2. Materials and methods2.1. Materi

2. Materials and methods
2.1. Materials
Ciprofloxacin (Content≥98.5%) was purchased from Zhejiang
Guobang Pharmaceutical Co., while bovine serum albumin (BSA),
ovalbumin (OVA), and peroxidase horseradish (HPR) were obtained
from Dingguo biotechnology. The 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)-
carbodiimide (EDC, purity≥99.3%) was from Shanghai Yanchang
Biochemical Technology and 3,3′. 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB),
HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG, RPMI 1640, hypoxanthine
aminopterin thymidine (HAT) medium, calf serum clarified, incomplete
Freund's adjuvant (IFA) and complete Freund's adjuvant (CFA)
were purchased from Sigma Chemical (St. Louis, MO, USA). Chemical
reagents, such as sodium chloride, potassium chloride, sulfuric acid,
and dipotassium hydrogen phosphate were from Shanghai Guoyao
Chemical Reagent Co. The mouse monoclonal antibody isotyping
reagents were purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). The fish
samples of Carassius auratus, Oreochromis niloticus, Ictalurus punctatus,
Scophthalmus maximus, Eriocheir sinensis, Penaeus vannamei, Macrobrachium
rosenbergii, Trionyx sinensis, and Oncorhynchus mykiss were
obtained from a commercial farm in the suburbs of Shanghai, China.
2.2. Generation of mAbs against ciprofloxacin
The conjugates of CPFX-BSA and CPFX-OVA were prepared using a
modified Carbodiimide method, as previously described (Huang et al.,
2008), and characterized by spectrophotometer absorption, electrophoresis,
and mass spectra. Briefly, a total of 8 mg BSA, 20 mg CPFX
and 240 mg EDC were mixed in 4 ml PBS (pH 5.0, 0.01 mol/l) at 28 °C
for 2 h. The mixture was dialyzed against 200 volumes of PBS (pH 5.0,
0.01 mol/l) for two days. The conjugates were lyophilized and stored
at −80 °C. Similarly, the conjugate of CPFX-OVA was generated.
The mAbs were generated by a similar procedure described
previously (Wang et al., 2007). Briefly, individual Balb/c mice from
the Second Military Medical University were immunized with 200 μg
of CPFX-BSA (dissolved in 0.01 mol/l PBS pH 7.4) in 50% CFA and
boosted with the same amount of antigen in 50% IFA for three times.
Subsequently, blood samples were obtained from individual mice for
measuring the CPFX-specific antibodies. After the antibodies titers
reached 1:60,000, the mice were sacrificed and their spleen cells were
fused with SP2/0 myeloma cells, followed by screening the hybridomas
using the indirect ELISA. Furthermore, the hybridoma cells were
injected into Balb/c mice for the induction of ascites and mAb in the
ascites was purified using a 5 ml protein G sepharose-4B fast flow
column, according to the manufacturer's instruction (Beijing Search
Biotech, Beijing). In addition, the subclass of the mAb was determined
using the mouse monoclonal antibody isotyping reagents and its
affinity was measured, as described previously (Zhou et al., 2009). The
cross-reactivity of anti-CPFX mAb toward quinolone analogues and
antibiotics were assessed (Holtzapple et al., 1997). The experimental
protocols were approved by the Animal Research Protection Committee
of Shanghai Ocean University.
2.3. Immunodiffusion
The glass-plates were poured with 3 ml 1% agar and punched with
holes. Subsequently, the central holes were loaded with antiserum
(1:20) while the peripheral holes were added with single antigen of
CPFX-OVA or OVA, respectively, followed by incubating at 37 °C for
24 h. The precipitated antigen/antibody complex was considered as
positive for immunodiffusion assay.
2.4. Sample preparation and extraction technique
The commercial C. auratus, O. niloticus, I. punctatus, S. maximus, E.
sinensis, P. vannamei, M. rosenbergii, T. sinensis and O. mykiss
(5.0 g/sample) were sampled in triplicate and placed into polypropylene
centrifuge tubes. The fish samples were mixed with the
extraction solution (30 ml) of 1 M HCl–acetonitrile (4/500, v/v). After
being vortexed for 5 min and centrifuged at 495 g and 4 °C for 15 min,
the supernatants were collected and the residue was re-extracted
with the same procedures again, followed by centrifuging. Subsequently,
the supernatants were harvested, loaded on a separatory
funnel, and mixed with n-hexane (25 ml). After shaking vigorously for
5 min and then static settlement for 5 min, the aqueous layer was
removed and the organic layer was evaporated for the dryness of the
residues using a vortex evaporator. The resulting residues were
dissolved in 1.0 ml of extraction solution and filtered through 0.45 μm
disposable syringe filter equipped with cellulose acetate membranes.
2.5. Indirect competitive ELISA
The CPFX residues in the fish samples were detected using the
mAb-based ic-ELISA, as described previously (Watanabe et al., 2002).
