5. Materials and methods5.1. Plant

5. Materials and methods
5.1. Plant materials and treatments
Cucumber (Cucumis sativus L.cv. Jinchun No. 2) seeds were
germinated on moist filter paper in the dark at 28 C for 30 h, then
sowed in plastic trays (41  41  5 cm) containing quartz sand, and
cultured in greenhouse at 25e30 C (day) and 15e18 C (night)
under natural light with relative humidity of 60e75%. When the
cotyledons had expanded, seedlings were supplied with water
containing one-half-strength Hoagland’s nutrient solution. After
full development of the two leaves, twelve seedling of uniform size
were transplanted into each of three plastic containers
(51  33  20 cm), which were filled with full-strength Hoagland’s
nutrient solution, and renewed every 3 days. The nutrient solutions
were kept at 20e25 C and were continuously aerated using an air
pump at an interval of 20 min to maintain the dissolved oxygen at
8.0  0.2 mg L1
.
After 3 d of pre-culture, the cucumber seedlings were treated as
follows: 1) CK, control plants were grown in Hoagland’s solution; 2)
CS, plants were grown in Hoagland’s solution and the leaves were
sprayed with 1 mM Spd; 3) S, plants were grown in Hoagland’s
solution containing 75 mM NaCl; and 4) SS, plants were grown in
Hoagland’s solution containing 75 mM NaCl, the leaves were
sprayed with 1 mM Spd. The leaves of the control and salt-treated
plants were sprayed with distilled water. Tween-20 (0.5%, v/v) was
used as the surfactant. The leaves were sprayed with Spd and
distilled water everyday at 18:00. Following 3 days of treatment,
the fully expanded third leaves were harvested, immediately frozen
in liquid nitrogen and stored at 80 C until further processed for
protein extraction.
5.2. Protein extraction
Protein extraction was performed according to a modified
version of the method of Hurkman [36]. Leave samples (1e2 g fresh
weight) were ground in a mortar with liquid nitrogen. The ground
samples were suspended in 30 mM TriseHCl (pH 8.7) containing
1 mM EGTA, 1 mM DTT and 1 mM PMSF and then were centrifuged
at 15,000 g for 20 min. The aliquot (1 ml) of the resulting supernatant
was placed into a tube and precipitated with acetone containing
10% TCA and 0.07% b-mercaptoethanol. The resulting
protein sample was allowed to precipitate overnight at 20 C and
then centrifuged at 20,000 g for 25 min. The pellet was rinsed three
times with cold acetone containing 0.07% b-mercaptoethanol and
allowed to stand at 20 C for 1 h. Finally the protein pellet was airdried
and used for 2-dimensional gel electrophoresis (2-DE).
5.3. 2-DE
Isoelectric focusing (IEF) was performed according to the
methods of Duncan and Hershey [37]. The dried protein pellet was
rehydrated in rehydration buffer 7 M urea, 2 M thiourea, 4% 3-[(3-
cholanidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid (w/
v), 40 mM DTT, 0.5% (v/v) immobilized pH gradient (IPG) buffer 4e7
and 0.01% (w/v) bromophenol blue. Protein levels were quantified
according to the Bradford method [38]. IPG strips of nonlinear pI 4e
7 (13 cm) were loaded with 250 ml of protein sample containing
800 mg proteins in a rehydration tray for 12e16 h at room
temperature. Following rehydration, the IPG strips were run on
an Ettan IPGphor 3 (GE Healthcare, USA). The voltage for IEF was
set at 200 V for 1 h, followed by 500 V for 1 h, 1000 V for 1 h,
3000 V for 30 min, 5000 V for 30 min, gradient 8000 V for
30 min, and 8000 V rapid focus, reaching a total of 35,000 V h.
The cell temperature was maintained at 20 C with a maximum
current of 50 mA per strip. After running the first dimension, IEF
strips were equilibrated for 15 min with 10 ml DTT buffer
containing 6 M urea, 30% (v/v) glycerol, 2% SDS, 1% (w/v) DTT and
50 mM TriseHCl (pH 8.8) and then with iodoacetamide buffer
with 2.5% (w/v) iodoacetamide instead of DTT for 15 min.
The second dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
was carried out on running gels (Hoefer SE600 Ruby Standard
Vertical System, GE Healthcare; 12.5% polyacrylamide) as described
by Laemmli [39]. The strips were embedded on the top of the SDSgel
and then sealed using 1% molten agarose solution. Electrophoresis
was carried out at 15 mA per gel until the bromophenol
blue dye reached the bottom of the gel. Protein spots were visualized
using Coomassie Brilliant Blue (CBB) R-250.
5.4. Image and data analysis
2-DE gels were scanned at 300 dpi using the Image Scanner III
(GE Healthcare). The digitized images were analyzed with Imagemaster
2D Platinum version 5.0 (GE Healthcare). At least three
gels from each treatment in three independent experiments were
used for the analysis. The intensities of spots were quantified based
on their relative volume, which was determined by the ratio of the
volume of a single spot to the whole set of spots. Only spots with
significant (at least 1.5-fold quantitative changes) and reproducible
changes in three replicates were picked up for mass spectrometry.
Student’s t-test with a significance level of 95% was used for the
statistical analysis of the gels. Only the spots showing a statistically
significant difference in protein abundance between the treatments
were considered to be differentially expressed spots.
5.5. Protein identification
Protein spots were excised from CBB-stained preparative polyacrylamide
gels. Proteins were identified using MALDI-TOF/TOF MS
by Ultraflex II mass spectrometer (Bruker Daltonics, Bremen, Germany)
as previously described [40]. The resulting peptide mass lists
were used to search the cucumber genomics database (http://
cucumber.genomics.org.cn) with the MOWSE search parameter
criteria as follows: significant protein MOWSE score at p < 0.05,
minimum mass accuracy 100 ppm, trypsin as enzyme, 1 missed
cleavage site, cysteine carbamidomethylation, acrylamide modified
cysteine, methionine oxidation, similarity of pI, relative molecular
mass specified and minimum sequence coverage of 15%.
5.6. Protein functional classification
The differentially expressed proteins were functional classified
according to their cellular function. Hierarchical clustering of protein
expression patterns was performed using Cluster software
version 3.0. Input data was calculated by dividing vol. % of each
protein spot at salt stress and Spd treatment by vol. % of the same
protein spot at control and log 2 transformed. Complete linkage
algorithm was enabled and results were visualized by Treeview
software version 1.60.
B. Li et al

