งแวดล้อม(Schmidt และ Scheller, 1989) และ ในทางคลินิกการวินิจฉัย (Mason และทาวน์เซนด์ 1984) Biosensors สำหรับกลูโคสและซูโครสได้ถูกใช้สำหรับอาหาร และหมักตัวอย่างวิเคราะห์ (Danielsson, 1994 Hundechร้อยเอ็ด al., 1992 Scheller และ Renniberg, 1983 Xu ร้อยเอ็ดal., 1989 มัตสึโมโตะ et al., 1988) มีความสำคัญพิจารณาการปฏิบัติของ biosensorsคือชีวิตการดำเนินงานขององค์ประกอบ sensing โดยเฉพาะอย่างยิ่งในขณะที่ตรวจสอบวิเคราะห์อาหารและหมักที่ความเข้มข้นขั้นสูง เมื่อเอนไซม์เอนไซม์ใช้สำหรับวัตถุประสงค์นี้ การขาดทุนกิจกรรม denaturation และปิดใช้งานของการเอนไซม์ค่อย ๆ หายไปในชีวิตของการเซ็นเซอร์ ดังนั้นเทคนิคการเพิ่มประสิทธิภาพการจัดเก็บข้อมูลผลการดำเนินงานเสถียรภาพของไฟฟ้าเอนไซม์มีความสำคัญในการใช้ไฟฟ้า biosensors ความพยายามที่จะอยู่ดีเอนไซม์ในวรรณกรรมมีการใช้polyelectrolytes cationic (Gavalas และ Channiotakis2000), polyelectrolytes และ alcohols น้ำตาล (กิบสันร้อยเอ็ดal., 1992), ตรึงโป polyelectrolyte และเอนไซม์ซับซ้อนในประเภทวัสดุสิ้นเปลือง (แอปเปิลและ al., 1997) และการตรึงของเอนไซม์บนคาร์บอนวางหุงตในการสถานะของสารต่าง ๆ (แลนลุตซ์ et al., 1995)วิธีตรึงโปเอนไซม์ที่เหมาะสมสำหรับโปรแกรมประยุกต์ biosensor เป็น crosslinking โดยglutaraldehyde Glutaraldehyde ถูกแรง bifunctionalรีเอเจนต์ ปรับเปลี่ยนเอนไซม์นี้อย่างรวดเร็ว ให้เปลี่ยนแปลง conformational และขาดทุนของกิจกรรม (Broun1976) ได้ผลร้ายนี้สามารถย่อให้เล็กสุด โดยใช้โปรตีน inert เช่นบีเอสเอ ตุ๋น thrombin และไลซีนโปรตีนเหล่านี้หลีกเลี่ยงการเกินของ intramolecular crosslinkagesเอนไซม์อยู่ภายใน และเพิ่มการ intermolecularเชื่อมโยงระหว่างเอนไซม์และโปรตีน inert(Broun et al., 1973) ในขณะที่เป็นที่รู้จักกันที่ inert โปรตีนสามารถทำหน้าที่เป็นเอนไซม์ stabilizing ตัวแทน ของแอพลิเคชันได้การจำกัดบีเอสเอและตุ๋น ในมุมมองของการรายงานข้อสังเกตที่ฟรีผิวโปรตีน(ช้างและ Mahoney, 1995) และโปรตีนขนส่ง (Gabel et al., 1970 Gabel, 1973) เล่นเป็นบทบาทสำคัญในเสถียรภาพของเอนไซม์ มันค่อนเป็นไปได้ที่โปรตีนบีเอสเอและตุ๋นมีเสถียรภาพ* ผู้สอดคล้องกัน โทรศัพท์: 91-821-513-658 โทรสาร: 91-821-517 -233ที่อยู่อีเมล์: ferm@cscftri.ren.nic.in (N.G. Karanth)Biosensors และ Bioelectronics 17 (2002) 503 /507www.elsevier.com/locate/bios0956-5663/02 / $ - ดูหน้าเรื่องวิทยาศาสตร์#2002 Elsevier b.v สงวนลิขสิทธิ์ทั้งหมดPII: S 0 9 5 6 - 5 6 6 3 (0 2) 0 0 0 2 1 - 0แสดงดี complimentarity กับเอนไซม์ให้เสถียรภาพที่ดีกว่าของฟรี รวมทั้งเอนไซม์การเตรียมเอนไซม์ เสถียรภาพของเอนไซม์ต้องสามารถทำได้ โดยใช้โปรตีนบางอย่าง ซึ่งอาจเป็นcatalytically ใช้งานอยู่ หรือไม่ เราอ้างถึงในเอกสารนี้พวกเขาเป็นโปรตีนตามตัวแทนสมัยมีเสถียรภาพ (PBSA) อย่างไรก็ตามone should keep in mind, that if the PBSA is anenzyme, its products should not interfere with thebiochemical reaction of the desired enzyme electrode.In our laboratory we have constructed a batch biosensorfor glucose using immobilized GOD and for sucroseusing immobilized multienzyme system (invertase, mutarotaseand glucose oxidase) and tested for repeateduse. In an attempt to enhance the operating stability ofthe biosensor, we have found that incorporation oflysozyme as PBSA can achieve this objective substantially,and the results are reported in this paper.2. Materials and methods2.1. MaterialsGlucose oxidase (E.C. 1.1.3.4.) from Aspergillus niger(specific activity*/180 IU/mg), invertase (E.C. 3.2.1.26)from yeast (specific activity*/400 IU/mg), mutarotase(E.C. 5.1.3.3.) from hog kidney (specific activity*/2500IU/mg), lysozyme, BSA, gelatin and glutaraldehydewere procured from M/s sigma, USA, the cellophanemembrane molecular weight cut-off 6000/8000 fromSpectra/por, USA and oxygen permeable teflon membranefrom WTW, Germany. For the biosensor, thedissolved oxygen was measured by an oxygen meter(EDT, UK) containing a Clark electrode.2.2. Enzyme immobilizationGlucose oxidase as well as the multienzyme systemwas immobilized by crosslinking method reported byWilson (1990), modified slightly. Ten milligrams ofglucose oxidase (1800 IU), 1 mg of each invertase (852IU) and mutarotase (2500 IU) were dissolved in 1 ml of0.05 M phosphate buffer, pH 6.0. Two hundred milligramsof each PBSA was dissolved in 1 ml of 0.05 Msodium phosphate buffer, pH 6.0. Glutaraldehyde solution(2.5% (w/v)) was prepared by appropriate dilutionof 70% (w/v) glutaraldehyde. On a 2/2 cm cellophanemembrane, predetermined concentration of the invertase,mutarotase and GOD and 30 ml (6mg) of the PBSAwere placed and mixed thoroughly using a glass rod.Fifty microlitres of 2.5% glutaraldehyde was then addedand mixed thoroughly again so that enzyme and thePBSA got distributed uniformly throughout the enzymemembrane. After 1 h, the enzyme membrane waswashed three times with 0.05 M phosphate buffer, pH7.0, to remove the excess glutaraldehyde. For theimmobilization of glucose oxidase, instead of usingmultienzymes, single enzyme was used.2.3. Enzyme electrode constructionThe details of the construction of the enzyme electrodeand operation have been reported earlier (Goudaet al., 1997). A detachable membrane unit (DMU)consisting of a teflon membrane and a cellophanemembrane with the enzyme layer, held in a sandwichform and secured tightly with an ‘O’ ring fitted on to theelectrode surface as reported by Gouda et al. (2001) hasbeen used.2.4. Operational stability studiesThe