Method 1. Approximately 25mg of sam

Method 1. Approximately 25mg of sample were transferred
aseptically into a sterile tube with 10 glass beads (1·5mmdiameter) and 600 ml of lysis buffer L6 (Boom etal. 1990)
which contains guanidium thiocyanate. The tube was mixed
briefly and placed in a 37°C water-bath for 3h 30min. Lysis
was completed by leaving the tube overnight on a low speed
shaker at room temperature. The tube was centrifuged for
3min at 13 000 g and the supernate removed into a fresh
tube. A 10% (w/v) diatom (Sigma) suspension was prepared
in 50% (v/v) HCl and water. This was autoclaved and 40 ml
of diatom suspension were added to the supernate which was
mixed and left at room temperature overnight.
After re-mixing, the suspension was re-centrifuged for
3min and the supernate collected and processed by a modified
protocol for the PuregeneTM (Flowgen Instruments Ltd,
Lichfield, UK) DNA extraction kit. After incubation with
RNAse, the sample tube was chilled. Protein precipitation
solution (200 ml) was added to the tube which was vortexmixed
for 20s and centrifuged for 3min at 13 000 g. The
supernate was added to 600 ml isopropanol at –20°C. The
tube was inverted 50 times, chilled, spun for 3min and the
supernate discarded. Ethanol (70% v/v), pre-cooled to
–20°C, was added (600 ml), the contents were mixed by
inversion and centrifuged for 2min at 13 000 g. The tube was
drained on clean, absorbent paper and dried in a 56°C heating
block. DNA hydration solution (100 ml) was added to the
sample tube, which was left at room temperature overnight.
The sample was stored at –20°C until use.
Method 2. A demineralization solution consisting of 100 ml
0·5mol l−1 EDTA at pH8·0 plus proteinase K (1mgml−1
)
was dispensed into a sterile 1·5ml tube containing glass beads.
Approximately 25mg of sample were added, and the tube was
mixed on a mini bead beater and incubated at 56°C overnight.
Lysis buffer L6 (250 ml) was added, the tube was mixed
briefly and incubated at 37°C for 2h. After re-mixing, the
tube was centrifuged for 1min at 13 000 g and the supernate
collected into another sterile tube. Silica suspension (12%
SiO2 w/v, pH2·0) kindly donated by Dr Mark Thomas,
Department of Biological Sciences, UCL, was added (25 ml),
and the tube was mixed and gently shaken for 2h to allow
cell lysis and adsorption of DNA to the silica.
The tube was re-mixed, centrifuged for 1min at 13 000 g and
the supernate discarded. The silica was washed with 100 ml
washing buffer L2 (Boom etal. 1990), twice with 70% (v/v)
ethanol at –20°C, and once with acetone at –20°C. The tube
was drained on clean, absorbent paper and dried in a 56°C
heating block. DNA was eluted with 50 ml ultra-pure water
(Sigma) and incubation at 56°C for 30min. This was repeated