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

5. วัสดุและวิธีการ5.1 การปลูกวัสดุและรักษาเมล็ดพันธุ์แตงกวา (Cucumis sativus L.cv Jinchun หมายเลข 2) ได้เปลือกงอกบนกระดาษกรองชุ่มชื่นในมืดที่ 28 C 30 h แล้วsowed ในถาดพลาสติก (41 41 5 ซม.) ประกอบด้วยควอตซ์ทราย และอ่างในเรือนกระจกที่ 25e30 C (วัน) และ 15e18 C (กลางคืน)ภายใต้แสงธรรมชาติมีความชื้นสัมพัทธ์% 60e75 เมื่อการมีขยาย cotyledons กล้าไม้ที่มากับน้ำประกอบด้วยวันครึ่งแรง Hoagland โซลูชันธาตุอาหาร หลังจากพัฒนาเต็มรูปแบบสองใบ 12 แหล่งขนาดสม่ำเสมอมี transplanted ในแต่ละภาชนะพลาสติกสาม(51 33 20 ซม), ซึ่งเต็มไป ด้วยความแรงเต็ม Hoaglandโซลูชั่นธาตุอาหาร และต่ออายุทุก 3 วัน โซลูชั่นธาตุอาหารถูกเก็บไว้ที่ 20e25 C และมีอย่างต่อเนื่องอากาศใช้อากาศปั๊มในช่วงเวลา 20 นาทีเพื่อรักษาปริมาณออกซิเจนที่ละลายใน8.0 0.2 มิลลิกรัม L1.หลังจาก 3 มิติของวัฒนธรรมก่อน กล้าไม้แตงกวาได้รับการรักษาเป็นดังต่อไปนี้: 1) CK ควบคุมที่มีปลูกพืชในโซลูชันของ Hoagland 2)CS พืชที่ปลูกในโซลูชันของ Hoagland และใบไม้ได้ฉีดพ่น ด้วย Spd; 1 มม. 3) S พืชที่ปลูกในของ Hoaglandโซลูชันที่ประกอบด้วย NaCl; 75 มม. และ 4) SS พืชที่ปลูกในโซลูชันของ Hoagland ประกอบด้วย 75 มม. NaCl ใบไม้ได้ฉีดพ่น ด้วย Spd 1 มม. ใบของตัวควบคุม และถือ ว่าเกลือพืชฉีดพ่น ด้วยน้ำกลั่น มี Tween-20 (0.5%, v/v)ใช้เป็น surfactant มีการฉีดพ่นใบ ด้วย Spd และน้ำกลั่นทุกวัน 18:00 ต่อ 3 วันของการรักษาใบที่สามที่ขยายเต็มเก็บเกี่ยวผลผลิต แช่แข็งทันทีในไนโตรเจนเหลว และเก็บไว้ที่ 80 C จนประมวลผลเพิ่มเติม สำหรับแยกโปรตีน5.2. โปรตีนสกัดทำการสกัดโปรตีนตามที่แก้ไขรุ่นวิธีการ Hurkman [36] ปล่อยตัวอย่าง (g 1e2 สดน้ำหนัก) ถูกพื้นในครกด้วยไนโตรเจนเหลว พื้นดินตัวอย่างถูกหยุดชั่วคราวใน 30 mM TriseHCl (pH 8.7) ประกอบด้วยEGTA, DTT 1 มม.และ 1 มม. PMSF 1 มม. และมี centrifuged แล้วที่ g 15000 สำหรับ 20 นาที ส่วนลงตัว (1 ml) ของ supernatant ผลลัพธ์อยู่ในหลอด และตกตะกอน ด้วยอะซีโตนที่ประกอบด้วย10% TCA และ 0.07% b-mercaptoethanol การส่งผลตัวอย่างโปรตีนได้รับอนุญาตให้ค้างคืน precipitate ที่ 20 C และแล้ว centrifuged ที่ g 20000 สำหรับ 25 นาที เม็ดถูกสาม rinsedเวลา ด้วยอะซีโตนเย็นประกอบด้วย 0.07% b-mercaptoethanol และสามารถยืนที่ 20 C สำหรับ 1 h สุดท้าย เม็ดโปรตีนถูก airdriedและใช้สำหรับ electrophoresis เจล 2 มิติ (2-DE)5.3. เดอ 2Isoelectric เน้น (IEF) มีดำเนินการตามวิธีของดันแคนและ Hershey [37] เม็ดโปรตีนแห้งได้rehydrated urea rehydration บัฟเฟอร์ 7 M, 2 M thiourea, 4% 3-[(3-dimethylammonio cholanidopropyl)] -1-propanesulfonic กรด (พร้อมv) 40 มม. DTT, 0.5% (v/v) หาบัฟเฟอร์ pH ไล่ระดับสี (IPG) 4e7และ 0.01% (w/v) bromophenol blue ระดับโปรตีนถูก quantifiedตามวิธีแบรดฟอร์ด [38] IPG แถบของ 4e-fe กลไกปี่ไม่เชิงเส้น7 (13 ซม.) ถูกโหลด ด้วย 250 ml ของโปรตีนตัวอย่างประกอบด้วย800 มิลลิกรัมโปรตีนในถาด rehydration สำหรับ h 12e16 ห้องอุณหภูมิ ต่อ rehydration แถบ IPG ถูกเรียกใช้บนIPGphor