operational stability studies on the single andmultienzyme system immobilized with different PBSAswas carried out at 259/1 8C. The enzyme activity wasmeasured by immersing the enzyme sensing element in a25 ml glass container having 5 ml buffer, kept agitatedcontinuously with air bubbled through an aquariumpump. After bubbling of air for 2 min (for saturation)the dissolved oxygen meter was set by fixing thedissolved oxygen at 100%. Fifty microlitres of 10%glucose or sucrose solution was now injected anddecrease in the % dissolved oxygen at the end of 3min (time taken to reach steady state)was monitored,which represents the activity of the immobilized enzymefor that concentration of glucose or sucrose. If the firstanalysis response in % dissolved oxygen is ‘a’ andresponse at any time on the nth analysis is ‘b’, then %activity retained is calculated as [b/a]/100. In order toquantify the operational stability of several PBSAsincorporated into the immobilized enzyme preparationssimultaneously, a DMU was constructed for each PBSAseparately. The DMU containing the immobilized enzymemembrane system was then fixed to the electrodeand the change in the response in % dissolved oxygenwas measured by injecting 50 ml of 10% glucose and 100ml of 10% sucrose, respectively, for the single andmultienzyme membrane system. After analysing aboutsix samples of the same concentration of the sugar, theDMU was now kept in 10 ml of buffer at 279/1 8C.Another DMU containing a different PBSA nowreplaced the earlier one and the activity was measured.The same procedure was repeated for all the DMUs,every day until the activity fell down to less than 40% of
the initial value.
3. Results and discussion
Fig. 1 demonstrates the operational stability of the
enzyme electrode for glucose containing GOD immobilized
with different PBSAs in 50 mM phosphate buffer,
504 M.D. Gouda et al. / Biosensors and Bioelectronics 17 (2002) 503/507
pH 6.0. Lysozyme was found to be the best for the
stabilization of GOD among the PBSAs tested, followed
by BSA and gelatin. Immobilization without any
additive gave virtually no enzyme activity. Repeated
measurements with 30 ml of 10% glucose solution were
carried out. For GOD immobilized with lysozyme, it
was possible to analyse 750 samples during 230 days of
operation at the end of which 50% of the initial activity
of the immobilized GOD was retained. With BSA as
PBSA it was possible to analyse slightly reduced number
of 520 samples during 150 days of operation and with
gelatin as PBSA it was possible to analyse only 245
samples during 60 days of operation. Another significant
observation from Fig. 1 is that the reproducibility
of the biosensor signal for GOD immobilized with BSA
is poor. Corresponding behaviour of GOD immobilized
with lysozyme as PBSA was very stable.
Fig. 2 demonstrates the operational stability of the
sensin
the initial value.
3. Results and discussion
Fig. 1 demonstrates the operational stability of the
enzyme electrode for glucose containing GOD immobilized
with different PBSAs in 50 mM phosphate buffer,
504 M.D. Gouda et al. / Biosensors and Bioelectronics 17 (2002) 503/507
pH 6.0. Lysozyme was found to be the best for the
stabilization of GOD among the PBSAs tested, followed
by BSA and gelatin. Immobilization without any
additive gave virtually no enzyme activity. Repeated
measurements with 30 ml of 10% glucose solution were
carried out. For GOD immobilized with lysozyme, it
was possible to analyse 750 samples during 230 days of
operation at the end of which 50% of the initial activity
of the immobilized GOD was retained. With BSA as
PBSA it was possible to analyse slightly reduced number
of 520 samples during 150 days of operation and with
gelatin as PBSA it was possible to analyse only 245
samples during 60 days of operation. Another significant
observation from Fig. 1 is that the reproducibility
of the biosensor signal for GOD immobilized with BSA
is poor. Corresponding behaviour of GOD immobilized
with lysozyme as PBSA was very stable.
Fig. 2 demonstrates the operational stability of the
sensin
การแปล กรุณารอสักครู่..
การเพิ่มประสิทธิภาพของความมั่นคงการดำเนินงานของไบโอเซนเซอร์เอนไซม์
กลูโคสและซูโครสโดยใช้โปรตีนจากการรักษาเสถียรภาพตัวแทน
MD เกาซาชูเซตส์มาร์ก, MS Thakur, NG Karanth *
เซ็นทรัลฟู้ดเทคโนโลยีสถาบันวิจัยซอร์ 570013 อินเดีย
ขกลางตราสารสิ่งอำนวยความสะดวกและบริการ, เซ็นทรัลฟู้ดเทคโนโลยีสถาบันวิจัยซอร์ 570013 อินเดีย
ได้รับ 7 มีนาคม 2001; ได้รับการแก้ไขในรูปแบบ 7 พฤศจิกายน 2001; ได้รับการยอมรับ 19 ธันวาคม 2001
บทคัดย่อ
กับการรวมตัวของไลโซไซม์ในระหว่างขั้นตอนการตรึง, การเพิ่มประสิทธิภาพมากของความมั่นคงในการดำเนินงานของ
ไบโอเซนเซอร์ได้แสดงให้เห็นในกรณีของเอนไซม์ตรึงเดียว (oxidase กลูโคส) ของระบบสำหรับกลูโคสและร่วมกับเอนไซม์
(อินเวอร์, mutarotase และกลูโคส oxidase) สำหรับน้ำตาลซูโครส ดังนั้นจำนวนที่เพิ่มขึ้นของการวิเคราะห์ซ้ำของ 750 ตัวอย่าง
ในช่วง 230 วันกลูโคสและ 400 ตัวอย่างในช่วง 40 วันของการดำเนินงานสำหรับซูโครสได้รับการประสบความสำเร็จ การดำเนินงานที่เพิ่มขึ้น
ความมั่นคงของระบบตรึงเดียวและร่วมกับเอนไซม์ที่จะช่วยเพิ่มประสิทธิภาพค่าใช้จ่ายการดำเนินงานของไบโอเซนเซอร์ # 2002
เอลส์วิทยาศาสตร์ BV สงวนลิขสิทธิ์.
