Cultivation of hairy roots After ha

Cultivation of hairy roots
After hairy roots initiated from the edges of the explants and grew to nearly 2 to 5 cm long, they were excised and subcultured into solid MS basal medium for two months. Then they were transferred to shake flasks in 20 ml liquid medium for 28 days unless described otherwise. Each flask was inoculated with 3 to 5 cm long root.

Determination of root biomass
The roots were separated from the media by using a stainless steel sieve. Their fresh weights were determined after they were washed with distilled water and the excess surface water blotted away. Dry weights were recorded after the roots were dried at 60°C till constant weight is recorded.

Extraction of withaferin-A
Two hundred millgram (200 mg) dry weight (DW) of root tissue was taken for analysis. The tissues were ground and extracted overnight in methanol (5 times w/v) on a rotary shaker at 26°C and 100 rpm. The procedure was repeated three times and the methanolic extracts were pooled together. The extracts were filtered through Whatman No.1 filter paper and diluted with deionised water (1 methanol: 4 water). The resultant solution was extracted with 3 volumes of chloroform. Chloroform layer was separated from other layers through a separating funnel. The chloroform extract was dried and the residue was dissolved in 1 ml methanol, filtered through a 40 μM nylon filter and 20 μl was used for HPLC analysis. The standard of withaferin-A dissolved in methanol at strength of 0.5 mg/l and 20 μl was used for HPLC analysis (modified from Roja et al., 1991).

Polymerase chain reaction (PCR)
Genomic DNA was extracted using CTAB method (Doyle and Doyle, 1987) from each of the hairy root lines as well as from control non-transformed roots. PCR primers specific for the amplification of the 557 bp fragment of the rolC gene were used. A 50 μl PCR mix contained 200 ng of DNA, 10 pmoles primers, 200 μM dNTP mix, 1U of Taq DNA polymerase, 1X PCR buffer and 2 mM MgCl2. PCR conditions were 94°C for 5 min, 42 cycles of 94°C for 1 min, 52.5°C for 1.5 min and 72°C for 2 min, and a final extension at 72°C for 10 min. The sequences of the primers used in the PCR are as follows:
Forward primer 5’ATGGATCCCAAATTGCTATTCCCCC ACGA3’
and Reverse primer 5’TTAGGCTTCTTTCATTCGGTTTACTG CAGC 3’

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เพาะปลูกของรากขน หลังจากที่รากขนเริ่มต้นจากขอบของเฌล และเติบโตจนยาวเกือบ 2 ถึง 5 ซม. พวกเขาสรรพสามิต และ subcultured เป็นไม้ MS ฐานกลางสองเดือน แล้ว จะถูกโอนย้ายไปเขย่าขวดกลาง 20 ml สำหรับ 28 วันเว้นแต่จะอธิบายเป็นอย่างอื่น แต่ละขวดถูก inoculated มีรากยาว 3-5 ซม. ความมุ่งมั่นของชีวมวลราก รากถูกแยกออกจากสื่อ โดยใช้ตะแกรงสแตนเลส น้ำหนักสดดำเนินการหลังจากที่พวกเขาถูกล้าง ด้วยน้ำกลั่น และ blotted ผิวน้ำส่วนเกินออกไป มีบันทึกน้ำหนักแห้งหลังจากรากถูกอบแห้งที่ 60 องศาเซลเซียสจนน้ำหนักคงจะถูกบันทึกไว้ สกัด withaferin A สองร้อย millgram (200 mg) น้ำหนักแห้ง (DW) ของเนื้อเยื่อรากถูกนำมาวิเคราะห์ เนื้อเยื่อถูกพื้น และขยายค้างคืนในเมทานอล (5 ครั้ง w/v) ในการปั่นโรตารี่ 26° C และ 100 รอบต่อนาที ขั้นตอนซ้ำสามครั้ง และสารสกัด methanolic ถูกพูกัน สารสกัดถูกกรองผ่านกระดาษกรอง Whatman No.1 และเจือจาง ด้วยน้ำ deionised (เมทานอล 1: น้ำ 4) การแก้ไขปัญหาผลลัพธ์ถูกสกัด ด้วยคลอโรฟอร์มในปริมาณ 3 ชั้นคลอโรฟอร์มถูกแยกออกจากชั้นอื่น ๆ ผ่านช่องทางแยก คือแห้งสารสกัดคลอโรฟอร์ม และสารตกค้างละลายในเมทานอล 1 มิลลิลิตร กรองผ่านตัวกรองไนล่อนไมครอน 40 และ 20 μl ใช้สำหรับวิเคราะห์ HPLC มาตรฐานของ withaferin A ละลายในเมทานอลที่ความแรง 0.5 mg/l และ 20 μl ใช้สำหรับวิเคราะห์ HPLC (แก้ไขจาก Roja et al. 1991) Polymerase chain reaction (PCR) Genomic DNA was extracted using CTAB method (Doyle and Doyle, 1987) from each of the hairy root lines as well as from control non-transformed roots. PCR primers specific for the amplification of the 557 bp fragment of the rolC gene were used. A 50 μl PCR mix contained 200 ng of DNA, 10 pmoles primers, 200 μM dNTP mix, 1U of Taq DNA polymerase, 1X PCR buffer and 2 mM MgCl2. PCR conditions were 94°C for 5 min, 42 cycles of 94°C for 1 min, 52.5°C for 1.5 min and 72°C for 2 min, and a final extension at 72°C for 10 min. The sequences of the primers used in the PCR are as follows: Forward primer 5’ATGGATCCCAAATTGCTATTCCCCC ACGA3’ and Reverse primer 5’TTAGGCTTCTTTCATTCGGTTTACTG CAGC 3’