เป็น Ettan 3 (GE แพทย์ สหรัฐอเมริกา) มีแรงดันไฟฟ้าสำหรับ IEFตั้ง 200 V สำหรับ h 1 ตาม ด้วย 500 V สำหรับ h 1, 1000 V สำหรับ 1 h3000 V สำหรับ 30 นาที 5000 V สำหรับ 30 นาที การไล่ระดับสี 8000 V สำหรับ30 นาที และความเร็ว 8000 V ถึงจำนวน 35000 V hมีรักษาอุณหภูมิของเซลล์ที่ 20 C มากที่สุดปัจจุบัน 50 mA ต่อแถบ หลังจากเรียกใช้มิติแรก IEFแถบที่ equilibrated สำหรับ 15 นาทีด้วยบัฟเฟอร์ DTT 10 mlประกอบด้วยยูเรีย 6 M กลีเซอร SDS 2%, 30% (v/v) 1% (w/v) DTT และ50 มม. TriseHCl (pH 8.8) แล้ว ด้วยบัฟเฟอร์ iodoacetamideกับ iodoacetamide 2.5% (w/v) แทน DTT 15 นาทีแบบสองมิติ SDS polyacrylamide เจ electrophoresisได้ดำเนินการในทำงานเจ (Hoefer SE600 รูมาตรฐานระบบแนวตั้ง GE สุขภาพ 12.5% polyacrylamide) ดังที่โดย Laemmli [39] แถบถูกฝังอยู่บน SDSgelแล้ว ปิดผนึกโดยใช้ 1% หลอมละลาย agarose โซลูชัน Electrophoresisได้ดำเนินการใน 15 mA ต่อเจจนกระทั่ง bromophenolย้อมสีฟ้าด้านล่างของเจแล้ว มี visualized โปรตีนจุดใช้ R Coomassie Brilliant Blue (CBB) -2505.4 การภาพที่วิเคราะห์ข้อมูลและเจเดอ 2 ถูกสแกนที่ 300 dpi ใช้ III สแกนเนอร์ภาพ(GE สุขภาพ) รูปภาพดิจิทัลได้วิเคราะห์ ด้วย Imagemaster2D แพลตตินั่มรุ่น 5.0 (GE สุขภาพ) อย่างน้อยสามเจจากทรีตเมนท์ในสามการทดลองด้วยตนเองได้ใช้สำหรับการวิเคราะห์ ปลดปล่อยก๊าซของถูก quantified โดยบนไดรฟ์ข้อมูลของญาติ ซึ่งถูกกำหนด โดยอัตราส่วนของการปริมาณของจุดเดียวการตั้งค่าทั้งหมดของจุด เฉพาะจุดด้วย(เชิงปริมาณน้อย 1.5-fold เปลี่ยนแปลงสำคัญ) และจำลองเปลี่ยนแปลงเหมือนกับสามมีหูสำหรับรเมทใช้สำหรับทดสอบ t ของนักเรียนกับระดับนัยสำคัญ 95%วิเคราะห์ทางสถิติของการเจ เฉพาะจุดแสดงการทางสถิติความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในความอุดมสมบูรณ์ของโปรตีนระหว่างการรักษาได้ถือเป็นจุดแสดง differentially5.5 รหัสโปรตีนจุดที่โปรตีนถูก excised จากสี CBB polyacrylamide preparativeเจ ระบุโปรตีนใช้ MS MALDI-TOF/TOFโดย Ultraflex II โดยรวมสเปกโตรมิเตอร์ (Bruker Daltonics เบรเมน เยอรมนี)เป็นก่อนหน้านี้อธิบาย [40] รายการโดยรวมเพปไทด์ได้ใช้ในการค้นหาฐานข้อมูล genomics แตงกวา (ของ http://cucumber.genomics.org.cn ที่) กับ MOWSE การค้นหาพารามิเตอร์เกณฑ์ดัง: โปรตีนสำคัญ MOWSE คะแนนที่ p < 0.05ความแม่นยำโดยรวมต่ำสุด 100 ppm ทริปซินเป็นเอนไซม์ 1 พลาดเว็บไซต์ปริ cysteine carbamidomethylation อะคริลาไมด์ในการปรับเปลี่ยนcysteine ออกซิเดชัน methionine ปี่ ญาติโมเลกุลคล้ายคลึงครอบคลุมมวลระบุ และต่ำสุดลำดับ 15%5.6 ประเภทหน้าที่ของโปรตีนโปรตีน differentially แสดงมีหน้าที่จัดตามการทำงานของโทรศัพท์มือถือ คลัสเตอร์ลำดับของโปรตีนรูปแบบนิพจน์ถูกดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์คลัสเตอร์เวอร์ชัน 3.0 ป้อนข้อมูลถูกคำนวณ โดยการหารปี%ของแต่ละโปรตีนที่จุดที่ความเครียดเกลือและรักษา Spd %ในปีเดียวกันโปรตีนที่จุดควบคุมและล็อก 2 แปลง เชื่อมโยงที่สมบูรณ์เปิดใช้งานอัลกอริทึม และผลลัพธ์มี visualized โดย Treeviewซอฟต์แวร์เวอร์ชัน 1.60B. Li et al