คำสำคัญ: ไบโอเซนเซอร์; เอนไซม์ตรึง; ความมั่นคงในการดำเนินงาน; โปรตีนจากตัวแทนการรักษาเสถียรภาพ; หน่วยเมมเบรนที่ถอดออกได้
1 บทนำ
ตรึงเอนไซม์ไบโอเซนเซอร์ตามที่ได้รับการ
ใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับการวิเคราะห์ในอาหารและการหมัก
อุตสาหกรรม (Coulet และเบอร์ทรานด์, 1979; Scheller และ
Karsten 1983; Sheper, 1992) ในการตรวจสอบด้านสิ่งแวดล้อม
(Schmidt และ Scheller, 1989) และในทางคลินิก
การวินิจฉัย (เมสัน และเฮนด์ 1984) .Biosensors สำหรับ
กลูโคสและซูโครสที่มีการใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับอาหารและ
วิเคราะห์ตัวอย่างการหมัก (Danielsson 1994; Hundech
et al, 1992;. Scheller และ Renniberg 1983; Xu et
al, 1989;. มัตสึ et al, , 1988) ที่สำคัญ
ในการพิจารณาการใช้ประโยชน์ของไบโอเซนเซอร์
คือการดำเนินชีวิตขององค์ประกอบการตรวจวัดโดยเฉพาะอย่างยิ่ง
ในขณะที่การตรวจสอบอาหารและการวิเคราะห์การหมัก
สารตั้งต้นที่มีความเข้มข้นสูง เมื่อ
เอนไซม์ตรึงถูกนำมาใช้เพื่อการนี้
การสูญเสียกิจกรรมเนื่องจากการสูญเสียสภาพธรรมชาติและการเสื่อมของ
เอนไซม์ลดชีวิตของเซ็นเซอร์ ดังนั้น
เทคนิคเพื่อเพิ่มการจัดเก็บและการดำเนินงาน
ความมั่นคงของอิเล็กโทรดเอนไซม์มีความสำคัญใน
การประยุกต์ใช้ไบโอเซนเซอร์ไฟฟ้าเคมี ความพยายามที่จะ
รักษาเสถียรภาพของเอนไซม์รายงานในวรรณคดีรวมถึงการใช้
polyelectrolytes ประจุบวก (Gavalas และ Channiotakis,
2000) polyelectrolytes และน้ำตาลแอลกอฮอล์ (กิบสัน et
al., 1992) การตรึงเอนไซม์และเม
ซับซ้อน CPG (แอปเปิลตัน et al., 1997) และการตรึง
เอนไซม์บนขั้วไฟฟ้าวางคาร์บอนไดออกไซด์ใน
การปรากฏตัวของสารเติมแต่งต่างๆ (Lutz et al., 1995).
หนึ่งในวิธีการตรึงเอนไซม์ที่เหมาะสม
สำหรับการใช้งานไบโอเซนเซอร์จะเชื่อมขวางโดยใช้
glutaraldehyde Glutaraldehyde เป็น bifunctional แข็งแกร่ง
น้ำยาปรับเปลี่ยนเอนไซม์อย่างมากนำไปสู่
การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างและการสูญเสียของกิจกรรม (รน,
1976) นี้มีผลเป็นอันตรายสามารถลดโดยใช้
โปรตีนเฉื่อยเช่นบีเอสเอ, เจลาตินและไลซีน thrombin.
โปรตีนเหล่านี้หลีกเลี่ยงการที่มากเกินไปของ crosslinkages ภายในโมเลกุล
เอนไซม์ภายในและเพิ่มโมเลกุล
เชื่อมโยงระหว่างเอนไซม์และโปรตีนเฉื่อย
(รน et al., 1973) ในขณะที่มันเป็นที่รู้จักกันว่าโปรตีนเฉื่อย
สามารถทำหน้าที่เป็นเอนไซม์เสถียรภาพตัวแทนแอพลิเคชันที่ได้
รับการ จำกัด ให้บีเอสเอและเจลาติน ในมุมมองของ
การสังเกตการณ์รายงานว่าโปรตีนผิวฟรี
(ช้างและฮอนี่ย์, 1995) และความทนทานของ
โปรตีนที่ผู้ให้บริการ (Gabel, et al, 1970;. Gabel, 1973) เล่น
บทบาทสำคัญในการรักษาเสถียรภาพของเอนไซม์มันค่อนข้าง
เป็นไปได้ว่าโปรตีนที่มีเสถียรภาพ อื่น ๆ นอกเหนือจากบีเอสเอและเจลาติน
* ผู้เขียนที่สอดคล้องกัน Tel .: 91-821-513-658; โทรสาร: 91-821-517-
233
E-mail address:. ferm@cscftri.ren.nic.in (NG Karanth)
? และไบโอเซนเซอร์ Bioelectronics 17 (2002) 503/507
www.elsevier.com/locate/bios
0956-5663 / 02 / $ - เห็นว่าด้านหน้า # 2002 เอลส์วิทยาศาสตร์ BV สงวนลิขสิทธิ์.
PII: S 0 9 5 มิถุนายน - 5 มิถุนายน 6 3 (0 2) 0 0 0 2 1 - 0
แสดง complimentarity ดีขึ้นด้วยเอนไซม์ให้
เสถียรภาพที่ดีขึ้นของฟรีเช่นเดียวกับการตรึง
เอนไซม์เตรียม การรักษาเสถียรภาพของเอนไซม์ที่ต้องการ
สามารถทำได้โดยใช้โปรตีนบางอย่างที่อาจจะ
ใช้งานหรือไม่ใช้งานแบบเร่งปฏิกิริยา ในบทความนี้เราจะเรียก
พวกเขาเป็นโปรตีนจากตัวแทนการรักษาเสถียรภาพ (PBSA) อย่างไรก็ตาม
หนึ่งควรเก็บไว้ในใจว่าถ้า PBSA เป็น
เอนไซม์ผลิตภัณฑ์ของ บริษัท ไม่ควรยุ่งเกี่ยวกับ
ปฏิกิริยาทางชีวเคมีของเอนไซม์อิเล็กโทรดที่ต้องการ.
ในห้องปฏิบัติการของเราที่เราได้สร้างชุดไบโอเซนเซอร์
กลูโคสใช้ตรึงพระเจ้าและซูโครส
ใช้ตรึง ระบบร่วมกับเอนไซม์ (อินเวอร์, mutarotase
และ oxidase กลูโคส) และทดสอบซ้ำสำหรับ
การใช้งาน ในความพยายามที่จะเสริมสร้างความมั่นคงในการดำเนินงานของ
ไบโอเซนเซอร์ที่เราได้พบว่าการรวมตัวกันของ
ไลโซไซม์เป็น PBSA สามารถบรรลุวัตถุประสงค์นี้อย่างมีนัยสำคัญ
และผลที่มีการรายงานในบทความนี้.
