2.5. Genetic relatedness by sequenc

2.5. Genetic relatedness by sequencing 16S rDNA
Genomic DNA of the new isolate was extracted using a commercial
kit (DNeasy Blood & Tissue, QIAGEN, Valencia, CA). Universal
primers specific for bacterial 16S rDNA were used in the
polymerase chain reaction, PCR (Weisburg, Barns, Pelletier, & Lane,
1991). The PCR included incubation at 94 _C for 3 min, followed by
30 cycles, each including 1 min at 94 _C,1 min at 52 _C, and 2min at
72 _C. The final extension was performed at 72 _C for 10 min. Theamplified 16S rDNA was purified using a commercial DNA extraction
kit (QIA quick gel extraction kit, QIAGEN). The amplified DNA
was sequenced by an automated DNA analyzer (Applied Biosystems,
Foster City, CA) at the Plant-Microbe Genomics Facility,
The Ohio State University. The derived DNA sequence was
compared to known bacteria in the National Center for Biotechnology
Information database (NCBI Genebank) using Basic Local
Alignment Search Tool (BLAST) algorithm.

2.6. Isolation and purification of antimicrobial agents
Strain OSY-7LA was inoculated in 500 ml tryptic soy broth in a
two liter baffled flask with a cotton plug and incubated in a rotary
shaker (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) at 30 _C for 36 h with
agitation at 200 rpm. Cells were removed by centrifugation at
7700 _ g for 15 min. The supernatant was mixed with 125 ml nbutanol
and agitated for one hour (Huang et al., 2009; McCormick
et al., 1998). Subsequently, the organic solvent phase was collected
and the solventwas removed at 40 _C, under vacuum, using a rotary
evaporator. The generated powder was dissolved in 5 ml Tris-Cl
buffer (0.02 mol/l, pH 7.0) followed by centrifugation and filtration
(0.22 mm, Millipore). Resultant filtrate (crude extract) was
applied to high-performance liquid chromatography (HPLC) system
(Hewlett Packard 1050, Agilent Technologies, Palo Alto, CA) for
further purification. The purification was done using a reverse
phase column (Alltima C18, 250 _ 10 mm, particles 5 m, Alltech
Associates, Inc., Deerfield, IL) and the mobile phase consisted of (A)
acetonitrile with 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) and (B) HPLC-grade
water containing 0.1% TFA. For each run, 100 ml of crude extract was
loaded to the column and separated by a linear gradient of 0e100%
acetonitrile over 30 min at the flow rate of 1.5 ml/min. UV-detector