once, and the eluates were pooled and stored at –20°C.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Method 1. Approximately 25mg of sample were transferredaseptically into a sterile tube with 10 glass beads (1·5mmdiameter) and 600 ml of lysis buffer L6 (Boom etal. 1990)which contains guanidium thiocyanate. The tube was mixedbriefly and placed in a 37°C water-bath for 3h 30min. Lysiswas completed by leaving the tube overnight on a low speedshaker at room temperature. The tube was centrifuged for3min at 13 000 g and the supernate removed into a freshtube. A 10% (w/v) diatom (Sigma) suspension was preparedin 50% (v/v) HCl and water. This was autoclaved and 40 mlof diatom suspension were added to the supernate which wasmixed and left at room temperature overnight.After re-mixing, the suspension was re-centrifuged for3min and the supernate collected and processed by a modifiedprotocol for the PuregeneTM (Flowgen Instruments Ltd,Lichfield, UK) DNA extraction kit. After incubation withRNAse, the sample tube was chilled. Protein precipitationsolution (200 ml) was added to the tube which was vortexmixedfor 20s and centrifuged for 3min at 13 000 g. Thesupernate was added to 600 ml isopropanol at –20°C. Thetube was inverted 50 times, chilled, spun for 3min and thesupernate discarded. Ethanol (70% v/v), pre-cooled to–20°C, was added (600 ml), the contents were mixed byinversion and centrifuged for 2min at 13 000 g. The tube wasdrained on clean, absorbent paper and dried in a 56°C heatingบล็อก โซลูชันความชุ่มชื้นดีเอ็นเอ (100 มล.) ถูกเพิ่มไปตัวอย่างหลอด ซึ่งถูกทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องข้ามคืนตัวอย่างถูกเก็บไว้ที่ 20 ° C จนกว่าจะใช้วิธีที่ 2 การแก้ไขปัญหาวัดที่ประกอบด้วย 100 มล.EDTA l−1 0·5mol pH8·0 บวก proteinase K (1mgml−1)ถูกจ่ายเข้าไปในหลอดฆ่าเชื้อ 1·5ml ที่ประกอบด้วยลูกปัดแก้วเพิ่มตัวอย่างประมาณ 25 มก. และก็หลอดผสมในการตีลูกปัดขนาดเล็ก และได้รับการกกที่ 56° C ค้างคืนLysis บัฟเฟอร์ L6 เพิ่ม (250 มล) หลอดถูกผสมสั้น ๆ และรับการกกที่ 37° C เป็นเวลา 2 ชม. หลังการผสม การหลอดถูกจาก 1 นาทีก. 13 000 และ supernateรวบรวมลงในหลอดที่ปลอดเชื้ออื่น ซิลิการะงับ (12%SiO2 w/v, pH2·0) กรุณาบริจาค โดยดร. Mark Thomasกรมวิทยาศาสตร์ชีวภาพ UCL เพิ่ม (25 มิลลิลิตร),และหลอดผสม และเขย่าเบา ๆ สำหรับ 2 ชม.เพื่อให้เซลล์ lysis และดูดซับของดีเอ็นเอกับซิลิกาหลอดถูกผสมอีกครั้ง จาก 1 นาทีที่ 13 000 กรัม และsupernate ถูกละทิ้ง ซิลิกาถูกล้าง ด้วย 100 มล.ล้างบัฟเฟอร์ L2 (บูม etal. 1990), สองเท่ากับ 70% (v/v)เอทานอลที่ 20 ° C และหนึ่งครั้ง ด้วยอะซีโตนที่ –20 องศาเซลเซียส หลอดระบายบนกระดาษดูดซับ สะอาด และแห้งใน 56° Cเครื่องทำความร้อนบล็อก ดีเอ็นเอเป็น eluted น้ำบริสุทธิ์สูง 50 มล.(Sigma) และบ่มที่ 56° C 30 นาที เสร็จสมบูรณ์ครั้งหนึ่ง eluates การพู และถูกเก็บไว้ที่ –20 องศาเซลเซียส

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วิธีที่ 1 ประมาณ 25mg ของกลุ่มตัวอย่างมีการถ่ายโอน
ปลอดเชื้อลงในหลอดผ่านการฆ่าเชื้อด้วยลูกปัดแก้ว 10 (1 · 5mmdiameter) และ 600 มล. ของ L6 สลายบัฟเฟอร์ (บูม Etal. 1990)
ซึ่งมี thiocyanate guanidium หลอดผสม
ในเวลาสั้น ๆ และวางไว้ในอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสน้ำอาบน้ำสำหรับ 3h 30min สลาย
เสร็จสมบูรณ์โดยออกจากหลอดค้างคืนในความเร็วต่ำ
ปั่นที่อุณหภูมิห้อง หลอดถูกหมุนเหวี่ยงสำหรับ
3 นาทีที่ 13 000 กรัมและ supernate ออกเป็นสด
หลอด 10% (w / v) ไดอะตอม (ซิกม่า) ระงับถูกจัดทำขึ้น
ใน 50% (v / v) HCl และน้ำ นี้ได้รับการนึ่งฆ่าเชื้อและ 40 มล.
ของการระงับไดอะตอมที่ถูกเพิ่มเข้า supernate ที่ถูก
ผสมและทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องในชั่วข้ามคืน.
