Fig. 2.Surface properties of the pu

Fig. 2.
Surface properties of the putative membrane-binding face of the BDV-M tetramer. (A) The electrostatic surface potential reveals this face to be highly basic (areas colored in white, red, and blue denote neutral, negative, and positive potential contoured at 0, − 3, and +3 kT/e, respectively). View is rotated 180° around the horizontal axis relative to Fig. 1C. (B) Side view of the tetramer, obtained by rotating (A) by 90° about a horizontal axis, depicting BDV-M approaching a phospholipid membrane (Lower). The alternating surface charges (acidic/basic) of the tetramer edges would facilitate lateral assembly to form planar arrays.
In the crystal lattice, each tetramer is positioned face-to-face with a second tetramer via the putative membrane binding surface to form a weakly-associated crystallographic octamer. A positively-charged patch around Arg-98 of 1 tetramer juxtaposes the negatively-charged patch near the C terminus of the opposing tetramer. Because of the disk-like shape of the BDV-M tetramer, distances between the tetramers range from 3.95 Å (Pro 142 O–Arg 98 NE), through 6–8 Å at the edges, up to 20–25 Å between their centers, resulting in large solvent channels with dimensions 35 × 35 × 35 Å. Interactions between the 2 tetramers are mediated by solvent molecules, including SO42− ions. This finding is consistent with experimental results showing that higher oligomeric states of the M-protein appear after long incubation at high salt concentration and ultracentrifugation studies confirming that an equilibrium exists between tetramers and octamers of BDV-M (16). Because the membrane binding face is not accessible within the crystallographic octamer, it is unlikely that it is able to bind to lipid bilayers.
Electron Density Reveals Nucleotide Binding to BDV-M.

During the structure determination, additional electron density was found near to the C terminus of helix α4, close to the 4-fold axis of the BDV-M tetramer. The density could be interpreted as a pyrimidine mononucleotide, which we have assigned as cytidine-5′-monophosphate (Fig. 3). The base is sandwiched in a pocket between the side chains of Phe-37 (from loop β1–β2) and His-112 (of helix α4) at a distance of 3.4 Å to each (Fig. 3A); such a parallel ring stacking between bases and aromatic residues is typical for protein–nucleic acid interactions (28). A series of hydrogen bonds to the base are observed: between the main-chain atoms of Phe-37 and the base ring of the nucleotide, from the side chain of Gln-36, from the side chain of Asn-115# of a symmetry-related molecule and a water-mediated hydrogen bond to Asn-39 N, and the side chain of Asn 115# (Fig. 3A). In addition, the O2′ atom of a riboxynucleotide sugar moiety would hydrogen-bond to the side chain of Gln-36. The network of interactions observed for the cytosine base would be similar for uracil, with an extra hydrogen bond for the uracil N3 hydrogen. Binding of thymine is also conceivable, although the methyl group would make close contacts to the side chain of Asn-115#. In contrast to these pyrimidine bases, neither the size of the pocket nor the hydrogen-bonding pattern is suited to the binding of the bulky purine bases adenine and guanine. Surprisingly, RNA binding occurs on a face of the monomer opposite to that corresponding to the trinucleotide binding site in VP40 octamers (18) (Fig. S1 and Fig. S3).
Fig. 3.
The nucleotide binding site in BDV-M. (A) Experimental electron density (omit map contoured at 3 σ) with refined monoribonucleotide cytidine-5′-monophosphate at the interface between 2 monomers (view and colors as in Fig. 1C). The pyrimidine ring is sandwiched between the side chains of Phe 37-and His-112 and is held in position through hydrogen bonds to the main chain of Phe-37 and the carboxamide group of the neighboring Asn-115 (distances in Å). In addition, the O2′ atom of a riboxynucleotide sugar moiety would hydrogen-bond to the side chain of Gln 36. (B) Electrostatic potential surface of BDV-M (contour levels as in Fig. 2) with refined RNA trinucleotide (CCC). Note the alternative positions of the phosphate groups in the crystallographically 4-fold averaged structure.
Binding of Oligonucleotides to BDV-M.

In previous work, UV spectra of BDV-M oligomeric fractions showed 2 maxima with a ratio OD280 to OD260 of ≈1.1 (16), suggesting the presence of nucleic acid. Although the density described above is clear, showing that a pyrimidine base is bound to the heterologously produced BDV-M near the tetramer axis, the limited resolution and high overall B value of the data does not allow differentiation between RNA and DNA. Furthermore, the 4-fold averaging imposed by the crystallographic symmetry precludes identification of longer oligonucleotides that do not follow this symmetry. The electrostatic distribution at the protein surface suggests, however, that BDV-M could also bind larger nucleic acid fragments (Fig. 4).
Fig. 4.
Heterologously-expressed BDV-M binds ssRNA oligonucleotides. (A) Urea-PAGE of isolated nucleic acid from purified BDV-M tetramer. Left lane, defined 14-nt polyadenine marker; lane 1, isolated RNA labeled at the 5′ terminus using PNK; lane 2, as lane 1 after RNase T1 digestion; lane 3, isolated RNA labeled at the 3′-terminus using PAP; lane 4, as lane 3 after RNase T1 digestion; lane 5, polyadenine marker. These results prove the copurification of heterologously expressed BDV-M tetramer with RNA oligonucleotides of ≈16 nt. (B) Schematic depiction of possible binding mode of ssRNA. A distinctive basic patch along the tetramer diagonals could accommodate the polyphosphate backbone (yellow arrows), such that an incoming chain (3′-end bottom left) ends with the observed bound nucleotide (center). Assuming a specificity for cytidine/uridine, there are 3 possible exit routes for the 5′-end: (i) at the top left, with 1 pyrimidine base bound near the tetramer axis; (ii) at the top right, with 2 nt; and (iii) at the bottom right, with 3 central bases contributing to specificity. It is not possible to distinguish between them because of the 4-fold crystallographic symmetry.