was set at 220 nm to monitor eluted compounds. Fractions from
multiple runs were combined, lyophilized and dissolved in Tris-Cl
buffer (0.02 mol/l, pH 7.0) for antimicrobial activity assay. The
fractions exhibiting antimicrobial activity were stored at 4 _C until
further analyses.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.5 relatedness ทางพันธุกรรม โดยลำดับเบส 16S rDNAGenomic DNA ของแยกใหม่ถูกสกัดโดยใช้การพาณิชย์ชุด (DNeasy เลือด และเนื้อเยื่อ QIAGEN, Valencia, CA) มาตรฐานสากลไพรเมอร์สำหรับแบคทีเรีย 16S rDNA เฉพาะใช้ในการปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส PCR (Weisburg บ่ม Pelletier และ เลน1991) PCR รวมบ่มที่ _C 94 สำหรับ 3 นาที ตามด้วยรอบ 30, 1 นาทีที่ 94 _C, 1 นาทีที่ 52 _C และ 2 นาทีที่ทั้ง72 _C ทำการขยายสุดท้ายที่ _C 72 สำหรับ 10 นาที 16S rDNA ที่บริสุทธิ์ที่ใช้สกัดดีเอ็นเอการค้า Theamplifiedชุด (QIA เจด่วนแยกชุด QIAGEN) ดีเอ็นเอเอาต์มีการเรียงลำดับตามการวิเคราะห์ดีเอ็นเออัตโนมัติ (Biosystems ใช้ฟอสเตอร์ซิตี้ CA) ที่สินเชื่อพืช Microbe Genomicsมหาวิทยาลัยแห่งรัฐโอไฮโอ ลำดับดีเอ็นเอได้รับได้เปรียบเทียบกับแบคทีเรียที่รู้จักกันในศูนย์เทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติฐานข้อมูล (NCBI Genebank) ใช้เฉพาะพื้นฐานตำแหน่งเครื่องมือค้นหา (ระเบิด) อัลกอริทึม2.6 การแยกและทำให้บริสุทธิ์ของจุลินทรีย์ต้องใช้ OSY 7LA ถูก inoculated ในซุปถั่วเหลือง tryptic 500 ml ในการสองลิตร baffled หนาวพร้อมปลั๊กแบบฝ้าย และ incubated ในแบบโรตารี่เชคเกอร์ (วิทยาศาสตร์รัฐนิวบรันสวิก เอดิสัน NJ) ที่ 30 _C สำหรับ h 36 ด้วยอาการกังวลต่อที่ 200 รอบต่อนาที เซลล์ถูกลบ โดย centrifugation ที่g 7700 _สำหรับ 15 นาที Supernatant ถูกผสมกับ nbutanol 125 mlและนั้นกระตุ้นทำหนึ่งชั่วโมง (หวง et al., 2009 แมคคอร์มิคและ al., 1998) ในเวลาต่อมา เฟสตัวทำละลายอินทรีย์รวบรวมและ solventwas เอาที่ _C 40 ภายใต้สุญญากาศ ใช้แบบโรตารีevaporator ผงสร้างขึ้นถูกละลายใน 5 มล.ตรี-Clบัฟเฟอร์ (0.02 โมล/l ค่า pH 7.0) ตาม ด้วย centrifugation และกรอง(0.22 มม. มาก) ผลแก่สารกรอง (สกัดน้ำมัน) ได้ใช้กับระบบที่มีประสิทธิภาพสูงของเหลว chromatography (HPLC)(Hewlett Packard 1050, Agilent เทคโนโลยี ดัลลัส CA) สำหรับต่อไปทำให้บริสุทธิ์ กระทำการฟอกที่ใช้สร้างการกลับรายการคอลัมน์ระยะ (Alltima C18, _ 250 10 mm, 5 เมตร Alltech อนุภาคเชื่อมโยง Inc. บางนาตราด IL) และประกอบด้วยเฟสเคลื่อนที่ (A)acetonitrile 0.1% กรด trifluoroacetic (TFA) และ (B) HPLC เกรดประกอบด้วย 0.1% น้ำ TFA สำหรับการรันแต่ละ 100 ml ของสารสกัดหยาบโหลดในคอลัมน์ และแยก โดยไล่เส้น 