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

5. วัสดุและวิธีการ
5.1 วัสดุพืชและการรักษาแตงกวา (Cucumis sativus L.cv. Jinchun ฉบับที่ 2) เมล็ดงอกบนกระดาษกรองชื้นในที่มืดวันที่28 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 ชั่วโมงแล้วหว่านในถาดพลาสติก(41? 41? 5 ซม.) ที่มีทราย และเพาะเลี้ยงในเรือนกระจกที่25e30 C (วัน) และ 15e18 C (คืน) ภายใต้แสงธรรมชาติที่มีความชื้นสัมพัทธ์ 60e75% เมื่อใบเลี้ยงได้ขยายต้นกล้าถูกที่มาพร้อมกับน้ำที่มีครึ่งหนึ่งแรงสารละลายHoagland ของ หลังจากที่พัฒนาเต็มรูปแบบของทั้งสองใบสิบสองต้นกล้าขนาดสม่ำเสมอได้รับการปลูกถ่ายลงในแต่ละสามภาชนะพลาสติก(51? 33? 20 ซม.) ซึ่งเต็มไปด้วยความแข็งแรงเต็ม Hoagland ของสารละลายธาตุอาหารและการต่ออายุทุก3 วัน โซลูชั่นสารอาหารที่ถูกเก็บไว้ที่ 20e25 C และมวลเบาอย่างต่อเนื่องโดยใช้อากาศปั๊มในช่วงเวลา20 นาทีในการรักษาปริมาณออกซิเจนละลายน้ำที่8.0? 0.2 มิลลิกรัม L1. หลังจาก 3 d ของวัฒนธรรมก่อนต้นกล้าแตงกวาได้รับการรักษาเป็นดังนี้1) CK พืชควบคุมปลูกในสารละลาย Hoagland ของ; 2) พัฒนาพืชที่ปลูกในสารละลาย Hoagland และใบถูกพ่นด้วย1 มิลลิ Spd; 3) S, พืชที่ปลูกใน Hoagland ของการแก้ปัญหาที่มี75 มิลลิโซเดียมคลอไรด์; และ 4) เอสเอสพืชปลูกในการแก้ปัญหาHoagland ที่ประกอบด้วย 75 mM NaCl ใบถูกพ่นด้วย1 มิลลิ Spd ใบของการควบคุมและเกลือที่ได้รับพืชฉีดพ่นด้วยน้ำกลั่น Tween-20 (0.5% v / v) ถูกนำมาใช้เป็นแรงตึงผิว ใบถูกพ่นด้วย Spd และน้ำกลั่นในชีวิตประจำวันเวลา18:00 น ต่อไปนี้ 3 วันของการรักษาใบที่สามขยายตัวได้เต็มที่เก็บเกี่ยวแช่แข็งทันทีในไนโตรเจนเหลวและเก็บไว้ที่80 องศาเซลเซียสจนดำเนินการต่อไปสำหรับการสกัดโปรตีน. 5.2 การสกัดโปรตีนสกัดโปรตีนที่ได้ดำเนินการตามที่มีการปรับเปลี่ยนรุ่นของวิธีการHurkman เมื่อ [36] ตัวอย่างออก (1e2 กรัมสดน้ำหนัก) มาบดในครกกับไนโตรเจนเหลว พื้นดินตัวอย่างที่ถูกระงับใน 30 มิลลิ TriseHCl (pH 8.7) ที่มี 1 มิลลิ EGTA 1 มิลลิ DTT และ 1 มิลลิ PMSF แล้วถูกหมุนเหวี่ยงที่15,000 กรัมเป็นเวลา 20 นาที หาร (1 ml) ของสารละลายที่เกิดถูกนำมาวางลงในหลอดและตกตะกอนด้วยอะซิโตนที่มีTCA 10% และ 0.07% B-mercaptoethanol ส่งผลให้กลุ่มตัวอย่างโปรตีนได้รับอนุญาตให้เกิดการตกตะกอนในชั่วข้ามคืนที่ 20 ซีและปั่นแล้วที่20,000 กรัมเป็นเวลา 25 นาที เม็ดได้รับการล้างสามครั้งด้วยอะซิโตนเย็นที่มี 0.07% B-mercaptoethanol และได้รับอนุญาตให้อยู่ที่20 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมง สุดท้ายเม็ดโปรตีนที่ถูก airdried และใช้สำหรับข่าวคราว 2 มิติ (2-DE). 5.3 2-DE Isoelectric มุ่งเน้น (IEF) ได้ดำเนินการตามวิธีการของดันแคนและเฮอร์ชีย์[37] เม็ดโปรตีนแห้งคืนรูปในบัฟเฟอร์คืน 7 M ยูเรีย 2 M thiourea, 4% 3 - [(3 cholanidopropyl) dimethylammonio] กรด -1-propanesulfonic (w / v) มี 40 มิลลิ DTT, 0.5% (ปริมาตร / ปริมาตร ) ลาดตรึงค่า pH (IPG) 4e7 บัฟเฟอร์และ0.01% (w / v) bromophenol สีฟ้า ระดับโปรตีนที่ถูกวัดตามวิธีแบรดฟอ [38] แถบ IPG ของพี่ไม่เชิงเส้น 4e 7 (13 ซม.) ได้รับการเต็มไปด้วย 250 มล. ของกลุ่มตัวอย่างที่มีโปรตีนโปรตีน800 มก. ในถาดคืนสำหรับ 12e16 ชั่วโมงที่ห้องอุณหภูมิ ต่อไปนี้การคืน, แถบ IPG วิ่งบนEttan IPGphor 3 (GE Healthcare, สหรัฐอเมริกา) แรงดันไฟฟ้าสำหรับ IEF