Briefly, 150 ng of CPFX-OVA in 100 μl of PBS (0.01 mol/l, pH 7.4 were
added into each well of the ELISA plates (Dingguo Biotechnology,
Shanghai, China) and incubated at 37 °C for 1 h. After washing for
three times with 250 μl washing solution (0.01 mol/l PBS, pH 7.4,
containing 0.5% Tween 20, PBST), the wells were blocked with 1% BSA
in PBST overnight at 4 °C. After washing, 50 μl of standard CPFX at
different concentrations was first mixed with 50 μl of anti-CPFX mAb
(1:15,000) and the mixture was then added in triplicate to each well,
followed by incubation at 37 °C for 1 h. Individual wells with PBST
alone or with anti-CPFX mAb alone were used as negative controls for
the background reading in ic-ELISA. Subsequently, the plates were
washed and the bound mAb was probed with HRP-goat anti-mouse
sera (1/6000 in PBST) at 37 °C for 0.5 h. The bound HRP-second
antibodies were detected with the substrate of 100 μl of TMB liquid
substrate (1 ml TMB(1.5 mg):5 ml of H2O2(0.03%):4 ml of 0.2 M NaAc
pH 5.3) for 10 min, and the enzymatic reactions were terminated by
the addition of 2 mol/l sulfuric acid (50 μl per well), followed by
reading absorbance at 450 nm in a microplate reader. Standard curves
were obtained by plotting absorbance against the logarithm of CPFX
concentrations, which were fitted to a four-parameter logistic
equation: y= (D−A)/[1+ (x/C)B
]+A, where A is the minimum
absorbance at infinite concentration, B is the curve slope at the
inflection point, C is the concentration of IC50, and D is the maximum
absorbance in the absence of CPFX. The limit of detection (LOD) was
calculated as the method, as described by Wang et al. (2007).
The CPFX residues in the prepared samples were also determined
by HPLC using the procedure, similar to that of Tang et al. (2006).
2.6. Recovery rate and relative standard deviation of the assay
The CPFX standard solution was prepared by mixing CPFX with the
metrices of individual fish, as described previously (Duan and Yuan,
2001). Briefly, mixing CPFX with the matrices of fish at different ratios
(50 ng/g, 600 ng/g and 1250 ng/g) respectively, the CPFX residues in
the mixture were extracted, as described above. The amount of CPFX
residues in the filtrates was assayed by ic-ELISA and HPLC. The
recovery rate and relative standard deviation (RSD) were calculated
according to the following equations:
Re cov eryð Þ % = Measured value
The oretical value × 100%;

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. วัสดุCiprofloxacin (Content≥98.5%) ถูกซื้อจากเจ้อเจียงGuobang เภสัชกรรม Co. ในขณะที่วัว serum albumin (บีเอสเอ),รับ ovalbumin (OVA), และ peroxidase horseradish (HPR)จากเทคโนโลยีชีวภาพ Dingguo 1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC, purity≥99.3%) ได้จากเซี่ยงไฮ้หยานเทคโนโลยีชีวเคมีและ 3, 3′ 5, 5′-tetramethylbenzidine (ทหารไทย),Hypoxanthine IgG, RPMI 1640 ป้องกันกระต่ายแพะ HRP กลวงaminopterin thymidine (หาดใหญ่) ขนาดกลาง ลูกเซรั่มใส สมบูรณ์ประเมินของ Freund (IFA) และประเมินของ Freund สมบูรณ์ (CFA)ซื้อจากซิกเคมี (St. Louis, MO สหรัฐอเมริกา) สารเคมีreagents โซเดียมคลอไรด์ โปแตสเซียมคลอไรด์ กรดกำมะถันและ dipotassium ไฮโดรเจนฟอสเฟตจากเซี่ยงไฮ้ Guoyaoรีเอเจนต์เคมี จำกัด Isotyping แอนติบอดี monoclonal เมาส์reagents ถูกซื้อจาก Invitrogen (คาร์ลส