Freshly-prepared BDV-M was analyzed to investigate both the type and length of oligonucleotides bound to the protein. Nucleic acids isolated from BDV-M were alternatively radioactively-labeled at the 5′ and 3′ ends and analyzed by using urea-PAGE (Fig. 4A). 5′ Labeling using T4 polynucleotide kinase (PNK), which can label both DNA and RNA nucleotides, shows a strong band corresponding to a 16-nt fragment. Digestion with RNase T1 followed by urea-PAGE separation reveals degradation of the nucleic acid fragments, providing evidence that the nucleic acid in question is indeed RNA. 3′ Labeling using polyadenylate polymerase (PAP), specific for ssRNA nucleotides, reveals 13- and 16-nt fragments. RNase treatment of the sample also results in degradation of the nucleic acid fraction, although the ensuing fragments are larger than for the digested 5′-labeled PNK sample. Pretreatment of the BDV-M protein fraction with either RNase A or the dual specific endonuclease Benzonase before nucleic acid isolation gave equivalent results, showing that the RNA oligonucleotide is protected by the M-protein. Conversely, attempts to remove the nucleic acid via denaturation of BDV-M and subsequent in vitro folding were unsuccessful until now, raising the possibility that RNA binding plays a structural role in the integrity of the tetramer. Treatment of both the 3′- and 5′-labeled isolated nucleic acid samples with RNase A yielded almost complete digestion to mononucleotides. Thus, both labeling strategies provide evidence that BDV-M expressed heterologously in Escherichia colibinds and protects ssRNA oligonucleotides with a length of ≈16 bases or more.
Combining the crystallographic and in vitro data, it is likely that the BDV-M tetramer binds RNA oligonucleotides containing 1, 2, or 3 consecutive pyrimidine bases; 4 bases cannot be bound simultaneously because of steric restraints (Fig. 4B). For a better understanding and more realistic view of RNA bound to the BDV-M tetramer, we modeled and refined a cytidine trinucleotide by linking 3 symmetry-related CMP molecules (Fig. 3B) in 2 possible orientations: 3′–5′ and 5′–3′. Only 1 orientation of the trinucleotide could be refined to fit the electron density map with reasonable geometry and protein contacts without increasing the crystallographic R factors. Conformational parameters for the refined mononucleotide and trinucleotide are presented in Table S1. Refinement as a trinucleotide alters the nucleotide conformation compared with the mononucleotide model slightly: although the pyrimidine bases barely change their positions, locations of the phosphate groups and sugar moieties change as a consequence of the covalent linkage of the mononucleotides. The largest shifts are observed for the 5′ nucleotide, whose pyrimidine ring is shifted ≈0.5 Å and free phosphate group moved 2.2 Å compared with the mononucleotide refinement. Similar results are obtained upon refinement of a dinucleotide.
The refined triribonucleotide model fits well to the (4-fold crystallographically averaged) electron density and allows tentative interpretation of weak residual electron density close to each terminal phosphate group as belonging to preceding and following nucleotides. Inspection of the BDV-M electrostatic potential indicates a possible course for longer polynucleotide chains along the surface of the tetramer (Fig. 4B), corroborated by the locations of bound sulfate ions in the crystal. For minimal strain in the ssRNA near the tetramer axis, a single BDV-M tetramer should bind an oligoribonucleotide segment containing 2 consecutive pyrimidine bases, although other binding modes (1 nucleotide or 3 consecutive bases) are also feasible (Fig. 4B). It is possible that further RNA specificity pockets are present on the surface, but are undetec