ที่ถูกตั้งไว้ที่200 V เป็นเวลา 1 ชั่วโมงตามด้วย 500 V เป็นเวลา 1 ชั่วโมง, 1000 V เป็นเวลา 1 ชั่วโมง, 3000 V 30 นาที, 5000 V 30 นาทีลาด 8000 V สำหรับ30 นาทีและ 8000 V อย่างรวดเร็ว มุ่งเน้นถึงทั้งหมด 35,000 V ชม. อุณหภูมิของเซลล์ที่ได้รับการเก็บรักษาไว้ที่ 20 องศาและมีสูงสุดในปัจจุบันของ50 mA ต่อแถบ หลังจากทำงานมิติแรก IEF แถบถูก equilibrated นาน 15 นาทีกับ 10 มล. บัฟเฟอร์ DTT ที่มี 6 M ยูเรีย 30% (v / v) กลีเซอรอล, 2% SDS, 1% (w / v) DTT และ50 มิลลิ TriseHCl (pH 8.8) และแล้วด้วย iodoacetamide buffer 2.5% (w / v) iodoacetamide แทน DTT เป็นเวลา 15 นาที. ที่สองมิติข่าวคราว SDS-polyacrylamide ได้ดำเนินการในการทำงานเจล (Hoefer SE600 ทับทิมมาตรฐานระบบแนวตั้งGE Healthcare; 12.5% อะคริเลต) ตามที่อธิบายไว้โดยLaemmli [39] แถบถูกฝังอยู่บนด้านบนของ SDSgel แล้วปิดผนึกโดยใช้สารละลาย 1% agarose หลอมเหลว electrophoresis ได้ดำเนินการที่ 15 มิลลิแอมป์ต่อเจลจนกว่า bromophenol ย้อมสีฟ้ามาถึงด้านล่างของเจล จุดโปรตีนที่ถูกมองเห็นโดยใช้ Coomassie สดใสฟ้า (CBB) R-250. 5.4 ภาพและการวิเคราะห์ข้อมูล2 DE เจลถูกสแกนที่ 300 dpi โดยใช้ภาพสแกนเนอร์ที่สาม(GE Healthcare) ภาพดิจิตอลถูกวิเคราะห์ด้วย Imagemaster รุ่นแพลทินัม 2D 5.0 (GE Healthcare) อย่างน้อยสามเจลจากการรักษาในแต่ละการทดลองสามอิสระถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์ ความเข้มของจุดที่ถูกวัดตามกับปริมาณญาติของพวกเขาซึ่งถูกกำหนดโดยอัตราส่วนของปริมาณของจุดเดียวทั้งชุดของจุด จุดเท่านั้นที่มีอย่างมีนัยสำคัญ (อย่างน้อย 1.5 เท่าการเปลี่ยนแปลงเชิงปริมาณ) และสามารถทำซ้ำเปลี่ยนแปลงในสามซ้ำถูกหยิบขึ้นมาสำหรับมวลสาร. นักเรียน t-test ที่มีระดับความสำคัญของ 95% ถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติของเจล เฉพาะจุดแสดงสถิติความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในความอุดมสมบูรณ์ของโปรตีนระหว่างการรักษาได้รับการพิจารณาให้เป็นจุดแสดงออกแตกต่างกัน. 5.5 การระบุโปรตีนจุดโปรตีนที่ถูกตัดจาก CBB สีอะคริเลตเตรียมเจล โปรตีนที่ถูกระบุโดยใช้ MALDI-TOF / TOF MS โดย UltraFlex II สเปกโตรมิเตอร์มวล (Bruker Daltonics เบรเมนเยอรมนี) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [40] รายการมวลเปปไทด์ที่เกิดถูกนำมาใช้ในการค้นหาฐานข้อมูลจีโนมิกแตงกวา (http: // cucumber.genomics.org.cn) ที่มีพารามิเตอร์การค้นหา MOWSE หลักเกณฑ์ดังต่อไปนี้คะแนนโปรตีน MOWSE อย่างมีนัยสำคัญที่ p <0.05, ความถูกต้องของมวลขั้นต่ำ 100 ppm, trypsin เป็นเอนไซม์ 1 พลาดเว็บไซต์แตกแยกcarbamidomethylation cysteine, ริลาไมด์ที่ปรับเปลี่ยนcysteine ​​ออกซิเดชัน methionine, ความคล้ายคลึงกันของ pI โมเลกุลญาติมวลและความคุ้มครองที่ระบุลำดับขั้นต่ำ15%. 5.6 การจัดหมวดหมู่การทำงานของโปรตีนโปรตีนที่แสดงออกแตกต่างกันได้รับการทำงานจำแนกตามฟังก์ชั่นมือถือของตน การจัดกลุ่มตามลำดับชั้นของโปรตีนรูปแบบการแสดงออกที่ถูกดำเนินการโดยใช้ซอฟแวร์คลัสเตอร์รุ่น3.0 การป้อนข้อมูลที่คำนวณโดยการหารฉบับ % ของแต่ละจุดโปรตีนเกลือความเครียดและการรักษาSpd โดยปริมาตร % ของเดียวกันจุดโปรตีนที่ควบคุมและเข้าสู่ระบบ2 เปลี่ยน การเชื่อมต่อที่สมบูรณ์แบบขั้นตอนวิธีการที่ถูกเปิดใช้งานและผลการมองเห็นโดย Treeview ซอฟต์แวร์รุ่น 1.60. บี Li et al,