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การเพาะปลูกของรากขน
หลังจากที่รากขนที่เริ่มจากขอบของชิ้นส่วนและเพิ่มขึ้นถึงเกือบยาว 2-5 ซม. พวกเขาถูกตัดและเลี้ยงลงใน MS ของแข็งกลางฐานเป็นเวลาสองเดือน แล้วพวกเขาก็ถูกย้ายไปเขย่าขวด 20 มล. อาหารเหลวสำหรับ 28 วันยกเว้นกรณีที่อธิบายไว้เป็นอย่างอื่น แต่ละขวดได้รับเชื้อด้วย 3-5 ซม. ยาวราก.

การกำหนดรากชีวมวล
รากถูกแยกออกจากสื่อโดยใช้ตะแกรงสแตนเลส น้ำหนักสดของพวกเขาได้รับการพิจารณาหลังจากที่พวกเขาถูกล้างด้วยน้ำกลั่นและน้ำผิวดินเกินเปื้อนออกไป น้ำหนักแห้งที่ถูกบันทึกไว้หลังจากรากแห้งที่ 60 ° C จนถึงน้ำหนักคงที่จะถูกบันทึกไว้.

สกัด withaferin-A
สองร้อย millgram (200 มก.) น้ำหนักแห้ง (DW) ของเนื้อเยื่อรากถูกนำสำหรับการวิเคราะห์ เนื้อเยื่อมาบดและสกัดค้างคืนในเมทานอล (5 ครั้ง w / v) บนเครื่องปั่นแบบหมุนที่ 26 ° C และ 100 รอบต่อนาที ขั้นตอนซ้ำสามครั้งและสารสกัดจากเมทานอลถูกรวบรวมเข้าด้วยกัน สารสกัดถูกกรองผ่านกระดาษกรอง Whatman ครั้งที่ 1 และเจือจางด้วยน้ำ deionised (1 เมทานอล: 4 น้ำ) วิธีการแก้ปัญหาผลถูกสกัดด้วย 3 เล่มของคลอโรฟอร์ม ชั้นคลอโรฟอร์มถูกแยกออกจากชั้นอื่น ๆ ผ่านช่องทางแยก สารสกัดคลอโรฟอร์มแห้งและสารตกค้างถูกละลายในเมทานอล 1 มิลลิลิตรกรองผ่านตัวกรองไนลอน 40 ไมครอนและ 20 ไมโครลิตรถูกนำมาใช้สำหรับการวิเคราะห์ HPLC มาตรฐานของ withaferin-A ละลายในเมทานอลที่ความแข็งแรงของ 0.5 มิลลิกรัม / ลิตรและ 20 ไมโครลิตรถูกนำมาใช้สำหรับการวิเคราะห์ HPLC (ดัดแปลงมาจาก Roja et al., 1991).

วิธี Polymerase chain reaction (PCR)
DNA ของยีนถูกสกัดโดยใช้วิธี CTAB (ดอยล์ และดอยล์, 1987) จากแต่ละสายรากขนรวมทั้งจากการควบคุมที่ไม่ได้เปลี่ยนราก ไพรเมอร์ PCR ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับการขยายของส่วน 557 bp ของยีน rolC ถูกนำมาใช้ 50 ไมโครลิตรผสม PCR ที่มีอยู่ 200 NG ดีเอ็นเอ 10 pmoles ไพรเมอร์ผสม 200 dNTP ไมโครเมตร 1U ของ Taq DNA Polymerase, 1X PCR buffer และ 2 mm MgCl2 เงื่อนไข PCR เป็น 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที 42 รอบจาก 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที 52.5 ° C เป็นเวลา 1.5 นาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีและส่วนขยายสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที ลำดับของไพรเมอร์ที่ใช้ใน PCR มีดังนี้
Forward ไพรเมอร์ 5'ATGGATCCCAAATTGCTATTCCCCC ACGA3 '
และย้อนกลับไพรเมอร์ 5'TTAGGCTTCTTTCATTCGGTTTACTG CAGC 3'