0e100%acetonitrile ที่อัตราการไหลของ 1.5 ml/นาที เครื่องตรวจจับ UV กว่า 30 นาทีที่ตั้ง 220 nm เพื่อตรวจสอบสาร eluted เศษจากทำหลายรวม lyophilized และละลายในทริสเรทติ้ง Clบัฟเฟอร์ (0.02 โมล/l ค่า pH 7.0) สำหรับการทดสอบกิจกรรมจุลินทรีย์ ที่เศษส่วนอย่างมีระดับกิจกรรมจุลินทรีย์ถูกเก็บไว้ที่ 4 _C จนวิเคราะห์เพิ่มเติม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.5 ความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมโดยลำดับ 16S rDNA
ดีเอ็นเอจีโนมของเชื้อใหม่ถูกสกัดโดยใช้ในเชิงพาณิชย์ชุด (DNeasy เลือดและเนื้อเยื่อ QIAGEN, วาเลนเซีย, CA)
ยูนิเวอร์แซไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับแบคทีเรีย 16S rDNA ถูกนำมาใช้ในวิธีpolymerase chain reaction, PCR (Weisburg, Barns, Pelletier & Lane, 1991) PCR รวมบ่มที่ 94 _C เป็นเวลา 3 นาทีตามด้วย30 รอบแต่ละ ได้แก่ 1 นาทีที่ 94 _C 1 นาทีที่ 52 _C และ 2min ที่72 _C ขยายสุดท้ายที่ถูกดำเนินการใน 72 _C เป็นเวลา 10 นาที Theamplified 16S rDNA บริสุทธิ์โดยใช้ดีเอ็นเอพาณิชย์สกัดชุด(ชุด QIA สกัดเจลอย่างรวดเร็ว QIAGEN) ดีเอ็นเอขยายได้รับการจัดลำดับโดยวิเคราะห์ดีเอ็นเออัตโนมัติ (Applied Biosystems, ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย) สิ่งอำนวยความสะดวกที่พืชจุลินทรีย์ฟังก์ชั่นที่มหาวิทยาลัยแห่งรัฐโอไฮโอ ลำดับดีเอ็นเอที่ได้มาถูกเมื่อเทียบกับเชื้อแบคทีเรียที่รู้จักกันดีในศูนย์แห่งชาติสำหรับเทคโนโลยีชีวภาพฐานข้อมูลสารสนเทศ(NCBI Genebank) โดยใช้ท้องถิ่นพื้นฐานการจัดเครื่องมือค้นหา(ระเบิด) อัลกอริทึม. 2.6 การแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของยาต้านจุลชีพสายพันธุ์Osý-7LA ได้รับเชื้อใน 500 มล tryptic น้ำซุปถั่วเหลืองในขวดสองลิตรงงงันกับปลั๊กผ้าฝ้ายและบ่มในหมุนปั่น(New Brunswick วิทยาศาสตร์, เอดิสัน, นิวเจอร์ซีย์) วันที่ 30 _C 36 ชั่วโมงด้วยการกวน 200 รอบต่อนาทีที่ เซลล์ที่ถูกลบออกโดยการหมุนเหวี่ยงที่7700 _ กรัมเป็นเวลา 15 นาที สารละลายที่ได้รับการผสมกับ 125 มล. nbutanol และตื่นเต้นเป็นเวลาหนึ่งชั่วโมง (Huang et al, 2009;. แมค., et al, 1998) ต่อจากนั้นขั้นตอนการทำละลายอินทรีย์ที่ถูกเก็บรวบรวมและ solventwas ออก _C ที่ 40 ภายใต้สูญญากาศใช้หมุนระเหย ผงที่สร้างถูกละลายใน 5 มล. Tris-Cl บัฟเฟอร์ (0.02 โมล / ลิตรค่า pH 7.0) ตามด้วยการหมุนเหวี่ยงและการกรอง(0.22 มมค) กรองผลลัพธ์ (สารสกัดจากน้ำมันดิบ) ถูกนำไปใช้กับที่มีประสิทธิภาพสูงของเหลวchromatography (HPLC) ระบบ(Hewlett Packard 1050, Agilent Technologies, พาโลอัลโต) สำหรับการทำให้บริสุทธิ์ต่อไป การทำให้บริสุทธิ์ที่ได้รับการทำโดยใช้แบบย้อนกลับคอลัมน์เฟส (Alltima C18 250 _ 10 มมอนุภาค 5 เมตร, ออลเทค