The 20S proteasome of T. acidophilu

The 20S proteasome of T. acidophilum is interacting with the CDC48
homolog ATPase (Ta0840) (Barthelme and Sauer, 2012; Forouzan et al.,
2012). This interaction was demonstrated with recombinant proteins in
pull-down and biochemical assays. However, Ta0840 was not detected
in our pull-down assays using two distinct 20S proteasome specific
scFv antibodies. This might be due to the different compositions of
lysis buffer that was used in the above mentioned experiments. This
supports the observation that to isolate loosely associated complexes
in intact shape structure-preserving buffer compositions should be determined
experimentally for each complex, regardless of the protein
separation method used to isolate them (Sun et al., 2009).
Previous proteomics studies showed that Ta0152 possesses complex
forming ability suggesting a ~500 kDa molecular weight, which size was
in good agreement with its hexadecameric homologue of Aeropyrum
pernix (Mizohata et al., 2005). Our result might indicate that the antibody
purified Ta0152 ring was prevented from ordered aggregation which
was detected in earlier studies (R. Knispel, personal communication)
therefore this complex could not be visualized by EM (data not shown).
Our scFv-antibody based two-step chromatography separation method
allowed the isolation of intact complexes from native T. acidophilum
cell extract and on the example of two well-known complexes we
demonstrated the feasibility of scFv-based purification technique for
other high molecular weight complexes. These complexes can be subjected
to biochemical and/or EM analyses however care should be taken to
carry out the experiments with several specific scFvs to avoid enzyme inhibition.
We proved the power of this method by described experiments
however to avoid unnecessary cloning steps and to increase the bait
yield creating a His-tagged nanobody displaying phage library based
on camelid immunization would be a viable option

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

มีการโต้ตอบ proteasome 20S ของ T. acidophilum กับ CDC48homolog ATPase (Ta0840) (Barthelme และ Sauer, 2012 Forouzan et al.,2012) . ปฏิสัมพันธ์นี้ก็แสดงให้เห็น ด้วย recombinant โปรตีนในดึงลง และชีวเคมี assays อย่างไรก็ตาม ไม่พบ Ta0840ใน assays ดึงลงของเราใช้เฉพาะ proteasome 20S ที่แตกต่างกันสองscFv แอนติบอดี ซึ่งอาจเนื่องจากองค์ประกอบต่าง ๆ ของlysis บัฟเฟอร์ที่ถูกใช้ในข้างต้นกล่าวถึงการทดลอง นี้รองรับการสังเกตว่า แยกหลวม ๆ เกี่ยวข้องคอมเพล็กซ์รูปร่างเหมือนเดิม ควรกำหนดรักษาโครงสร้างองค์ประกอบของบัฟเฟอร์ทดลองสำหรับแต่ละคอมเพล็กซ์ ไม่ว่าโปรตีนวิธีการแยกที่ใช้แยกพวกเขา (Sun et al. 2009)ศึกษาโปรตีโอมิกส์ก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่า มี Ta0152 ซับซ้อนขนาดที่ขึ้นรูปสามารถบอกน้ำหนักโมเลกุล ~ 500 kDa ถูกในข้อตกลงที่ดีกับ homologue ของ hexadecameric ของ Aeropyrumpernix (Mizohata et al. 2005) ผลการค้นหาของเราอาจบ่งชี้ว่า แอนติบอดีแหวน Ta0152 บริสุทธิ์ถูกป้องกันไม่ให้สั่งรวมซึ่งตรวจพบในการศึกษาก่อนหน้า (R. Knispel การสื่อสาร)ดังนั้น ที่ซับซ้อนอาจไม่สามารถแสดงเป็นภาพ ด้วย EM (ไม่แสดงข้อมูล)ของเรา scFv แอนติบอดีตามวิธีแยก chromatography สองขั้นตอนอนุญาตให้แยกของคอมเพล็กซ์เหมือนเดิมจากเจ้า T. acidophilumสารสกัดจากเซลล์และใช้ตัวอย่างของคอมเพล็กซ์รู้จักสองเราแสดงให้เห็นความเป็นไปได้ของเทคนิค scFv คะแนนบริสุทธิ์สำหรับคอมเพล็กซ์อื่น ๆ โมเลกุลสูง สิ่งอำนวยความสะดวกเหล่านี้สามารถถูกบังคับการทางชีวเคมี หรือ EM วิเคราะห์อย่างไรก็ตาม ดูแลจะต้องดำเนินการดำเนินการทดสอบกับหลายเฉพาะ scFvs เพื่อหลีกเลี่ยงการยับยั้งเอนไซม์เราพิสูจน์แล้วว่าพลังของวิธีการนี้ โดยการทดลองอธิบายอย่างไรก็ตาม เพื่อหลีกเลี่ยงขั้นตอนการโคลนที่ไม่จำเป็น และเพิ่มเหยื่อผลผลิตสร้าง nanobody แท็กของพระองค์ที่แสดงจากไลบรารีของ phageบน camelid สร้างภูมิคุ้มกันจะเป็นอีกตัวเลือก