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Fig. 2คุณสมบัติพื้นผิวของใบหน้าของเมมเบรนรวม putative ของ tetramer BDV-M (A ผิวงาน)อาจเปิดเผยใบหน้านี้เป็นคำพื้นฐาน (พื้นที่ระบายสีขาว สีแดง และสีน้ำเงินแสดงศักยภาพกลาง ลบ และบวก contoured ที่ 0 − 3 และ kT/e + 3 ตามลำดับ) ดูเป็นหมุน 180 องศารอบแกนแนวนอนสัมพันธ์ Fig. 1C. (B) มุมมองด้านข้างของ tetramer ได้รับ โดยการหมุน (A) 90 องศาเกี่ยวกับแกนแนวนอน แสดง BDV-M ใกล้เยื่อฟอสโฟลิพิด (ต่ำกว่า) สลับผิวค่า (กรด/พื้นฐาน) ขอบ tetramer จะช่วยประกอบด้านข้างแบบอาร์เรย์ระนาบในโครงตาข่ายประกอบคริสตัล tetramer ละอยู่แบบพบปะกับ tetramer สองผ่านผิวผูก putative เยื่อเพื่อ octamer crystallographic สูญที่เกี่ยวข้อง แพทช์คิดบวกรอบอาร์กิวเมนต์ของค่า-98 ของ 1 tetramer juxtaposes แพทช์คิดในเชิงลบใกล้นัส C ของ tetramer ฝ่ายตรงข้าม เพราะรูปร่างเหมือนดิสก์ของ tetramer BDV-M ความยาวมากกว่าระหว่างตั้งแต่ 3.95 Å (Pro 142 O – อาร์กิวเมนต์ของค่า 98 NE), ผ่านÅ 6 – 8 ที่ขอบ tetramers ขึ้นไป 20 – 25 Åระหว่างศูนย์ของพวกเขา ในช่องใหญ่เป็นตัวทำละลายที่มีขนาด 35 × 35 × 35 Åการโต้ตอบระหว่าง 2 tetramers มี mediated โดยโมเลกุลตัวทำละลาย การรวมกัน SO42− ค้นหานี้จะสอดคล้องกับผลการทดลองแสดงว่า อเมริกา oligomeric สูงโปรตีน M ปรากฏหลังจากบ่มนานที่สูงเกลือความเข้มข้นและ ultracentrifugation การศึกษายืนยันว่า สมดุลที่มีอยู่ระหว่าง tetramers และ octamers ของ BDV-M (16) เนื่องจากหน้ารวมเยื่อไม่สามารถเข้าถึงภายใน crystallographic octamer ก็ไม่น่าที่จะสามารถผูกเข้ากับไขมัน bilayersความหนาแน่นอิเล็กตรอนพบว่า นิวคลีโอไทด์ผูกกับ BDV-M ในระหว่างการกำหนดโครงสร้าง ความหนาแน่นอิเล็กตรอนเพิ่มเติมพบใกล้นัส C ของ α4 เกลียว ใกล้กับแกน 4-fold ของ tetramer BDV-M ความหนาแน่นสามารถตีความเป็น mononucleotide pyrimidine ซึ่งเราได้กำหนดเป็น cytidine-5′-monophosphate (Fig. 3) ฐานเป็นชาวลาวอกระเป๋าระหว่างโซ่ข้างของเพ-37 (จากวง β1 – β2) และพระ-112 (ของเกลียว α4) ในระยะทาง 3.4 Åการละ (Fig. 3A); ดังกล่าวพร้อมแหวนซ้อนระหว่างฐานและหอมตกเป็นปกติสำหรับโต้ตอบกรด nucleic – โปรตีน (28) พบชุดของพันธบัตรไฮโดรเจนฐาน: ระหว่างอะตอมโซ่หลักของเพ-37 และแหวนฐานของนิวคลีโอไทด์ จากโซ่ข้างของ Gln-36 จากโซ่ข้างของ Asn 115 #ของโมเลกุลที่เกี่ยวข้องสมมาตรและพันธะไฮโดรเจนน้ำ mediated Asn 39 N และด้านห่วงโซ่ของ Asn 115# (Fig. 3A) นอกจากนี้ อะตอม O2′ ของการ riboxynucleotide น้ำตาล moiety จะพันธะไฮโดรเจนกับห่วงโซ่ข้างของ Gln-36 เครือข่ายของการโต้ตอบที่สังเกตเสา cytosine จะคล้ายสำหรับ uracil กับพันธะไฮโดรเจนการเสริมสำหรับ uracil ไฮโดรเจน N3 ผูกไทมีนก็หลากหลาย ถึงแม้ว่ากลุ่ม methyl จะทำปิดการติดต่อกับห่วงโซ่ข้างของ Asn 115 ตรงข้ามฐานเหล่านี้ pyrimidine ขนาดของกระเป๋าหรือไฮโดรเจนยึดรูปแบบไม่เหมาะการผูกของ purine ขนาดใหญ่ฐาน adenine กับ guanine จู่ ๆ ผูกอาร์เอ็นเอเกิดขึ้นบนใบหน้าของน้ำยาตรงข้ามกับที่สอดคล้องกับไซต์ผูก trinucleotide ใน VP40 octamers (18) (ฟิก S1 และฟิก S3)Fig. 3เว็บไซต์รวมนิวคลีโอไทด์ใน BDV-M (A) ความหนาแน่นอิเล็กตรอนทดลอง (ไม่รวมแผนที่ contoured ที่ 3 σ) กับ monoribonucleotide กลั่น cytidine-5′-monophosphate ที่อินเทอร์เฟซระหว่าง monomers 2 (ดูและสีใน Fig. 1C) แหวน pyrimidine ชาวลาวอระหว่างโซ่ข้างของเพ 37 - และพระ-112 และจะจัดขึ้นในตำแหน่งผ่านพันธบัตรไฮโดรเจนกับโซ่หลักของเพ-37 และกลุ่มใกล้เคียง Asn-115 (ระยะทางในÅ) carboxamide นอกจากนี้ อะตอม O2′ ของการ riboxynucleotide น้ำตาล moiety จะพันธะไฮโดรเจนกับห่วงโซ่ข้างของ Gln 36 (ข) งานเป็นพื้นผิว BDV-เมตร (จากระดับใน Fig. 2) กับอาร์เอ็นเอบริสุทธิ์ trinucleotide (ซีซีซี) หมายเหตุตำแหน่งอื่นของกลุ่มฟอสเฟตในโครงสร้าง crystallographically 4-fold เฉลี่ยรวม Oligonucleotides BDV-เมตร ในการทำงานก่อนหน้านี้ แรมสเป็คตรา UV ของเศษ oligomeric BDV-M พบอโบ 2 มีอัตราส่วน OD280 OD260 ≈1.1 (16), แนะนำของกรดนิวคลีอิก แม้ว่าความหนาแน่นข้างชัดเจน แสดงว่า pyrimidine เป็นฐานถูกผูกไว้กับ BDV-M heterologously ผลิตใกล้แกน tetramer จำกัดความละเอียด และค่า B สูงโดยรวมของข้อมูลไม่สามารถสร้างความแตกต่างระหว่างดีเอ็นเอและอาร์เอ็นเอ นอกจากนี้ การ 4-fold หาค่าเฉลี่ยกำหนด โดยสมมาตร crystallographic ไม่สามารถระบุของ oligonucleotides ต่อไปนี้สมมาตร การกระจายไฟฟ้าสถิตที่ผิวโปรตีนแนะนำ อย่างไรก็ตาม ว่า BDV-M สามารถผูกเอ็นใหญ่กระจายตัว (Fig. 4)Fig. 4แสดง heterologously BDV-M binds ssRNA oligonucleotides (A) urea-หน้าของกรดนิวคลีอิกแยกจาก tetramer BDV-M บริสุทธิ์ เลนซ้าย เครื่องหมายกำหนด 14-nt polyadenine เลน 1 อาร์เอ็นเอที่แยกชื่อที่นัส 5′ ใช้ PNK 2 เลนเป็นเลน 1 หลังจากย่อยอาหาร RNase T1 เลน 3 ป้ายที่นัส 3′ อาร์เอ็นเอที่แยกต่างหากโดยใช้บ 4 เลนเป็นเลน 3 หลังจากย่อยอาหาร RNase T1 เลน 5 เครื่องหมาย polyadenine ผลลัพธ์เหล่านี้พิสูจน์ copurification ของ tetramer BDV-M heterologously แสดงกับอาร์เอ็นเอ oligonucleotides ของ ≈16 nt. (B) มันแสดงให้เห็นการผูกได้โหมด ssRNA โปรแกรมปรับปรุงพื้นฐานโดดเด่นตามแนวทแยง tetramer สามารถรองรับแกนหลัก polyphosphate (ศรสีเหลือง), ที่เป็นลูกโซ่เข้ามา (ซ้ายล่างสุด 3′) สิ้นสุด ด้วยการสังเกตผูกนิวคลีโอไทด์ (ศูนย์) สมมติว่า specificity สำหรับ cytidine/uridine มี 3 เส้นทางออกสุดท้าย 5′: (i) ที่ด้านบนซ้าย กับ 1 pyrimidine ฐานผูกใกล้แกน tetramer (ii) ที่ด้านบนขวา 2 nt และ (iii) ที่ด้านล่างขวา กลาง 3 ฐานสนับสนุน specificity ไม่สามารถแยกแยะได้เพราะสมมาตร crystallographic 4-foldลิ้ม BDV-M ถูกนำมาวิเคราะห์เพื่อตรวจสอบชนิดและความยาวของ oligonucleotides กับโปรตีน กรดนิวคลีอิกที่แยกต่างหากจาก BDV-M ได้หรือ radioactively-มีป้ายชื่อที่ 5′ และ 3′ สิ้นสุด และวิเคราะห์ โดยใช้ยูเรียหน้า (Fig. 4A) 5′ Labeling ใช้ T4 polynucleotide kinase (PNK), ซึ่งสามารถติดฉลากดีเอ็นเอและอาร์เอ็นเอนิวคลีโอไทด์ แสดงวงดนตรีแข็งแรงสอดคล้องกับส่วน 16-nt ย่อยอาหาร ด้วย T1 RNase ตามแยกยูเรียหน้าเปิดเผยของบางส่วนของกรดนิวคลีอิก การให้หลักฐานว่า กรดนิวคลีอิกในคำถามเป็นอาร์เอ็นเอ ใช้ Labeling 3′ polyadenylate พอลิเมอเรส (บ), เฉพาะสำหรับ ssRNA นิวคลีโอไทด์ เปิดเผยบางส่วนของ 13 - และ 16-nt RNase รักษาของตัวอย่างยังผลในการย่อยสลายของเศษส่วนกรดนิวคลีอิก แม้ว่าแยกส่วนเพราะมีขนาดใหญ่กว่าสำหรับ digested ป้าย 5′ PNK ตัวอย่าง Pretreatment ของเศษโปรตีน BDV-M กับ RNase A หรือ endonuclease เฉพาะคู่ Benzonase ก่อนแยกกรดนิวคลีอิกให้ผลลัพธ์เทียบเท่า แสดงว่า oligonucleotide อาร์เอ็นเอได้รับการป้องกัน โดยโปรตีน M ในทางกลับกัน พยายามเอากรดนิวคลีอิกผ่าน denaturation BDV-M และพับในภายหลังได้สำเร็จจนถึงตอนนี้ เพิ่มความเป็นไปได้ว่า อาร์เอ็นเอรวมมีบทบาทโครงสร้างในความสมบูรณ์ของการ tetramer การรักษาทั้งสองอย่างชื่อ 3′ และ 5′ กรดนิวคลีอิกแยกกับ RNase A ผลย่อยอาหารเกือบเสร็จสมบูรณ์แล้วไป mononucleotides ดังนั้น กลยุทธ์ทั้งการติดฉลากแสดงหลักฐานว่า BDV-M แสดง heterologously ใน Escherichia colibinds และปกป้อง ssRNA oligonucleotides ความยาวของฐาน ≈16 หรือมากกว่ารวมข้อมูลการเพาะเลี้ยง และ crystallographic ก็มีแนวโน้มว่า การ BDV-M tetramer binds อาร์เอ็นเอ oligonucleotides ประกอบด้วย 1, 2 หรือ pyrimidine ติดต่อกัน 3 ฐาน ฐานที่ 4 ไม่สามารถผูกกัน เพราะ restraints steric (Fig. 4B) เข้าใจและดูสมจริงมากขึ้นของอาร์เอ็นเอกับ tetramer BDV-M เราจำลอง และกลั่น cytidine trinucleotide โดยเชื่อมโยง 3 สัมพันธ์สมมาตร CMP โมเลกุล (Fig. 3B) ในแนวไปได้ 2: 3′ – 5′ และ 5′-3′ สามารถจะกลั่น trinucleotide 1 วางให้พอดีกับแผนที่ความหนาแน่นอิเล็กตรอนกับเรขาคณิตเหมาะสมติดต่อโปรตีนโดยไม่เพิ่มปัจจัย R crystallographic พารามิเตอร์ conformational mononucleotide กลั่นและ trinucleotide จะแสดงตาราง S1 รีไฟน์เมนท์เป็น trinucleotide การเปลี่ยนแปลง conformation นิวคลีโอไทด์ที่เปรียบเทียบกับรุ่น mononucleotide เล็กน้อย: แม้ว่าฐาน pyrimidine แทบไม่เปลี่ยนตำแหน่ง ตำแหน่งที่ตั้งของกลุ่มฟอสเฟตและน้ำตาล moieties เปลี่ยนเป็นลำดับของการเชื่อมโยง covalent ของ mononucleotides พบกะที่ใหญ่ที่สุดสำหรับการ 5′ นิวคลีโอไทด์ แหวน pyrimidine จะถูกเลื่อน ≈0.5 Å และกลุ่มฟอสเฟตฟรีย้าย 2.2 เมื่อเทียบกับรีไฟน์เมนท์ mononucleotide Å ผลคล้ายจะได้รับเมื่อละเอียดลออของ dinucleotide เป็นแบบกลั่น triribonucleotide พอดีไป (4-fold crystallographically เฉลี่ย) ความหนาแน่นอิเล็กตรอน และทำให้ความไม่แน่นอนของความหนาแน่นอิเล็กตรอนเหลืออ่อนใกล้กับแต่ละกลุ่มฟอสเฟตเทอร์มินัลเป็นของก่อนหน้า และต่อนิวคลีโอไทด์ ตรวจสอบศักยภาพสถิต BDV-M ระบุว่า หลักสูตรเป็นไปได้สำหรับโซ่ polynucleotide ยาวไปตามพื้นผิวของ tetramer (Fig. 4B), corroborated โดยตำแหน่งของประจุซัลเฟตที่ถูกผูกไว้ใน สำหรับสายพันธุ์ที่เล็กที่สุดใน ssRNA ใกล้แกน tetramer, tetramer BDV-M เดียวควรผูกเป็น oligoribonucleotide เซ็กเมนต์ประกอบด้วย 2 ฐาน pyrimidine ติดต่อกัน แม้ว่าโหมดอื่น ๆ ผูก (นิวคลีโอไทด์ 1 หรือฐาน 3 คืนติดต่อกัน) ก็เป็นไปได้ (Fig. 4B) เป็นไปได้ว่า ต่ออาร์เอ็นเอ specificity กระเป๋าอยู่บนพื้นผิว แต่มี undetec

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

มะเดื่อ 2.