2 วัสดุและวิธีการ
2.1 วัสดุ
oxidase กลูโคส (EC 1.1.3.4.) จากเชื้อรา Aspergillus ไนเจอร์
(เฉพาะกิจกรรม * / 180 IU / mg), อินเวอร์ (EC 3.2.1.26)
จากยีสต์ (เฉพาะกิจกรรม * / 400 IU / มก.) mutarotase
(EC 5.1.3.3 .) จากไตหมู (เฉพาะกิจกรรม * / 2,500
IU / มก.) ไลโซไซม์บีเอสเอเจลาตินและ glutaraldehyde
ถูกจัดหาจาก M / s ซิกสหรัฐอเมริกากระดาษแก้ว
น้ำหนักโมเลกุลเยื่อตัด 6000/8000 จาก
Spectra / por, สหรัฐอเมริกาและออกซิเจนซึมผ่านเยื่อหุ้มเทฟลอน
จาก WTW เยอรมนี สำหรับไบโอเซนเซอร์,
ออกซิเจนละลายโดยวัดจากออกซิเจนเมตร
(EDT สหราชอาณาจักร) ที่มีอิเล็กโทรดคลาร์ก.
2.2 การตรึงเอนไซม์
oxidase กลูโคสเช่นเดียวกับระบบร่วมกับเอนไซม์ที่
ถูกตรึงโดยวิธีการเชื่อมขวางรายงานโดย
วิลสัน (1990), การแก้ไขเล็กน้อย สิบมิลลิกรัมของ
oxidase กลูโคส (1,800 IU) 1 มิลลิกรัมของแต่ละ invertase (852
IU) และ mutarotase (2,500 IU) ถูกกลืนหายไปใน 1 มิลลิลิตร
0.05 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ค่า pH 6.0 สองร้อยมิลลิกรัม
ของแต่ละ PBSA ถูกละลายใน 1 ml 0.05 M
โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ค่า pH 6.0 วิธีการแก้ปัญหา Glutaraldehyde
(2.5% (w / v)) ได้รับการจัดทำขึ้นโดยการลดสัดส่วนที่เหมาะสม
70% (w / v) glutaraldehyde เมื่อวันที่ 2/2 ซมกระดาษแก้ว
เมมเบรนความเข้มข้นที่กำหนดไว้ของอินเวอร์,
mutarotase และพระเจ้าและ 30 มล. (6mg) ของ PBSA
ถูกวางไว้และผสมโดยใช้แท่งแก้ว.
ห้าสิบ microlitres 2.5% glutaraldehyde ถูกเพิ่มเข้ามาแล้ว
และผสม อีกครั้งเพื่อให้เอนไซม์และ
PBSA ได้กระจายอย่างสม่ำเสมอตลอดทั้งเอนไซม์
เมมเบรน หลังจาก 1 ชั่วโมง, เมมเบรนเอนไซม์ที่ถูก
ล้างสามครั้งด้วย 0.05 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ค่า pH
7.0 ที่จะลบ glutaraldehyde ส่วนเกิน สำหรับการ
ตรึงเอนไซม์กลูโคสแทนการใช้
multienzymes เอนไซม์เดียวถูกนำมาใช้.
2.3 อิเล็กโทรดเอนไซม์ก่อสร้าง
รายละเอียดของการก่อสร้างของอิเล็กโทรดเอนไซม์
และการดำเนินงานได้รับการรายงานก่อนหน้านี้ (เกา
et al., 1997) หน่วยเมมเบรนที่ถอดออกได้ (อย่า)
ประกอบด้วยเยื่อหุ้มเทฟลอนและกระดาษแก้ว
เมมเบรนที่มีชั้นเอนไซม์ที่จัดขึ้นในแซนวิช
รูปแบบและการรักษาความปลอดภัยอย่างแน่นหนากับแหวน 'O' ติดตั้งไปยัง
พื้นผิวอิเล็กโทรดตามการรายงานของเกา et al, (2001) ได้
ถูกนำมาใช้.
2.4 การศึกษาความมั่นคงในการดำเนินงาน
การศึกษาความมั่นคงในการดำเนินงานที่เดียวและ
ระบบร่วมกับเอนไซม์ตรึงกับ PBSAs ที่แตกต่างกัน
ได้ดำเนินการที่ 259/1 8C เอนไซม์ที่ถูก
วัดโดยการแช่เอนไซม์ตรวจจับองค์ประกอบใน
ภาชนะแก้ว 25 มล. มี 5 มล. บัฟเฟอร์เก็บใจ
อย่างต่อเนื่องกับฟองอากาศผ่านพิพิธภัณฑ์สัตว์น้ำ
เครื่องสูบน้ำ หลังจากที่ฟองอากาศเป็นเวลา 2 นาที (สำหรับอิ่มตัว)
เมตรออกซิเจนละลายถูกกำหนดโดยการแก้ไข
ออกซิเจนละลายที่ 100% ห้าสิบ microlitres 10%
กลูโคสหรือสารละลายน้ำตาลซูโครสถูกฉีดในขณะนี้และ
ลดลงในโฟลเดอร์% ออกซิเจนที่ละลายในตอนท้ายของ 3
นาที (เวลาที่จะไปถึงความมั่นคงของรัฐ) ได้รับการตรวจสอบ
ซึ่งแสดงให้เห็นถึงการทำงานของเอนไซม์ตรึง
ความเข้มข้นของน้ำตาลกลูโคสหรือว่า ซูโครส ถ้าเป็นครั้งแรกที่
การตอบสนองต่อการวิเคราะห์ใน% ออกซิเจนละลายคือ '' และ
การตอบสนองในเวลาในการวิเคราะห์ใด ๆ ที่เป็นที่ n 'b' แล้ว%
กิจกรรมที่เก็บไว้จะถูกคำนวณเป็น [/ b] / 100 เพื่อที่จะ
วัดปริมาณความมั่นคงในการดำเนินงานของ PBSAs หลาย
รวมอยู่ในการเตรียมเอนไซม์ตรึง
พร้อมกันอย่าถูกสร้างขึ้นสำหรับแต่ละ PBSA
แยกต่างหาก อย่ามีเอนไซม์ตรึง
ระบบเมมเบรนได้รับการแก้ไขแล้วอิเล็กโทรด
และการเปลี่ยนแปลงในการตอบสนองในการ% ปริมาณออกซิเจนละลายน้ำ
วัดโดยการฉีด 50 มล. ของน้ำตาลกลูโคส 10% และ 100
มล. ของน้ำตาลซูโครส 10% ตามลำดับสำหรับเดี่ยวและ
ร่วมกับเอนไซม์เมมเบรน ระบบ หลังจากการวิเคราะห์เกี่ยวกับ
หกตัวอย่างของความเข้มข้นเดียวกันของน้ำตาล
อย่าถูกเก็บไว้ในขณะนี้ใน 10 มล. ของ buffer ที่ 279/1 8C.