Associates, Inc, เดียร์ฟิลด์, อิลลินอยส์) และเฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วย (A) acetonitrile กับ 0.1% กรด TRIFLUOROACETIC (TFA) และ (ข) HPLC ระดับน้ำที่มี0.1% TFA สำหรับแต่ละวิ่ง 100 มล. ของสารสกัดหยาบที่ถูกโหลดไปยังคอลัมน์และคั่นด้วยการไล่ระดับสีเชิงเส้นของ0e100% acetonitrile กว่า 30 นาทีที่อัตราการไหล 1.5 มล. / นาที เครื่องตรวจจับรังสียูวีตั้งอยู่ที่ 220 นาโนเมตรในการตรวจสอบสารชะ เศษส่วนจากหลายทำงานร่วมกัน, แห้งและละลายใน Tris-Cl บัฟเฟอร์ (0.02 โมล / ลิตรค่า pH 7.0) สำหรับการทดสอบฤทธิ์ต้านจุลชีพ เศษส่วนแสดงฤทธิ์ต้านจุลชีพที่ถูกเก็บไว้ที่ 4 _C จนการวิเคราะห์ต่อไป

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.5 สัมพันธ์ทางพันธุกรรมโดยลำดับ 16S rDNA
ดีเอ็นเอใหม่แยกสกัดโดยใช้พาณิชย์
Kit ( dneasy เลือด&เนื้อเยื่อ , เพิ่ม , Valencia , CA ) สากล
ส่วนของดีเอ็นเอแบคทีเรีย 16S rDNA ถูกใช้ในปฏิกิริยา PCR ( Polymerase Chain
, weisburg โรงนาเพลเลอเทียร์& Lane ,
, 1991 ) ร่วมรวมการบ่มที่ 94 _c นาน 3 นาที แล้วตามด้วย
30 รอบแต่ละคนรวมทั้ง 1 นาทีที่ 94 _c 1 นาทีที่ 52 _c และ 2min ที่
72 _c นามสกุลสุดท้ายแสดงที่ 72 _c 10 นาที theamplified 16S rDNA พบแถบดีเอ็นเอเชิงพาณิชย์โดยใช้การสกัด
Kit ( มั่นด่วนเจลสกัดชุดเพิ่ม ) มีแถบดีเอ็นเอนี้โดยอัตโนมัติ
เป็นดีเอ็นเอวิเคราะห์ ( Applied Biosystems
, Foster City , CA ) จุลินทรีย์พืชในสถานที่
รัฐโอไฮโอมหาวิทยาลัยนำดีเอ็นเอลำดับคือ
เมื่อเทียบกับรู้จักแบคทีเรียในศูนย์ฐานข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพ
แห่งชาติ ( ncbi genebank ) โดยใช้พื้นฐานท้องถิ่น
ตำแหน่งเครื่องมือค้นหา ( ระเบิด ) ขั้นตอนวิธี

2.6 การแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของยาต้านจุลชีพ
osy-7la เมื่อยเป็นเชื้อในอาหารถั่วเหลือง 500 มิลลิลิตร น้ำในขวด 2 ลิตร
งงงันกับฝ้าย ปลั๊ก และบ่มในโรตารี
เครื่องปั่น ( บรุนซ์ใหม่ทางวิทยาศาสตร์ , เอดิสัน , นิวเจอร์ซีย์ ) ที่ 30 _c สำหรับ 36 ชั่วโมง
การกวน 200 รอบต่อนาที เซลล์ถูกเอาออกโดยการเหวี่ยงแยกที่
หน้า _ กรัมเป็นเวลา 15 นาที โดยนำ มาผสมกับ 125 ml nbutanol
และสั่นเครือ เป็นเวลาหนึ่งชั่วโมง ( Huang et al . , 2009 ; McCormick
et al . , 1998 ) ต่อมา เฟสตัวทำละลายอินทรีย์รวบรวม
และตัวทำละลายออกที่ 40 _c ภายใต้สุญญากาศ ใช้หมุน
ระเหย สร้างผงละลายใน 5 มล. ต่อ C1
บัฟเฟอร์ ( 0.02 mol / L , pH 7.0 ) ตามด้วยปั่นและกรอง
( 0.22 มม. มิลลิ ) กรองผลลัพธ์ ( สารสกัด ) คือ
ใช้วิธีโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง ( HPLC ) ระบบ
( Hewlett Packard 1050 Agilent Technologies , พาโลอัลโต , แคลิฟอร์เนีย )
บริสุทธิ์เพิ่มเติม การทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ Reverse