คุณสมบัติพื้นผิวของใบหน้าเยื่อผูกพันสมมุติ tetramer BDV-M (A) ที่มีศักยภาพผิวไฟฟ้าสถิตเผยให้เห็นใบหน้านี้จะเป็นพื้นฐานอย่างมาก (สีพื้นที่ในสีขาว, สีแดงและสีฟ้าแสดงว่าเป็นกลางเชิงลบและบวกที่มีศักยภาพโค้งที่ 0, - 3, และ 3 kT / E ตามลำดับ) ดูจะหมุน 180 องศารอบญาติแกนนอนรูป Fig 1C (B) มุมมองด้านข้างของ tetramer ได้รับโดยการหมุน (A) 90 °กับแกนนอนภาพวาด BDV-M ใกล้เมมเบรนเรียม (ต่ำกว่า) ค่าใช้จ่ายผิวสลับ (เป็นกรด / ธรรมดา) ของขอบ tetramer จะอำนวยความสะดวกในการชุมนุมข้างในรูปแบบอาร์เรย์ระนาบ.
ในผลึกตาข่าย, tetramer แต่ละอยู่ในตำแหน่งแบบตัวต่อตัวกับ tetramer สองผ่านเมมเบรนสมมุติผูกพันพื้นผิวในรูปแบบที่ไม่ค่อย -associated octamer crystallographic แพทช์ประจุบวกรอบ Arg-98 1 tetramer juxtaposes แพทช์ประจุลบซึ่งอยู่ใกล้กับสถานี C ของ tetramer ตรงข้าม เพราะรูปร่างเหมือนดิสก์ของ tetramer BDV-M ระยะทางระหว่าง tetramers ช่วงจาก 3.95 Å (Pro 142 O-Arg 98 NE) ผ่าน 6-8 ที่ขอบถึง 20-25 ระหว่างศูนย์ของพวกเขา ส่งผลให้ในช่องตัวทำละลายที่มีขนาดใหญ่ที่มีขนาด 35 × 35 × 35 ปฏิสัมพันธ์ระหว่าง 2 tetramers เป็นผู้ไกล่เกลี่ยโดยโมเลกุลของตัวทำละลายรวมทั้งไอออน SO42- การค้นพบนี้มีความสอดคล้องกับผลการทดลองแสดงให้เห็นว่ารัฐ oligomeric สูงขึ้นของ M-โปรตีนปรากฏหลังจากบ่มยาวที่มีความเข้มข้นของเกลือสูงและการศึกษา ultracentrifugation ยืนยันว่าสมดุลอยู่ระหว่าง tetramers และ octamers ของ BDV-M (16) เพราะเมมเบรนที่มีผลผูกพันใบหน้าไม่สามารถเข้าถึงได้ภายใน octamer crystallographic ก็ไม่น่าที่จะสามารถที่จะผูกกับ bilayers ไขมัน.
ความหนาแน่นของอิเล็กตรอนเผยเบสผูกพันที่จะ BDV-M. ในระหว่างการกำหนดโครงสร้างความหนาแน่นของอิเล็กตรอนเพิ่มเติมถูกพบใกล้กับ C ปลายทางของα4เกลียวใกล้กับแกน 4 เท่าของ tetramer BDV-M ความหนาแน่นอาจตีความได้ว่า mononucleotide pyrimidine ที่เราได้รับมอบหมายให้เป็น cytidine-5'-monophosphate (รูปที่. 3) ฐานเป็นแซนวิชในกระเป๋าระหว่างโซ่ด้านข้างของเพ-37 (จากวงβ1-β2) และเขา 112 (จากα4เกลียว) ที่ระยะ 3.4 ให้กับแต่ละ (รูปที่ 3A.); เช่นแหวนคู่ขนานซ้อนระหว่างฐานและสารตกค้างที่มีกลิ่นหอมเป็นเรื่องปกติสำหรับการปฏิสัมพันธ์กรดนิวคลีอิกโปรตีน (28) ชุดของพันธะไฮโดรเจนกับฐานจะสังเกต: ระหว่างอะตอมหลักห่วงโซ่ของเพ-37 และแหวนฐานของนิวคลีโอจากห่วงโซ่ด้านข้างของ Gln-36, จากห่วงโซ่ด้านข้างของ Asn-115 # สมมาตร ที่เกี่ยวข้องกับโมเลกุลและพันธะไฮโดรเจนน้ำพึ่งจะ Asn-39 ยังไม่มีและห่วงโซ่ด้านข้างของ Asn 115 # (รูป. 3A) นอกจากนี้อะตอม O2 ของครึ่งน้ำตาล riboxynucleotide จะไฮโดรเจนพันธบัตรโซ่ด้านข้างของ Gln-36 เครือข่ายของการสื่อสารสังเกตฐาน cytosine จะคล้ายกันสำหรับ uracil ด้วยพันธะไฮโดรเจนพิเศษสำหรับ uracil N3 ไฮโดรเจน ผูกพันของมีนยังเป็นไปได้แม้ว่ากลุ่มเมธิลจะทำการติดต่อใกล้กับห่วงโซ่ด้านข้างของ Asn-115 # ในทางตรงกันข้ามกับฐาน pyrimidine เหล่านี้ไม่ว่าขนาดของกระเป๋าหรือรูปแบบพันธะไฮโดรเจนมีความเหมาะสมที่จะมีผลผูกพันในฐาน purine ใหญ่ adenine และ guanine น่าแปลกที่อาร์เอ็นเอที่มีผลผูกพันที่เกิดขึ้นบนใบหน้าของโมโนเมอร์ตรงข้ามกับที่สอดคล้องกับ trinucleotide เว็บไซต์ที่มีผลผูกพันใน octamers VP40 (18) (รูป. S1 และรูป. S3). รูป 3. เว็บไซต์เบื่อหน่ายที่มีผลผูกพันใน BDV-M (A) ความหนาแน่นของอิเล็กตรอนทดลอง (ละเว้นแผนที่โค้งที่ 3 σ) กับ monoribonucleotide กลั่น cytidine-5'-monophosphate ที่เชื่อมต่อระหว่าง 2 โมโนเมอร์ (มุมมองและสีเช่นเดียวกับในรูป. 1C) แหวน pyrimidine ถูกคั่นกลางระหว่างโซ่ด้านข้างของเพ 37 และพระ-112 และจะจัดขึ้นในตำแหน่งที่ผ่านพันธะไฮโดรเจนกับห่วงโซ่หลักของเพ-37 และกลุ่ม carboxamide ของเพื่อนบ้าน Asn-115 (ระยะทางใน A) นอกจากนี้อะตอม O2 ของครึ่งน้ำตาล riboxynucleotide จะไฮโดรเจนพันธบัตรโซ่ด้านข้างของ Gln 36 (B) พื้นผิวที่มีศักยภาพทางไฟฟ้าสถิตของ BDV-M (ระดับรูปร่างเช่นเดียวกับในรูปที่. 