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

5 . วัสดุและวิธีการ
5.1 วัสดุพืชและการรักษา
แตงกวา ( ต้นแตงกวา l.cv . jinchun หมายเลข 2 ) เมล็ดงอก
บนกระดาษกรองชื้นในที่มืดที่ 28 C 30 H ,
เพาะลงในถาดพลาสติก ( 41  41  5 ซม. ) บรรจุทรายควอตซ์ และเพาะเลี้ยงในเรือนกระจกที่ 25e30
C ( วัน ) และ 15e18 C ( กลางคืน )
ภายใต้แสงธรรมชาติกับความชื้นสัมพัทธ์ ของ 60e75 % เมื่อ
การแสดงออกขยายกล้าถูกรดด้วยน้ำผสมครึ่งหนึ่งแรงโฮกเลิน
ของสารอาหาร . หลังจากการพัฒนาเต็มสองใบ ต้นกล้ามีขนาดสิบสองของเครื่องแบบ
ปลูกถ่ายในแต่ละสามภาชนะพลาสติก
( 51  33  20 ซม. ) ซึ่งเต็มไปด้วยเต็มแรงโฮกเลินของ
สารละลายธาตุอาหาร และต่ออายุทุก ๆ 3 วัน โซลูชั่นสารอาหาร
ถูกเก็บไว้ที่ 20e25 C และมีอย่างต่อเนื่องการใช้อากาศ
ปั๊มในช่วง 20 นาทีเพื่อรักษาปริมาณออกซิเจนที่ละลายในน้ำ  0.2 มก. L1