อีกครั้งหลังจากผสมระงับเป็นอีกครั้งที่หมุนเหวี่ยงสำหรับ
3min และ supernate ที่เก็บรวบรวมและประมวลผลโดยการปรับเปลี่ยน
โปรโตคอลสำหรับ PuregeneTM (Flowgen ตราสาร Ltd,
ลิชสหราชอาณาจักร) ชุดสกัดดีเอ็นเอ หลังจากการบ่มด้วย
RNase หลอดตัวอย่างเป็นแช่เย็น โปรตีนเร่งรัด
การแก้ปัญหา (200 มล.) ถูกบันทึกอยู่ในท่อซึ่ง vortexmixed
สำหรับยุค 20 และหมุนเหวี่ยงสำหรับ 3 นาทีที่ 13 000 กรัม
supernate ถูกบันทึกอยู่ใน 600 มล. isopropanol ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส
หลอดถูกคว่ำ 50 ครั้งแช่เย็นปั่น 3min และ
supernate ทิ้ง เอทานอล (70% v / v) ก่อนที่จะระบายความร้อนด้วย
-20 ° C เสริม (600 มล.) เนื้อหาถูกผสมโดย
ผกผันและหมุนเหวี่ยงสำหรับ 2min ที่ 13 000 กรัม หลอดได้รับการ
ระบายน้ำในการทำความสะอาด, กระดาษดูดซับและแห้งใน 56 ° C ร้อน
บล็อก วิธีการแก้ปัญหาดีเอ็นเอชุ่มชื้น (100 มล.) ถูกเพิ่มลงใน
หลอดตัวอย่างซึ่งถูกทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องในชั่วข้ามคืน.
กลุ่มตัวอย่างที่ได้รับการจัดเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสจนการใช้งาน.
วิธีที่ 2 วิธีการแก้ปัญหา demineralization ประกอบด้วย 100 มล.
0 · 5mol L-1 EDTA ที่ PH8 · 0 บวกโปร K (1mgml-1
)
ได้รับการจ่ายเป็นหมัน 1 ·หลอด 5ml มีลูกปัดแก้ว.
ประมาณ 25mg ของกลุ่มตัวอย่างมีการเพิ่มและหลอดถูก
ผสมลูกปัดชนะขนาดเล็กและบ่มที่อุณหภูมิ 56 องศาเซลเซียสในชั่วข้ามคืน .
สลายบัฟเฟอร์ L6 (250 มล.) ได้รับการเพิ่มหลอดถูกผสม
ในเวลาสั้น ๆ และบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 ชั่วโมง อีกครั้งหลังจากการผสมใน
หลอดถูกหมุนเหวี่ยงสำหรับ 1min ที่ 13 000 กรัมและ supernate
เก็บเข้าหลอดฆ่าเชื้ออีก ซิลิการะงับ (12%
SiO2 w / v, PH2 · 0) บริจาคกรุณาโดยดรมาร์คโทมัส,
ภาควิชาวิทยาศาสตร์ชีวภาพยูซีแอลได้รับการเพิ่ม (25 มล.)
และหลอดถูกผสมและเขย่าเบา ๆ 2H จะอนุญาตให้
สลายของเซลล์และ การดูดซับของดีเอ็นเอซิลิกา.
หลอดเป็นอีกครั้งที่ผสมหมุนเหวี่ยงสำหรับ 1min ที่ 13 000 กรัมและ
supernate ทิ้ง ซิลิกาถูกล้างด้วย 100 มล.
ซักผ้าบัฟเฟอร์ L2 (บูม Etal. 1990) เป็นครั้งที่สอง 70% (v / v)
เอทานอลที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสและเมื่อด้วยอะซิโตนที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส หลอด
ได้ถูกระบายออกในการทำความสะอาด, กระดาษดูดซับและแห้งใน 56 ° C
ร้อนบล็อก ดีเอ็นเอชะ 50 มล. น้ำบริสุทธิ์
(ซิกม่า) และการบ่มที่ 56 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที นี้ซ้ำ