2) กับอาร์เอ็นเอกลั่น trinucleotide (CCC) . หมายเหตุตำแหน่งทางเลือกของกลุ่มฟอสเฟตใน crystallographically 4 เท่าโครงสร้างเฉลี่ย. ผูกพันของ oligonucleotides เพื่อ BDV-M. ในการทำงานก่อนหน้า, สเปกตรัมรังสียูวีของ BDV-M เศษส่วน oligomeric แสดงให้เห็น 2 สูงสุดกับ OD280 อัตราส่วนการ OD260 ของ≈1.1 ( 16) ซึ่งแสดงว่ากรดนิวคลีอิก แม้ว่าความหนาแน่นอธิบายไว้ข้างต้นเป็นที่ชัดเจนแสดงให้เห็นว่าฐาน pyrimidine ถูกผูกไว้กับการผลิต heterologously BDV-M ใกล้แกน tetramer ความละเอียด จำกัด และ B มูลค่าโดยรวมสูงของข้อมูลที่ไม่อนุญาตให้มีความแตกต่างระหว่างอาร์เอ็นเอและดีเอ็นเอ นอกจากนี้ค่าเฉลี่ย 4 เท่าที่กำหนดโดยสมมาตร crystallographic ติ๊ดประจำตัวประชาชนของ oligonucleotides อีกต่อไปที่ไม่ปฏิบัติตามสมมาตรนี้ การกระจายไฟฟ้าสถิตที่พื้นผิวโปรตีนที่แสดงให้เห็น แต่ที่ BDV-M ยังสามารถผูกเศษกรดนิวคลีอิกขนาดใหญ่ (รูปที่ 4).. รูป 4. Heterologously แสดงออก BDV-M ผูก oligonucleotides ssRNA (A) ยูเรียหน้าของกรดนิวคลีอิกที่แยกได้จากบริสุทธิ์ BDV-M tetramer ช่องทางซ้ายกำหนดเครื่องหมาย polyadenine 14-NT; ช่องทางที่ 1, RNA แยกติดป้ายที่ 5 'ปลายทางโดยใช้ PNK; ช่องทางที่ 2 เป็นช่องทางที่ 1 หลังจากการย่อยอาหาร RNase T1; ช่อง 3, อาร์เอ็นเอที่แยกติดป้ายที่ 3'ปลายทางโดยใช้ PAP; 4 เลนเป็นเลนที่ 3 หลังจากการย่อยอาหาร RNase T1; ช่อง 5, เครื่องหมาย polyadenine ผลเหล่านี้พิสูจน์ copurification ของแสดงความ heterologously tetramer BDV-M กับ oligonucleotides อาร์เอ็นเอของ≈16 NT (B) ภาพแผนผังของโหมดผูกพันเป็นไปได้ของ ssRNA แพทช์พื้นฐานที่โดดเด่นตามเส้นทแยงมุม tetramer สามารถรองรับกระดูกสันหลังฟอสเฟต (ลูกศรสีเหลือง) เช่นว่าห่วงโซ่เข้ามา (ด้านล่าง 3'สิ้นซ้าย) จบลงด้วยความเบื่อหน่ายที่ถูกผูกไว้สังเกต (กลาง) สมมติว่าเฉพาะเจาะจงสำหรับ cytidine / uridine มี 3 เส้นทางทางออกที่เป็นไปได้สำหรับ 5'-End: (i) ที่ด้านบนซ้ายมี 1 ฐาน pyrimidine ผูกพันใกล้แกน tetramer; (ii) ที่มุมขวาบนมี 2 NT; และ (iii) ที่ด้านล่างขวามี 3 ฐานกลางที่เอื้อต่อความจำเพาะ มันเป็นไปไม่ได้ที่จะแยกความแตกต่างระหว่างพวกเขาเพราะ 4 เท่าสมมาตร crystallographic. ที่ปรุงใหม่ ๆ BDV-M ได้รับการวิเคราะห์ในการตรวจสอบทั้งสองชนิดและความยาวของ oligonucleotides ผูกพันกับโปรตีน กรดนิวคลีอิกที่แยกได้จาก BDV-M เป็นอีกทางเลือกหนึ่งกัมมันตภาพรังสีที่มีข้อความที่ 5 'และ 3' ปลายและวิเคราะห์โดยใช้ปุ๋ยยูเรียหน้า (รูป. 4A) 5 'การติดฉลากโดยใช้ไคเนส Polynucleotide T4 (PNK) ซึ่งสามารถฉลากทั้ง DNA และ RNA นิวคลีโอแสดงให้เห็นเป็นวงดนตรีที่แข็งแกร่งสอดคล้องกับส่วน 16-NT การย่อยด้วย RNase T1 ตามด้วยการแยกยูเรียหน้าเผยให้เห็นการสลายตัวของเศษกรดนิวคลีอิกให้หลักฐานที่แสดงว่ากรดนิวคลีอิกในคำถามย่อมเป็นอาร์เอ็นเอ 3 'การติดฉลากโดยใช้โพลีเมอ polyadenylate (PAP) ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับนิวคลีโอ ssRNA เผย 13 และเศษ 16-NT การรักษา RNase ของกลุ่มตัวอย่างยังส่งผลในการสลายตัวของกรดนิวคลีอิกส่วนแม้ว่าเศษต่อมามีขนาดใหญ่กว่าสำหรับย่อย 5'-ติดป้ายตัวอย่าง PNK การปรับสภาพของ BDV-M ส่วนโปรตีนที่มีทั้ง RNase