อย่ามีอีก PBSA ที่แตกต่างกันในขณะนี้
แทนที่ก่อนหน้านี้หนึ่งและกิจกรรมการวัด.
เป็นขั้นตอนเดียวกัน ซ้ำสำหรับทุก DMUs,
ทุกวันจนกว่ากิจกรรมทรุดตัวลงจะน้อยกว่า 40% ของ
ค่าเริ่มต้น.
3 และการอภิปรายผล
มะเดื่อ 1 แสดงให้เห็นถึงความมั่นคงในการดำเนินงานของ
อิเล็กโทรดเอนไซม์กลูโคสที่มีพระเจ้าตรึง
กับ PBSAs แตกต่างกันใน 50 มิลลิฟอสเฟตบัฟเฟอร์,
504 MD เกา et al, / ไบโอเซนเซอร์และ Bioelectronics 17 (2002) 503? / 507
พีเอช 6.0 ไลโซไซม์พบว่าเป็นสิ่งที่ดีที่สุดสำหรับ
การรักษาเสถียรภาพของพระเจ้าในหมู่ PBSAs ทดสอบตาม
โดยบีเอสเอและเจลาติน โดยไม่ต้องมีการตรึง
สารเติมแต่งให้แทบไม่มีเอนไซม์ ซ้ำแล้วซ้ำอีก
วัดที่มี 30 มล. ของการแก้ปัญหาน้ำตาลกลูโคส 10% ได้รับการ
ดำเนินการ สำหรับพระเจ้าตรึงกับไลโซไซม์ก็
เป็นไปได้ในการวิเคราะห์ตัวอย่าง 750 ในช่วง 230 วันของการ
ดำเนินงานในตอนท้ายของซึ่ง 50% ของกิจกรรมเริ่มต้น
ของพระเจ้าตรึงไว้ กับบีเอสเอเป็น
PBSA มันเป็นไปได้ในการวิเคราะห์จำนวนลดลงเล็กน้อย
จาก 520 ตัวอย่างในช่วง 150 วันของการดำเนินงานและ
เจลาตินเป็น PBSA มันเป็นไปได้ในการวิเคราะห์เพียง 245
ตัวอย่างในช่วง 60 วันของการดำเนินงาน อีกอย่างมีนัยสำคัญ
จากการสังเกตรูป 1 คือว่าการทำสำเนา
ของสัญญาณไบโอเซนเซอร์สำหรับพระเจ้าตรึงกับบีเอสเอ
เป็นที่น่าสงสาร พฤติกรรมที่สอดคล้องกันของพระเจ้าตรึง
กับไลโซไซม์เป็น PBSA มีเสถียรภาพมาก.
รูป 2 แสดงให้เห็นถึงความมั่นคงในการดำเนินงานของ
sensin
กลูโคสและซูโครสโดยใช้โปรตีนจากการรักษาเสถียรภาพตัวแทน
MD เกาซาชูเซตส์มาร์ก, MS Thakur, NG Karanth *
เซ็นทรัลฟู้ดเทคโนโลยีสถาบันวิจัยซอร์ 570013 อินเดีย
ขกลางตราสารสิ่งอำนวยความสะดวกและบริการ, เซ็นทรัลฟู้ดเทคโนโลยีสถาบันวิจัยซอร์ 570013 อินเดีย
ได้รับ 7 มีนาคม 2001; ได้รับการแก้ไขในรูปแบบ 7 พฤศจิกายน 2001; ได้รับการยอมรับ 19 ธันวาคม 2001
บทคัดย่อ
กับการรวมตัวของไลโซไซม์ในระหว่างขั้นตอนการตรึง, การเพิ่มประสิทธิภาพมากของความมั่นคงในการดำเนินงานของ
ไบโอเซนเซอร์ได้แสดงให้เห็นในกรณีของเอนไซม์ตรึงเดียว (oxidase กลูโคส) ของระบบสำหรับกลูโคสและร่วมกับเอนไซม์
(อินเวอร์, mutarotase และกลูโคส oxidase) สำหรับน้ำตาลซูโครส ดังนั้นจำนวนที่เพิ่มขึ้นของการวิเคราะห์ซ้ำของ 750 ตัวอย่าง
ในช่วง 230 วันกลูโคสและ 400 ตัวอย่างในช่วง 40 วันของการดำเนินงานสำหรับซูโครสได้รับการประสบความสำเร็จ การดำเนินงานที่เพิ่มขึ้น
ความมั่นคงของระบบตรึงเดียวและร่วมกับเอนไซม์ที่จะช่วยเพิ่มประสิทธิภาพค่าใช้จ่ายการดำเนินงานของไบโอเซนเซอร์ # 2002
เอลส์วิทยาศาสตร์ BV สงวนลิขสิทธิ์.
คำสำคัญ: ไบโอเซนเซอร์; เอนไซม์ตรึง; ความมั่นคงในการดำเนินงาน; โปรตีนจากตัวแทนการรักษาเสถียรภาพ; หน่วยเมมเบรนที่ถอดออกได้
1 บทนำ
ตรึงเอนไซม์ไบโอเซนเซอร์ตามที่ได้รับการ
ใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับการวิเคราะห์ในอาหารและการหมัก
อุตสาหกรรม (Coulet และเบอร์ทรานด์, 1979; Scheller และ
Karsten 1983; Sheper, 1992) ในการตรวจสอบด้านสิ่งแวดล้อม
(Schmidt และ Scheller, 1989) และในทางคลินิก
การวินิจฉัย (เมสัน และเฮนด์ 1984) .Biosensors สำหรับ
กลูโคสและซูโครสที่มีการใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับอาหารและ
วิเคราะห์ตัวอย่างการหมัก (Danielsson 1994; Hundech
et al, 1992;. Scheller และ Renniberg 1983; Xu et
al, 1989;. มัตสึ et al, , 1988) ที่สำคัญ
ในการพิจารณาการใช้ประโยชน์ของไบโอเซนเซอร์
คือการดำเนินชีวิตขององค์ประกอบการตรวจวัดโดยเฉพาะอย่างยิ่ง
ในขณะที่การตรวจสอบอาหารและการวิเคราะห์การหมัก
สารตั้งต้นที่มีความเข้มข้นสูง เมื่อ
เอนไซม์ตรึงถูกนำมาใช้เพื่อการนี้
การสูญเสียกิจกรรมเนื่องจากการสูญเสียสภาพธรรมชาติและการเสื่อมของ
เอนไซม์ลดชีวิตของเซ็นเซอร์ ดังนั้น
เทคนิคเพื่อเพิ่มการจัดเก็บและการดำเนินงาน
ความมั่นคงของอิเล็กโทรดเอนไซม์มีความสำคัญใน
การประยุกต์ใช้ไบโอเซนเซอร์ไฟฟ้าเคมี ความพยายามที่จะ
รักษาเสถียรภาพของเอนไซม์รายงานในวรรณคดีรวมถึงการใช้
polyelectrolytes ประจุบวก (Gavalas และ Channiotakis,
2000) polyelectrolytes และน้ำตาลแอลกอฮอล์ (กิบสัน et
al., 1992) การตรึงเอนไซม์และเม
ซับซ้อน CPG (แอปเปิลตัน et al., 1997) และการตรึง
เอนไซม์บนขั้วไฟฟ้าวางคาร์บอนไดออกไซด์ใน
การปรากฏตัวของสารเติมแต่งต่างๆ (Lutz et al., 1995).