.
หลังจาก 3 D ของวัฒนธรรมก่อน แตงกวาต้นกล้าถูกถือว่าเป็น
1 ) CK , พืชที่ปลูกในสารละลายโฮกเลินควบคุม ; 2 )
CS , พืชปลูกในโฮกเลินของโซลูชั่น และใบ
พ่นด้วย SPD 1 มม. 3 ) ได้พืชที่ปลูกในสารละลายที่มีเกลือ
โฮกเลินของ 75 มิลลิเมตร และ 4 ) SS , พืชปลูกในสารละลายที่มีเกลือ
โฮกเลิน 75 มม. ใบเป็น
พ่นด้วย SPD 1 มิลลิเมตร ใบของพืชที่ได้รับการควบคุมและเกลือ
ถูกพ่นด้วยน้ำกลั่น tween-20 ( 0.5 % v / v )
ใช้เป็นสารลดแรงตึงผิว ใบที่ถูกพ่นด้วย SPD และ
น้ำกลั่นทุกวันที่ 18 : 00 .ดังต่อไปนี้ 3 วันของการรักษา ,
3 ใบเต็มที่ระยะเก็บแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวทันที
เก็บไว้ที่อุณหภูมิ 80 องศาเซลเซียส จนกว่าจะมีการประมวลผลสำหรับการสกัดโปรตีน
.
. . การสกัดโปรตีนโปรตีนสกัดได้ปฏิบัติตาม

แก้ไขรุ่นของวิธีการ hurkman [ 36 ] จากตัวอย่าง ( 1e2 กรัมน้ำหนักสด
) มาบดในครกด้วยไนโตรเจนเหลว พื้นดิน
ตัวอย่างที่ถูกระงับใน 30 มม. trisehcl ( pH 8.7 ) ที่มีหน่วย
1 มิลลิเมตร 1 มม. และ 1 mM DTT PMSF และจากนั้นถูกไฟฟ้า
ที่ 15 , 000 G 20 นาทีส่วนลงตัว ( 1 มล. ) ของผลสูง
ถูกวางไว้เป็นหลอดและตกตะกอนด้วยอะซีโตนที่มี
TCA 10% และ 0.07 % b-mercaptoethanol . ส่งผลให้ตกตะกอนโปรตีนตัวอย่าง

แล้วค้างคืนที่ 20 องศาเซลเซียส และระดับที่ 20000 กรัมเป็นเวลา 25 นาที เม็ดถูกล้างสามครั้งด้วยอะซีโทนเย็นที่มี

b-mercaptoethanol 0.07 % และได้รับอนุญาตให้อยู่ที่ 20 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ในที่สุด โปรตีนเม็ดเป็น airdried
และใช้สำหรับโครงร่าง gel electrophoresis ( แผ่น )
5.3 . แผ่น
Isoelectric สำ ( IEF ) ได้ปฏิบัติตาม
วิธีดันแคนและ เฮอร์ชีย์ [ 37 ] โปรตีนเม็ดคือ
แห้งได้ทำการ รีไฮเดรทมในบัฟเฟอร์ยูเรียศึกษา 7 เมตร , 2 เมตร Thiourea , 4 % [ 3 - ( 3 -
cholanidopropyl ) dimethylammonio ] - 1-propanesulfonic กรด ( w /
V ) 20 40 มม. 0.5 เปอร์เซ็นต์ ( v / v ) ตรึงลาด ( IPG ) บัฟเฟอร์ pH 4e7
และ 0.01 % ( w / v ) โบรโมฟีนสีฟ้า ระดับโปรตีนถูก quantified
เป็นไปตามแบรดฟอร์ดวิธี [ 38 ] IPG แถบเส้นปี่ 4E
7 ( 13 ซม. ) ถูกโหลด ด้วยโปรตีนตัวอย่างที่มี
250 ml .800 มิลลิกรัมโปรตีนในถาด เพื่อศึกษา 12e16 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง

ตามศึกษา , IPG แถบถูกใช้เป็น ettan ipgphor
3 ( GE Healthcare , USA ) แรงดันไฟฟ้าสำหรับบทสรุปคือ
ตั้งไว้ที่ 200 V เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ตามด้วย 500 V 1 H , 1000 V 1 H ,
3 V สำหรับ 30 นาที 5 V สำหรับ 30 นาที ไล่ระดับ 8 v
30 นาที และ 8 , 000 V อย่างรวดเร็วมุ่งเน้นถึงทั้งหมด 35 , 000 V
hเซลล์ไว้ที่ 20 องศาเซลเซียส อุณหภูมิสูงสุด
ปัจจุบัน 50 มาต่อแถบ หลังจากวิ่ง มิติแรก แถบ IEF
ถูก equilibrated 15 นาทีกับ 10 มล. 20
6 M ยูเรียที่มีบัฟเฟอร์ 30 เปอร์เซ็นต์ ( v / v ) กลีเซอรอล 2% SDS , 1% ( w / v ) และ 50 mM DTT
trisehcl ( พีเอช 8.8 ) และหลังจากนั้น iodoacetamide บัฟเฟอร์
2.5 % ( w / v ) iodoacetamide แทน
DTT เป็นเวลา 15 นาทีมิติที่สอง SDS polyacrylamide gel electrophoresis พบว่าเมื่อใช้เจล
( โฮเฟอร์ se600 ทับทิมมาตรฐาน
แนวตั้งระบบ GE Healthcare ; 12.5% polyacrylamide ) ตามที่อธิบายไว้โดย laemmli
[ 39 ] ถูกฝังอยู่ในแถบด้านบนของ sdsgel
และปิดผนึกแล้วใช้ 1% สารละลายเหลว , . อิเล็กโตรโฟรีซิส
ถูกหามออกจากที่ 15 มาต่อเจล
จนกว่าโบรโมฟีนสีย้อมสีฟ้าถึงด้านล่างของเจล โปรตีนเหล่านี้น่าจะเป็นจุดรับ
ใช้ Brilliant Blue ( cbb ) r-250 .
5.4 . รูปภาพและข้อมูลการวิเคราะห์
แผ่นเจลถูกสแกนที่ 300 dpi ใช้สแกนเนอร์ 3
( GE Healthcare ) ดิจิทัลภาพวิเคราะห์ด้วย imagemaster
2d แพลทินัมรุ่น 5.0 ( GE Healthcare ) อย่างน้อยสาม
เจลจากการรักษาในแต่ละสามการทดลองที่เป็นอิสระ
ใช้สำหรับการวิเคราะห์ มีความเข้มของจุดมีปริมาณตาม
ปริมาณสัมพัทธ์ของพวกเขาซึ่งถูกกำหนดจากอัตราส่วนของ
ปริมาณจุดเดียวทั้งชุดของจุด จุดเดียว
ที่สำคัญ ( อย่างน้อย 1.5-fold ปริมาณการเปลี่ยนแปลง ) และการเปลี่ยนแปลง )
3 ซ้ำถูกเลือกสำหรับ
แมสสเปกโทรเมตรีนักเรียนกลุ่มที่มีระดับนัยสำคัญ 95% ใช้
การวิเคราะห์ทางสถิติของเจล เฉพาะจุดที่แสดงความแตกต่างระหว่างการรักษาโปรตีนมากมาย

ถือว่าเป็นจุดที่แสดงออกแตกต่างกัน .
5.5 . โปรตีนโปรตีนที่ถูกตัดจากปอ

= cbb เปื้อนอะคริลาไมด์เจลโปรตีนที่ถูกระบุว่าใช้ maldi-tof / tof MS
โดย ultraflex II แมสสเปกโตรมิเตอร์ ( บรูกเกอร์ ดอลโทนิก เบรเมน , เยอรมัน ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้
[ 40 ] เปปไทด์ที่เกิดมวลรายการเพื่อใช้ในการค้นหา
แตงกวาฐานข้อมูล ( http : / /
แตงกวา จีโนมิกส์ . org cn ) กับ mowse ค้นหาพารามิเตอร์
เกณฑ์ดังนี้ คะแนน mowse โปรตีน อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติที่ p < 0.05 ,
ขั้นต่ำมวลความถูกต้อง 100 ส่วนในล้านส่วนเป็นเอนไซม์เอนไซม์ 1 พลาด
แยกออกเว็บไซต์ , 8-12 carbamidomethylation อะคริลาไมด์ ดัดแปลงกรดอะมิโนเมทไธโอนีน
, ออกซิเดชัน , ความเหมือนของพายที่มวลโมเลกุล
ญาติระบุและครอบคลุมลำดับอย่างน้อย 15 %
6 . โปรตีนแบ่งตามหน้าที่

ถูกแสดงออกแตกต่างกันโปรตีนการทำงานจำแนกตามฟังก์ชันมือถือของตน การจัดกลุ่มลำดับชั้นของโปรตีน
รูปแบบการแสดงออกโดยใช้กลุ่มซอฟต์แวร์
รุ่น 3.0 ข้อมูลถูกคำนวณโดยการหารแต่ละเล่มที่ %
โปรตีนจุดที่ความเครียดและการรักษาด้วยเกลือ SPD . % ของเดียวกัน
โปรตีนจุดที่ควบคุมและบันทึก 2 แปลง วิธีเปิดใช้งานและเชื่อม
สมบูรณ์ ผลลัพธ์ที่ได้มองเห็นด้วยเพลง
ซอฟแวร์รุ่น 1.60 Li et al .
B