หรือ endonuclease คู่เฉพาะ Benzonase ก่อนที่จะแยกกรดนิวคลีอิกให้ผลเทียบเท่าแสดงให้เห็นว่า oligonucleotide RNA มีการป้องกันโดย M-โปรตีน ตรงกันข้ามความพยายามที่จะเอากรดนิวคลีอิกผ่าน denaturation ของ BDV-M และต่อมาในหลอดทดลองพับไม่ประสบความสำเร็จจนถึงขณะนี้การเพิ่มความเป็นไปได้ที่อาร์เอ็นเอผูกพันมีบทบาทในโครงสร้างของความสมบูรณ์ของ tetramer การรักษาของทั้งสอง 3'- และ 5'-ติดป้ายแยกกรดนิวคลีอิกตัวอย่างกับ RNase ให้ผลการย่อยอาหารเกือบสมบูรณ์เพื่อ mononucleotides ดังนั้นทั้งกลยุทธ์การติดฉลากแสดงหลักฐานว่า BDV-M แสดง heterologously ใน colibinds Escherichia และปกป้อง oligonucleotides ssRNA ที่มีความยาวของฐาน≈16หรือมากกว่า. รวม crystallographic และในข้อมูลหลอดทดลองก็มีโอกาสที่ tetramer BDV-M ผูก oligonucleotides อาร์เอ็นเอ ที่มี 1, 2 หรือ 3 ฐาน pyrimidine ติดต่อกัน; 4 ฐานไม่สามารถจะผูกพันไปพร้อม ๆ กันเพราะพันธนาการ steric (รูป. 4B) เพื่อความเข้าใจที่ดีขึ้นและดูสมจริงมากขึ้นของ RNA ผูกพันกับ tetramer BDV-M เราสร้างแบบจำลองและการกลั่น trinucleotide cytidine โดยการเชื่อมโยง 3 สมมาตรที่เกี่ยวข้องกับโมเลกุลของซีเอ็มพี (รูปที่ 3B.) ใน 2 ทิศทางเป็นไปได้: 3'-5 และ 5 '-3' เพียง 1 การวางแนวของ trinucleotide อาจจะกลั่นเพื่อให้พอดีกับความหนาแน่นของอิเล็กตรอนแผนที่ที่มีรูปทรงเรขาคณิตที่เหมาะสมและการติดต่อโปรตีนโดยไม่ต้องเพิ่มปัจจัย R crystallographic พารามิเตอร์โครงสร้างสำหรับ mononucleotide กลั่นและ trinucleotide ถูกแสดงไว้ในตาราง S1 การปรับแต่งเป็น trinucleotide เปลี่ยนแปลงโครงสร้างเบื่อหน่ายเมื่อเทียบกับรุ่น mononucleotide เล็กน้อยแม้ว่าฐาน pyrimidine แทบจะไม่เปลี่ยนตำแหน่งของพวกเขา, สถานที่ของกลุ่มฟอสเฟตและ moieties น้ำตาลเปลี่ยนเป็นผลมาจากการเชื่อมโยงของโควาเลนต์ mononucleotides การเปลี่ยนแปลงที่ใหญ่ที่สุดที่มีการตั้งข้อสังเกตสำหรับ 5 'เบื่อหน่ายซึ่งแหวน pyrimidine จะเลื่อน≈0.5และกลุ่มฟอสเฟตฟรีย้าย 2.2 เมื่อเทียบกับการปรับแต่ง mononucleotide ผลที่คล้ายกันจะได้รับเมื่อการปรับแต่งของ dinucleotide. รุ่น triribonucleotide กลั่นพอดีกับ (4 เท่าเฉลี่ย crystallographically) ความหนาแน่นของอิเล็กตรอนและช่วยให้การตีความเบื้องต้นของความหนาแน่นของอิเล็กตรอนที่เหลืออ่อนแอใกล้กับกลุ่มฟอสเฟตแต่ละสถานีเป็นของนิวคลีโอก่อนหน้านี้และต่อไปนี้ การตรวจสอบ BDV-M ที่มีศักยภาพไฟฟ้าสถิตบ่งชี้แน่นอนเป็นไปได้สำหรับโซ่ Polynucleotide อีกต่อไปตามพื้นผิวของ tetramer (รูป. 4B) โดยยืนยันสถานที่ของไอออนซัลเฟตที่ถูกผูกไว้ในผลึก สำหรับความเครียดน้อยที่สุดใน ssRNA ใกล้แกน tetramer, tetramer BDV-M เดียวควรผูกส่วน oligoribonucleotide มี 2 ฐาน pyrimidine ติดต่อกันแม้ว่าโหมดผูกพันอื่น ๆ (1 เบื่อหน่ายหรือ 3 ฐานติดต่อกัน) นอกจากนี้ยังมีความเป็นไปได้ (รูป. 4B) เป็นไปได้ว่ากระเป๋าจำเพาะ RNA เพิ่มเติมที่มีอยู่บนพื้นผิว แต่ undetec

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

รูปที่ 2 .
สมบัติพื้นผิวของเส้นใยเยื่อจับใบหน้าของมี bdv-m . ( 1 ) ศักยภาพพื้นผิวไฟฟ้าสถิต เผยให้เห็นใบหน้านี้เป็นในเชิงพื้นฐาน ( พื้นที่สีในสีขาว , สีแดงและสีฟ้าแสดงถึงความเป็นกลาง ด้านลบ และบวกศักยภาพโค้งที่ 0 , − 3 , 3 KT / E ตามลำดับ ) วิว 180 องศารอบแกนหมุนตามแนวนอนเมื่อเทียบกับภาพที่ 1c .( ข ) มุมมองของเตตระเมอร์ได้โดยการหมุน ( ) โดย 90 องศากับแกนแนวนอน , ภาพวาด bdv-m ใกล้เยื่อฟอสโฟลิพิด ( ล่าง ) สลับค่าพื้นผิว ( เปรี้ยว / พื้นฐาน ) ของมีขอบด้านข้างจะช่วยประกอบในรูปแบบอาร์เรย์ในแนวระนาบ .