หนึ่งในวิธีการตรึงเอนไซม์ที่เหมาะสม
สำหรับการใช้งานไบโอเซนเซอร์จะเชื่อมขวางโดยใช้
glutaraldehyde Glutaraldehyde เป็น bifunctional แข็งแกร่ง
น้ำยาปรับเปลี่ยนเอนไซม์อย่างมากนำไปสู่
การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างและการสูญเสียของกิจกรรม (รน,
1976) นี้มีผลเป็นอันตรายสามารถลดโดยใช้
โปรตีนเฉื่อยเช่นบีเอสเอ, เจลาตินและไลซีน thrombin.
โปรตีนเหล่านี้หลีกเลี่ยงการที่มากเกินไปของ crosslinkages ภายในโมเลกุล
เอนไซม์ภายในและเพิ่มโมเลกุล
เชื่อมโยงระหว่างเอนไซม์และโปรตีนเฉื่อย
(รน et al., 1973) ในขณะที่มันเป็นที่รู้จักกันว่าโปรตีนเฉื่อย
สามารถทำหน้าที่เป็นเอนไซม์เสถียรภาพตัวแทนแอพลิเคชันที่ได้
รับการ จำกัด ให้บีเอสเอและเจลาติน ในมุมมองของ
การสังเกตการณ์รายงานว่าโปรตีนผิวฟรี
(ช้างและฮอนี่ย์, 1995) และความทนทานของ
โปรตีนที่ผู้ให้บริการ (Gabel, et al, 1970;. Gabel, 1973) เล่น
บทบาทสำคัญในการรักษาเสถียรภาพของเอนไซม์มันค่อนข้าง
เป็นไปได้ว่าโปรตีนที่มีเสถียรภาพ อื่น ๆ นอกเหนือจากบีเอสเอและเจลาติน
* ผู้เขียนที่สอดคล้องกัน Tel .: 91-821-513-658; โทรสาร: 91-821-517-
233
E-mail address:. ferm@cscftri.ren.nic.in (NG Karanth)
? และไบโอเซนเซอร์ Bioelectronics 17 (2002) 503/507
www.elsevier.com/locate/bios
0956-5663 / 02 / $ - เห็นว่าด้านหน้า # 2002 เอลส์วิทยาศาสตร์ BV สงวนลิขสิทธิ์.
PII: S 0 9 5 มิถุนายน - 5 มิถุนายน 6 3 (0 2) 0 0 0 2 1 - 0
แสดง complimentarity ดีขึ้นด้วยเอนไซม์ให้
เสถียรภาพที่ดีขึ้นของฟรีเช่นเดียวกับการตรึง
เอนไซม์เตรียม การรักษาเสถียรภาพของเอนไซม์ที่ต้องการ
สามารถทำได้โดยใช้โปรตีนบางอย่างที่อาจจะ
ใช้งานหรือไม่ใช้งานแบบเร่งปฏิกิริยา ในบทความนี้เราจะเรียก
พวกเขาเป็นโปรตีนจากตัวแทนการรักษาเสถียรภาพ (PBSA) อย่างไรก็ตาม
หนึ่งควรเก็บไว้ในใจว่าถ้า PBSA เป็น
เอนไซม์ผลิตภัณฑ์ของ บริษัท ไม่ควรยุ่งเกี่ยวกับ
ปฏิกิริยาทางชีวเคมีของเอนไซม์อิเล็กโทรดที่ต้องการ.
ในห้องปฏิบัติการของเราที่เราได้สร้างชุดไบโอเซนเซอร์
กลูโคสใช้ตรึงพระเจ้าและซูโครส
ใช้ตรึง ระบบร่วมกับเอนไซม์ (อินเวอร์, mutarotase
และ oxidase กลูโคส) และทดสอบซ้ำสำหรับ
การใช้งาน ในความพยายามที่จะเสริมสร้างความมั่นคงในการดำเนินงานของ
ไบโอเซนเซอร์ที่เราได้พบว่าการรวมตัวกันของ
ไลโซไซม์เป็น PBSA สามารถบรรลุวัตถุประสงค์นี้อย่างมีนัยสำคัญ
และผลที่มีการรายงานในบทความนี้.
2 วัสดุและวิธีการ
2.1 วัสดุ
oxidase กลูโคส (EC 1.1.3.4.) จากเชื้อรา Aspergillus ไนเจอร์
(เฉพาะกิจกรรม * / 180 IU / mg), อินเวอร์ (EC 3.2.1.26)
จากยีสต์ (เฉพาะกิจกรรม * / 400 IU / มก.) mutarotase
(EC 5.1.3.3 .) จากไตหมู (เฉพาะกิจกรรม * / 2,500
IU / มก.) ไลโซไซม์บีเอสเอเจลาตินและ glutaraldehyde
ถูกจัดหาจาก M / s ซิกสหรัฐอเมริกากระดาษแก้ว
น้ำหนักโมเลกุลเยื่อตัด 6000/8000 จาก
Spectra / por, สหรัฐอเมริกาและออกซิเจนซึมผ่านเยื่อหุ้มเทฟลอน
จาก WTW เยอรมนี สำหรับไบโอเซนเซอร์,
ออกซิเจนละลายโดยวัดจากออกซิเจนเมตร
(EDT สหราชอาณาจักร) ที่มีอิเล็กโทรดคลาร์ก.
2.2 การตรึงเอนไซม์
oxidase กลูโคสเช่นเดียวกับระบบร่วมกับเอนไซม์ที่
ถูกตรึงโดยวิธีการเชื่อมขวางรายงานโดย
วิลสัน (1990), การแก้ไขเล็กน้อย สิบมิลลิกรัมของ
oxidase กลูโคส (1,800 IU) 1 มิลลิกรัมของแต่ละ invertase (852
IU) และ mutarotase (2,500 IU) ถูกกลืนหายไปใน 1 มิลลิลิตร
0.05 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ค่า pH 6.0 สองร้อยมิลลิกรัม
ของแต่ละ PBSA ถูกละลายใน 1 ml 0.05 M
โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ค่า pH 6.0 วิธีการแก้ปัญหา Glutaraldehyde
(2.5% (w / v)) ได้รับการจัดทำขึ้นโดยการลดสัดส่วนที่เหมาะสม
70% (w / v) glutaraldehyde เมื่อวันที่ 2/2 ซมกระดาษแก้ว
เมมเบรนความเข้มข้นที่กำหนดไว้ของอินเวอร์,
mutarotase และพระเจ้าและ 30 มล. (6mg) ของ PBSA
ถูกวางไว้และผสมโดยใช้แท่งแก้ว.