ครั้งและ eluates ถูกรวบรวมและจัดเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วิธีที่ 1 . ประมาณ 25mg ตัวอย่างถูกย้ายaseptically เป็นหลอดฆ่าเชื้อด้วย 10 ลูกปัดแก้ว ( 1 5mmdiameter ด้วย ) และ 600 มิลลิลิตร การสลายบัฟเฟอร์ l6 บูมคณะ . 1990 )ซึ่งประกอบด้วย guanidium ไทโอไซยาเนต . หลอดผสมสั้น ๆและวางไว้ใน 37 ° C 3H ผลิตน้ำอาบ 30 นาทีเสร็จจากหลอดข้ามคืนในความเร็วต่ำเขย่าที่อุณหภูมิห้อง หลอดมันระดับสำหรับ3min 13 000 กรัมและ supernate ลบออกเป็นสดหลอด 10% ( w / v ) ไดอะตอม ( Sigma ) ระงับได้เตรียมไว้50 เปอร์เซ็นต์ ( v / v ) HCl และน้ำ นี้ถูกสังเคราะห์และ 40 มิลลิลิตรจากการเพิ่มการ supernate ซึ่งเป็นผสมทิ้งไว้ที่อุณหภูมิคืนห้องหลัง re ผสมถูกระงับอีกระดับสำหรับ3min และ supernate รวบรวมและประมวลผล โดยดัดแปลงพิธีสารเพื่อ puregenetm ( flowgen เครื่องมือจำกัดLichfield , สหราชอาณาจักร ) ชุดสกัดดีเอ็นเอ หลังจากบ่มเพาะด้วยเลส , ตัวอย่างท่อเย็น การตกตะกอนโปรตีนวิธีแก้ปัญหา ( 200 ml ) ถูกเพิ่มลงในท่อซึ่ง vortexmixedสำหรับ 20 และระดับ 3min 13 000 G สำหรับsupernate เพิ่ม 600 มิลลิลิตรและไอโซโพรพานอลที่ 20 องศา C .หลอดเป็นแบบ 50 ครั้ง เย็นปั่นสำหรับ 3min และsupernate ทิ้ง เอทานอล ( 70 % v / v ) ก่อนไปแช่เย็น- 20 ° C , เพิ่ม ( 600 มล. ) เนื้อหาถูกผสมโดยไฟฟ้าสำหรับการ 2min 13 000 กรัม หลอด คือระบายบนกระดาษแห้งและสะอาด ดูดซับความร้อน 56 ° C ในบล็อก โซลูชั่นชุ่มชื้น DNA ( 100 ml ) ก็เพิ่มไปหลอดตัวอย่างซึ่งถูกทิ้งไว้ที่อุณหภูมิคืนห้องตัวอย่างที่ 20 ° C ( เก็บไว้จนใช้วิธีที่ 2 เป็นแร่ธาตุที่ประกอบด้วยสารละลาย 100 มิลลิลิตร0 ด้วย 5mol L − 1 EDTA ที่ ph8 ด้วย 0 K ( − 1 1mgml โปรพลัส)คือจ่ายเป็นหมันด้วย ก 1 หลอดบรรจุลูกปัดแก้วประมาณ 25mg ตัวอย่างถูกเพิ่มและท่อผสมกับมินิลูกปัดตีบ่มที่ 56 ° C ในชั่วข้ามคืนการสลายบัฟเฟอร์ l6 ( 250 ml ) คือการเพิ่มหลอดผสมสั้นและบ่มที่ 37 ° C ที่เพิ่มขึ้น หลังจากอีกครั้งผสม ,ท่อไฟฟ้าสำหรับ 1 นาทีที่ 13 000 กรัมและ supernateเก็บไปอีกผ่านหลอด ซิลิการะงับ ( 12 เปอร์เซ็นต์SiO2 W / V , PH2 ด้วย 0 ) กรุณาบริจาคโดยดร. มาร์คโธมัสภาควิชาวิทยาศาสตร์ชีวภาพ , UCL , เพิ่ม ( 25 ml . )และท่อผสม และค่อย ๆเขย่าสำหรับ 2H ให้การสลายเซลล์และการดูดซับของดีเอ็นเอ กับซิลิกาหลอดมันอีกครั้งผสม , ไฟฟ้าสำหรับ 1 นาทีที่ 13 000 กรัมการ supernate ทิ้ง ซิลิก้า ซัก 100 มล.ล้างบัฟเฟอร์ L2 ( บูมคณะ . 1990 ) , สองครั้ง 70 เปอร์เซ็นต์ ( v / v )เอทานอลที่– 20 ° C และเมื่อด้วยอะซีโตนที่ - 20 องศา ท่อถูกระบายบนกระดาษแห้งสะอาด ดูดซับและ 56 ° C ในป้องกันความร้อน ดีเอ็นเอตัวอย่างด้วยน้ำบริสุทธิ์สูง 50 มล.( Sigma ) และบ่มที่ 56 ° C เป็นเวลา 30 นาที นี้ซ้ำครั้งหนึ่ง และ eluates ถูก pooled และเก็บไว้ที่ - 20 องศา