ในขัดแตะคริสตัล ,แต่ละตำแหน่งมีเป็นแบบที่สองมีผ่านเยื่อผิวซึ่งผูกรูปอย่างอ่อนที่เกี่ยวข้องทางกทาเมอร์ . ประจุบวก arg-98 แพทช์รอบ 1 มี juxtaposes ประจุลบแพทช์ใกล้ C ปลายทางของฝ่ายตรงข้ามมี . เพราะดิสก์เช่นรูปร่างของ bdv-m มี ,ระยะทางระหว่าง tetramers ช่วง 3.95 กริพเพน ( Pro 142 O – arg 98 เน่ ) , ผ่าน 6 – 8 •ที่ขอบถึง 20 – 25 •ระหว่างศูนย์ ผลขนาดใหญ่ ช่องที่มีขนาด 3 × 3 ตัวทำละลาย× 35 • . ปฏิสัมพันธ์ระหว่างระดับโมเลกุลของตัวทำละลาย 2 tetramers อยู่ด้วย รวมทั้ง so42 −ไอออนการค้นพบนี้สอดคล้องกับผลการทดลองแสดงให้เห็นว่าสูงกว่าโอลิโกของสหรัฐอเมริกา m-protein ปรากฏเมื่อบ่มที่ความเข้มข้นเกลือสูง และ ultracentrifugation การศึกษายืนยันว่า การสมดุลระหว่าง tetramers และ octamers ของ bdv-m ( 16 ) เนื่องจากเยื่อหุ้มปกหน้าเข้าไม่ได้ทางภายในกทาเมอร์ ,มันไม่น่าที่จะสามารถผูกกับไขมันสองชั้น .
ความหนาแน่นอิเล็กตรอน พบยีนผูก bdv-m.

ระหว่างโครงสร้างการกำหนดความหนาแน่นอิเล็กตรอนเพิ่มเติมพบอยู่ใกล้กับ C ปลายทางของเกลียวα 4 , ใกล้ถึง 4 เท่าแกนของเตตระเมอร์ bdv-m . ความหนาแน่นอาจจะตีความเป็น mononucleotide ไพริมิดีน ซึ่งเราได้มอบหมาย เช่น cytidine-5 ’ - โมโนฟอสเฟต ( ฟิค3 ) ฐานที่อยู่ในกระเป๋าระหว่างโซ่ข้างของ phe-37 ( จากวง 1 –βบีตา 2 ) และ his-112 ( เกลียวα 4 ) ที่ระยะทาง 3.4 •แต่ละ ( รูปที่ 3A ) ; เช่นขนานแหวนซ้อนระหว่างฐานและสารตกค้างหอมชนิด โปรตีนและกรดนิวคลีอิกปฏิสัมพันธ์ ( 28 ) ชุดของพันธะไฮโดรเจนกับฐานมีดังนี้ :ระหว่างหลักห่วงโซ่อะตอมของ phe-37 และฐานแหวนของนิวคลีโอไทด์ จากด้านข้างของ gln-36 โซ่ , โซ่จากด้านข้างของ asn-115 #ของสมมาตรโมเลกุลที่เกี่ยวข้องและน้ำผ่านพันธะไฮโดรเจนกับ asn-39 N , และด้านห่วงโซ่ของ asn 115 # ( รูปที่ 3 ) นอกจากนี้ การได้รับ O2 อะตอมของ riboxynucleotide น้ำตาลกึ่งหนึ่งจะพันธะไฮโดรเจนในด้านห่วงโซ่ของ gln-36 .เครือข่ายปฏิสัมพันธ์สังเกตเพื่อย้ายถิ่นฐานจะคล้ายกันสำหรับยูราซิล กับ พันธะไฮโดรเจนเสริมสำหรับยูราซิล N3 ไฮโดรเจน ผูกพันของเพลินตาก็เป็นไปได้ แม้ว่ากลุ่มเมทิลจะให้สัมผัสใกล้ชิดในด้านห่วงโซ่ของ asn-115 # . ในทางตรงกันข้ามกับเบสไพริมิดีนเหล่านี้ทั้งขนาดของกระเป๋าและพันธะไฮโดรเจนแบบเหมาะกับการจับของขนาดใหญ่และฐาน purine และเสียงกรอบแกรบ . จู่ ๆ ซึ่งมีผลผูกพันที่เกิดขึ้นบนใบหน้าของโมโนเมอร์ที่ตรงข้ามกับที่สอดคล้องกับทัศนคติผูกพันเว็บไซต์ใน vp40 octamers ( 18 ) ( ภาพที่ S1 และมะเดื่อ S3 )

รูปที่ 3 เว็บไซต์ bdv-m. นิวคลีโอไทด์ ผูกพัน( ก ) ความหนาแน่นอิเล็กตรอนทดลอง ( ละเว้นแผนที่โค้งที่ 3 σ ) ถึง monoribonucleotide cytidine-5 ’ - โมโนฟอสเฟตที่เชื่อมต่อระหว่าง 2 แบบ ( ดูในรูปและสีเป็น 1C )วงแหวนไพริมิดีนเป็นแซนวิชระหว่างโซ่ข้างของเพ 37 และ his-112 และจะจัดขึ้นในตำแหน่งผ่านพันธะไฮโดรเจนกับห่วงโซ่หลักของ phe-37 คาร์โบซาไมด์และกลุ่มใกล้เคียง asn-115 ( ระยะทางในกริพเพน ) นอกจากนี้ การได้รับ O2 อะตอมของ riboxynucleotide น้ำตาลกึ่งหนึ่งจะพันธะไฮโดรเจนในด้านห่วงโซ่ของ gln 36