ห้าสิบ microlitres 2.5% glutaraldehyde ถูกเพิ่มเข้ามาแล้ว
และผสม อีกครั้งเพื่อให้เอนไซม์และ
PBSA ได้กระจายอย่างสม่ำเสมอตลอดทั้งเอนไซม์
เมมเบรน หลังจาก 1 ชั่วโมง, เมมเบรนเอนไซม์ที่ถูก
ล้างสามครั้งด้วย 0.05 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ค่า pH
7.0 ที่จะลบ glutaraldehyde ส่วนเกิน สำหรับการ
ตรึงเอนไซม์กลูโคสแทนการใช้
multienzymes เอนไซม์เดียวถูกนำมาใช้.
2.3 อิเล็กโทรดเอนไซม์ก่อสร้าง
รายละเอียดของการก่อสร้างของอิเล็กโทรดเอนไซม์
และการดำเนินงานได้รับการรายงานก่อนหน้านี้ (เกา
et al., 1997) หน่วยเมมเบรนที่ถอดออกได้ (อย่า)
ประกอบด้วยเยื่อหุ้มเทฟลอนและกระดาษแก้ว
เมมเบรนที่มีชั้นเอนไซม์ที่จัดขึ้นในแซนวิช
รูปแบบและการรักษาความปลอดภัยอย่างแน่นหนากับแหวน 'O' ติดตั้งไปยัง
พื้นผิวอิเล็กโทรดตามการรายงานของเกา et al, (2001) ได้
ถูกนำมาใช้.
2.4 การศึกษาความมั่นคงในการดำเนินงาน
การศึกษาความมั่นคงในการดำเนินงานที่เดียวและ
ระบบร่วมกับเอนไซม์ตรึงกับ PBSAs ที่แตกต่างกัน
ได้ดำเนินการที่ 259/1 8C เอนไซม์ที่ถูก
วัดโดยการแช่เอนไซม์ตรวจจับองค์ประกอบใน
ภาชนะแก้ว 25 มล. มี 5 มล. บัฟเฟอร์เก็บใจ
อย่างต่อเนื่องกับฟองอากาศผ่านพิพิธภัณฑ์สัตว์น้ำ
เครื่องสูบน้ำ หลังจากที่ฟองอากาศเป็นเวลา 2 นาที (สำหรับอิ่มตัว)
เมตรออกซิเจนละลายถูกกำหนดโดยการแก้ไข
ออกซิเจนละลายที่ 100% ห้าสิบ microlitres 10%
กลูโคสหรือสารละลายน้ำตาลซูโครสถูกฉีดในขณะนี้และ
ลดลงในโฟลเดอร์% ออกซิเจนที่ละลายในตอนท้ายของ 3
นาที (เวลาที่จะไปถึงความมั่นคงของรัฐ) ได้รับการตรวจสอบ
ซึ่งแสดงให้เห็นถึงการทำงานของเอนไซม์ตรึง
ความเข้มข้นของน้ำตาลกลูโคสหรือว่า ซูโครส ถ้าเป็นครั้งแรกที่
การตอบสนองต่อการวิเคราะห์ใน% ออกซิเจนละลายคือ '' และ
การตอบสนองในเวลาในการวิเคราะห์ใด ๆ ที่เป็นที่ n 'b' แล้ว%
กิจกรรมที่เก็บไว้จะถูกคำนวณเป็น [/ b] / 100 เพื่อที่จะ
วัดปริมาณความมั่นคงในการดำเนินงานของ PBSAs หลาย
รวมอยู่ในการเตรียมเอนไซม์ตรึง
พร้อมกันอย่าถูกสร้างขึ้นสำหรับแต่ละ PBSA
แยกต่างหาก อย่ามีเอนไซม์ตรึง
ระบบเมมเบรนได้รับการแก้ไขแล้วอิเล็กโทรด
และการเปลี่ยนแปลงในการตอบสนองในการ% ปริมาณออกซิเจนละลายน้ำ
วัดโดยการฉีด 50 มล. ของน้ำตาลกลูโคส 10% และ 100
มล. ของน้ำตาลซูโครส 10% ตามลำดับสำหรับเดี่ยวและ
ร่วมกับเอนไซม์เมมเบรน ระบบ หลังจากการวิเคราะห์เกี่ยวกับ
หกตัวอย่างของความเข้มข้นเดียวกันของน้ำตาล
อย่าถูกเก็บไว้ในขณะนี้ใน 10 มล. ของ buffer ที่ 279/1 8C.
อย่ามีอีก PBSA ที่แตกต่างกันในขณะนี้
แทนที่ก่อนหน้านี้หนึ่งและกิจกรรมการวัด.
เป็นขั้นตอนเดียวกัน ซ้ำสำหรับทุก DMUs,
ทุกวันจนกว่ากิจกรรมทรุดตัวลงจะน้อยกว่า 40% ของ
ค่าเริ่มต้น.
3 และการอภิปรายผล
มะเดื่อ 1 แสดงให้เห็นถึงความมั่นคงในการดำเนินงานของ
อิเล็กโทรดเอนไซม์กลูโคสที่มีพระเจ้าตรึง
กับ PBSAs แตกต่างกันใน 50 มิลลิฟอสเฟตบัฟเฟอร์,
504 MD เกา et al, / ไบโอเซนเซอร์และ Bioelectronics 17 (2002) 503? / 507
พีเอช 6.0 ไลโซไซม์พบว่าเป็นสิ่งที่ดีที่สุดสำหรับ
การรักษาเสถียรภาพของพระเจ้าในหมู่ PBSAs ทดสอบตาม
โดยบีเอสเอและเจลาติน โดยไม่ต้องมีการตรึง
สารเติมแต่งให้แทบไม่มีเอนไซม์ ซ้ำแล้วซ้ำอีก
วัดที่มี 30 มล. ของการแก้ปัญหาน้ำตาลกลูโคส 10% ได้รับการ
ดำเนินการ สำหรับพระเจ้าตรึงกับไลโซไซม์ก็
เป็นไปได้ในการวิเคราะห์ตัวอย่าง 750 ในช่วง 230 วันของการ
ดำเนินงานในตอนท้ายของซึ่ง 50% ของกิจกรรมเริ่มต้น
ของพระเจ้าตรึงไว้ กับบีเอสเอเป็น
PBSA มันเป็นไปได้ในการวิเคราะห์จำนวนลดลงเล็กน้อย
จาก 520 ตัวอย่างในช่วง 150 วันของการดำเนินงานและ
เจลาตินเป็น PBSA มันเป็นไปได้ในการวิเคราะห์เพียง 245
ตัวอย่างในช่วง 60 วันของการดำเนินงาน อีกอย่างมีนัยสำคัญ
จากการสังเกตรูป 1 คือว่าการทำสำเนา
ของสัญญาณไบโอเซนเซอร์สำหรับพระเจ้าตรึงกับบีเอสเอ
เป็นที่น่าสงสาร พฤติกรรมที่สอดคล้องกันของพระเจ้าตรึง
กับไลโซไซม์เป็น PBSA มีเสถียรภาพมาก.