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

proteasome 20S ที acidophilum มีการปฏิสัมพันธ์กับ CDC48
homolog ATPase (Ta0840) (หมอบาร์เธลและซาวเออร์ 2012;. Forouzan, et al,
2012) ปฏิสัมพันธ์นี้ก็แสดงให้เห็นกับโปรตีนใน
ดึงลงและการวิเคราะห์ทางชีวเคมี อย่างไรก็ตาม Ta0840 ไม่พบ
ในการตรวจเลื่อนลงของเราโดยใช้สอง 20S ที่แตกต่างกัน proteasome เฉพาะ
แอนติบอดี scFv นี้อาจจะเป็นเพราะองค์ประกอบที่แตกต่างของ
บัฟเฟอร์สลายที่ใช้ในการทดลองดังกล่าวข้างต้น นี้
สนับสนุนการสังเกตว่าจะแยกคอมเพล็กซ์ที่เกี่ยวข้องอย่างอิสระ
ในสภาพสมบูรณ์รูปร่างโครงสร้างการรักษาองค์ประกอบบัฟเฟอร์ควรจะพิจารณา
การทดลองสำหรับแต่ละที่ซับซ้อนโดยไม่คำนึงถึงโปรตีน
วิธีการแยกใช้เพื่อแยกพวกเขา (Sun et al., 2009).
โปรตีนก่อนหน้าการศึกษาแสดงให้เห็นว่า Ta0152 มีคุณสมบัติที่ซับซ้อน
ความสามารถในการขึ้นรูปแนะนำ ~ 500 kDa น้ำหนักโมเลกุลซึ่งเป็นขนาดที่
อยู่ในข้อตกลงที่ดีกับคล้ายคลึงกัน hexadecameric ของ Aeropyrum
pernix (Mizohata et al., 2005) ผลของเราอาจบ่งชี้ว่าแอนติบอดี
บริสุทธิ์แหวน Ta0152 ได้รับการป้องกันจากการรวมตัวสั่งซื้อที่
ถูกตรวจพบในการศึกษาก่อนหน้า (อาร์ Knispel, การสื่อสารส่วนบุคคล)
ดังนั้นการที่ซับซ้อนนี้ไม่สามารถมองเห็นโดย EM (ไม่ได้แสดงข้อมูล).
scFv แอนติบอดีของเราอยู่สอง วิธีการแยกโครมาโต -step
ได้รับอนุญาตแยกคอมเพล็กซ์เหมือนเดิมจาก T. พื้นเมือง acidophilum
สารสกัดจากเซลล์และตัวอย่างของสองเชิงซ้อนที่รู้จักกันดีที่เรา
แสดงให้เห็นถึงความเป็นไปได้ของเทคนิคการทำให้บริสุทธิ์ scFv-based สำหรับ
อื่น ๆ สูงน้ำหนักโมเลกุลเชิงซ้อน คอมเพล็กซ์เหล่านี้สามารถอยู่ภายใต้
การทางชีวเคมีและ / หรือ EM วิเคราะห์อย่างไรก็ตามการดูแลควรจะนำไป
ดำเนินการทดลองกับ scFvs เฉพาะหลายอย่างเพื่อหลีกเลี่ยงการยับยั้งเอนไซม์.
เราได้รับการพิสูจน์พลังของวิธีการนี้โดยการทดลองอธิบาย
อย่างไรเพื่อหลีกเลี่ยงขั้นตอนการโคลนที่ไม่จำเป็นและจะเพิ่มขึ้น เหยื่อ
ผลผลิตสร้างห้องสมุดของเขาทำลายจุลินทรีย์ที่ติดแท็ก nanobody แสดงตาม
ใน camelid การฉีดวัคซีนจะเป็นตัวเลือกที่ทำงานได้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