รูป 2 แสดงให้เห็นถึงความมั่นคงในการดำเนินงานของ
sensin
การแปล กรุณารอสักครู่..
การเพิ่มเสถียรภาพการดำเนินงานของเอนไซม์ไบโอเซนเซอร์สำหรับ
กลูโคสและซูโครสโดยใช้โปรตีนจากสารเพิ่มความคงตัว
- กัวดา , ศศ . ม. คู B , วท.ม. Thakur , n.g. karanth A *
a สถาบันวิจัยเทคโนโลยีอาหารกลาง , Mysore 570013 บริการอินเดีย :
b ศูนย์เครื่องมือกลาง และ สถาบันวิจัยเทคโนโลยีอาหารกลาง , Mysore 570013 อินเดีย
ได้รับ 7 มีนาคม 2001ได้รับในการแก้ไขรูปที่ 7 พฤศจิกายน 2544 ; ยอมรับ 19 ธันวาคม 2544 บทคัดย่อ
กับการรวมตัวของไลโซไซม์ในการตรึงรูปขั้นตอนการมากของเสถียรภาพการดำเนินงานของ
ไบโอเซนเซอร์ได้แสดงในกรณีของเอนไซม์กลูโคสออกซิเดส ( เดี่ยว ) ระบบกลูโคสและ multienzyme
( เปรียบเทียบและ mutarotase , กลูโคสออกซิเดส ) ระบบซูโครสดังนั้น จำนวนที่เพิ่มขึ้นของซ้ำ การวิเคราะห์ตัวอย่าง
ระหว่าง 230 วัน 750 กลูโคสและ 400 ในช่วง 40 วันของการทำงานโดยได้รับความ การเพิ่มเสถียรภาพของระบบปฏิบัติการ
ตรึงเดียวและ multienzyme จะเพิ่มต้นทุนประสิทธิผลของไบโอเซนเซอร์ . # 2002
Elsevier Science นอกจากนี้สงวนลิขสิทธิ์ .
คำสำคัญ : ไบโอเซนเซอร์ ;การตรึงเอนไซม์ เสถียรภาพการดำเนินงาน โปรตีนจากสารเพิ่มความคงตัว ; หน่วยเยื่อแผ่นถอดออกได้
1 แนะนำเอนไซม์ไบโอเซนเซอร์ได้ตาม
ใช้กันอย่างแพร่หลายในการวิเคราะห์ในอาหารและอุตสาหกรรมการหมัก
( coulet กับเบอร์ทรานด์ , 1979 ; scheller และ
Karsten , 1983 ; sheper , 1992 ) ในการติดตามตรวจสอบผลกระทบสิ่งแวดล้อม
( ชมิดท์ และ scheller , 1989 ) และในคลินิก
กลูโคสและซูโครสโดยใช้โปรตีนจากสารเพิ่มความคงตัว
- กัวดา , ศศ . ม. คู B , วท.ม. Thakur , n.g. karanth A *
a สถาบันวิจัยเทคโนโลยีอาหารกลาง , Mysore 570013 บริการอินเดีย :
b ศูนย์เครื่องมือกลาง และ สถาบันวิจัยเทคโนโลยีอาหารกลาง , Mysore 570013 อินเดีย
ได้รับ 7 มีนาคม 2001ได้รับในการแก้ไขรูปที่ 7 พฤศจิกายน 2544 ; ยอมรับ 19 ธันวาคม 2544 บทคัดย่อ
กับการรวมตัวของไลโซไซม์ในการตรึงรูปขั้นตอนการมากของเสถียรภาพการดำเนินงานของ
ไบโอเซนเซอร์ได้แสดงในกรณีของเอนไซม์กลูโคสออกซิเดส ( เดี่ยว ) ระบบกลูโคสและ multienzyme
( เปรียบเทียบและ mutarotase , กลูโคสออกซิเดส ) ระบบซูโครสดังนั้น จำนวนที่เพิ่มขึ้นของซ้ำ การวิเคราะห์ตัวอย่าง
ระหว่าง 230 วัน 750 กลูโคสและ 400 ในช่วง 40 วันของการทำงานโดยได้รับความ การเพิ่มเสถียรภาพของระบบปฏิบัติการ
ตรึงเดียวและ multienzyme จะเพิ่มต้นทุนประสิทธิผลของไบโอเซนเซอร์ . # 2002
Elsevier Science นอกจากนี้สงวนลิขสิทธิ์ .
คำสำคัญ : ไบโอเซนเซอร์ ;การตรึงเอนไซม์ เสถียรภาพการดำเนินงาน โปรตีนจากสารเพิ่มความคงตัว ; หน่วยเยื่อแผ่นถอดออกได้
1 แนะนำเอนไซม์ไบโอเซนเซอร์ได้ตาม
ใช้กันอย่างแพร่หลายในการวิเคราะห์ในอาหารและอุตสาหกรรมการหมัก
( coulet กับเบอร์ทรานด์ , 1979 ; scheller และ
Karsten , 1983 ; sheper , 1992 ) ในการติดตามตรวจสอบผลกระทบสิ่งแวดล้อม
( ชมิดท์ และ scheller , 1989 ) และในคลินิก
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- ในการศึกษาอนาคตฉันอยากเรียนครู
- Mark, run
- เงินกู้ยืมระยะสั้นจากสถาบันการเงิน
- Regarding our capacity to production the
- กุมภาพันธ์
- the prisoners broke out of jail when the
- ฉันได้ออกใบแจ้งหนี้เรียบร้อยแล้วi've iss
- look down on
- What do leonardo da vinci, Paul McCartne
- ตอนนี้เรากำลังเจอกับปัญหาอีกครั้งเพราะว่
- ลองทำกิจกรรมใหม่
- NOSE MASK
- My name
- รักษาสุขภาพนะ
- chili paste
- From the picture, this place have no pri
- i com out too you is soo meny tings
- เงินกู้ยืมระยะสั้นจากสถาบันการเงิน
- ตกลงค่ะขอเวลาใช้หน่อยให้ฉันได้เรียนรุ้นิ
- Have a good dinner na kub
- เราไม่น่ารู้จักกันเลย
- ฉันเคยเห็น
- ในการศึกษาอนาคตฉันอยากเรียนครู
- ฉันจบการศึกษาระดับมัธยมศึกษาตอนต้นที่โรง