20s โปรตีเ ซม ต. acidophilum คือการโต้ตอบกับ cdc48homolog ATPase ( ta0840 ) และ ( barthelme รุ่น 2012 ; forouzan et al . ,2012 ) ปฏิสัมพันธ์นี้แสดงให้เห็นว่าโปรตีนรีคอมบิแนนท์ในทั้งและชีวเคมี ) . อย่างไรก็ตาม ta0840 ไม่พบในยีนของเราใช้ทั้งสองที่แตกต่างกัน 20 โปรตีเ ซม เฉพาะscfv แอนติบอดี นี้อาจจะเนื่องมาจากองค์ประกอบต่าง ๆการสลายบัฟเฟอร์ที่ใช้ในข้างต้นกล่าวถึงการทดลอง นี้สนับสนุนให้สังเกตว่าแยกหลวมความสัมพันธ์เชิงซ้อนในการรักษารูปร่างโครงสร้างยังคงควรพิจารณาองค์ประกอบบัฟเฟอร์โดยแต่ละที่ซับซ้อน ไม่ว่าจะในโปรตีนวิธีแยกใช้เพื่อแยกพวกเขา ( Sun et al . , 2009 )การศึกษาก่อนหน้านี้พบว่า ขีดความสามารถ ta0152 มีคุณสมบัติที่ซับซ้อนสร้างความสามารถในการแนะนำ ~ 500 ดาลตันน้ำหนักโมเลกุลที่ขนาด คือในข้อตกลงที่ดีกับผิวของ aeropyrum hexadecamericpernix ( mizohata et al . , 2005 ) ผลของเราอาจบ่งชี้ได้ว่า แอนติบอดีบริสุทธิ์ ta0152 แหวนถูกขัดขวางจากการสั่งที่ที่ตรวจพบในการศึกษาก่อนหน้านี้ ( R . knispel , การสื่อสารส่วนบุคคล )ดังนั้นที่ซับซ้อนนี้ไม่สามารถมองเห็นโดยเอ็ม ( ข้อมูลไม่แสดง )แอนติบอดี scfv ของเราตามวิธีแยกสารแบบสองขั้นตอนอนุญาตให้แยกจากพื้นเมือง ต. acidophilum เหมือนเดิมเชิงซ้อนและสารสกัดจากเซลล์ในตัวอย่างที่ 2 เรารู้จักกันดีเชิงซ้อนแสดงให้เห็นถึงความเป็นไปได้ของการใช้เทคนิค scfv บริสุทธิ์อื่น ๆสูงโมเลกุลเชิงซ้อน . สารประกอบเหล่านี้สามารถถูกชีวเคมี และ / หรือ เอ็ม แต่ควรดูแลเพื่อการวิเคราะห์ดำเนินการทดลอง scfvs เฉพาะหลายเพื่อหลีกเลี่ยงการยับยั้งเอนไซม์ .เราพิสูจน์พลังของวิธีนี้โดยอธิบายการทดลองอย่างไรก็ตามเพื่อหลีกเลี่ยงขั้นตอนที่ไม่จำเป็น และการเพิ่มเหยื่อผลผลิตการสร้างของเขาแท็ก nanobody แสดงว่าตามห้องสมุดที่อ้น ภูมิคุ้มกันจะเป็นตัวเลือกที่ทำงานได้