CA, USA) ปลาตัวอย่างของ auratus สกุลปลาทอง ปลานิล Ictalurus punctatusScophthalmus maximus, Eriocheir sinensis กุลากุ้งกุลา กุ้งก้ามกราม Trionyx sinensis และสกุลปลาแซลมอนแปซิฟิก mykissได้รับจากฟาร์มเพื่อการค้าในตัวเมืองเซี่ยงไฮ้ จีน2.2. สร้าง mAbs ต่อ ciprofloxacinConjugates ของบีเอสเอ CPFX และ CPFX OVA ได้อาหารโดยการปรับเปลี่ยนวิธีการ Carbodiimide อธิบายไว้ก่อนหน้านี้เป็น (หวง et al.,2008), และโดยดูดซึมเครื่องทดสอบกรดด่าง electrophoresisและมวลแรมสเป็คตรา สั้น ๆ จำนวน 8 mg บีเอสเอ 20 mg CPFXและ 240 มิลลิกรัม EDC ถูกผสมใน 4 ml PBS (pH 5.0, 0.01 โมล/l) ที่ 28 ° Cสำหรับ 2 h ส่วนผสมคือ dialyzed กับ PBS (pH 5.0 ปริมาณ 2000.01 โมล/ลิตร) สองวัน Lyophilized และเก็บไว้ conjugatesที่ −80 องศาเซลเซียส ในทำนองเดียวกัน ค่าสังยุคของ CPFX OVA ถูกสร้างขึ้นMAbs ที่สร้างขึ้น โดยอธิบายขั้นตอนคล้ายคลึงกันก่อนหน้านี้ (วัง et al., 2007) สั้น ๆ แต่ละหนู Balb/c จากมหาวิทยาลัยการแพทย์ทหารสองที่ immunized กับ 200 μgCPFX-บีเอสเอ (ละลายใน 0.01 โมล/l PBS pH 7.4) 50% ของ CFA และเพิ่มขึ้น ด้วยจำนวนเดียวกันตรวจหาใน 50% IFA ครั้งที่สามในเวลาต่อมา ได้รับตัวอย่างเลือดจากหนูแต่ละสำหรับวัดแอนตี้ CPFX เฉพาะ หลังจากแอนตี้ titersถึง 1:60, 000 เมาส์ได้เสียสละ และมีเซลล์ม้ามพร้อม SP2/0 เซลล์ myeloma ตาม ด้วยการตรวจคัดกรอง hybridomasใช้ ELISA ทางอ้อม นอกจากนี้ ถูกเซลล์ hybridomaฉีดเข้าไปในหนู Balb/c การเหนี่ยวนำของท้องมานและมาบในการท้องมานที่บริสุทธิ์ใช้ 5 มล.โปรตีน G sepharose 4B รวดเร็วขั้นตอนการคอลัมน์ ตามคำแนะนำของผู้ผลิต (ปักกิ่งค้นหาเทคโนโลยีชีวภาพ ปักกิ่ง) นอกจากนี้ ย่อยของมาบที่กำหนดใช้เมาส์ monoclonal แอนติบอดี isotyping reagents และความสัมพันธ์ถูกวัด ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (โจว et al., 2009) ที่cross-reactivity CPFX ต้านมาบไปทาง analogues ควิโนโลน และยาปฏิชีวนะที่ได้จากการประเมิน (Holtzapple และ al., 1997) การทดลองโปรโตคอลได้รับการอนุมัติ โดยคณะกรรมการป้องกันการวิจัยสัตว์เซี่ยงไฮ้โอเชี่ยนมหาวิทยาลัย2.3. ImmunodiffusionPoured กับ agar 1% 3 ml และเจาะรูด้วยแผ่นแก้วหลุม ในเวลาต่อมา หลุมกลางถูกโหลด ด้วย antiserum(1:20) ในขณะที่มีเพิ่มหลุมต่อพ่วงกับตรวจหาเดียวของCPFX OVA หรือ OVA ตามลำดับ ตาม incubating ที่ 37 ° C สำหรับ24 ชม การ precipitated ตรวจหา/แอนติบอดีซับซ้อนถูกถือว่าเป็นค่าบวกสำหรับการทดสอบ immunodiffusion2.4 การตัวอย่างเตรียมและการสกัดเทคนิคAuratus C. พาณิชย์ โอ niloticus, I. punctatus, S. maximus อีsinensis, P. vannamei ก้ามกรามเมตร ต. sinensis และโอ mykiss(5.0 g/ตัว อย่าง) ได้ตัวอย่างใน triplicate และอยู่ในโพรพิลีนเครื่องหมุนเหวี่ยงท่อ ตัวอย่างปลาที่ผสมกับการแยกโซลูชั่น (30 ml) ของ 1 M HCl – acetonitrile (4/500, v/v) หลังจากกำลัง vortexed ใน 5 นาที และ centrifuged 495 g และ 4 ° C สำหรับ 15 นาทีsupernatants ถูกเก็บรวบรวม และสารตกค้างถูกแยกอีกครั้งเดียวกันตามขั้นตอนอีกครั้ง ตาม centrifuging ในเวลาต่อมาsupernatants ได้เก็บเกี่ยวผลผลิต โหลดในตัว separatoryกรวย และผสมกับเอ็นเฮกเซน (25 มล.) หลังจากเขย่าสำหรับโยคะ5 นาทีและการชำระเงินที่คงที่แล้วสำหรับ 5 นาที มีชั้นอควีเอาออก และชั้นอินทรีย์ถูกหายไปในความแห้งกร้านของตกใช้ vortex evaporator ตกค้างเกิดขึ้นได้ละลายใน 1.0 ml ของสกัด และกรองผ่าน 0.45 μmมีสารเซลลูโลส acetate กรองทิ้งเข็ม2.5. อ้อมแข่งขัน ELISAตรวจพบตกค้างในตัวอย่างปลา CPFX ใช้ในตามมาบ ic-ELISA อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (วะตะนะเบะและ al., 2002)สั้น ๆ 150 ng ของ CPFX OVA ใน μl 100 ของ PBS (0.01 โมล/l ค่า pH 7.4 ได้เพิ่มเข้าไปในแต่ละดีแผ่น ELISA (เทคโนโลยีชีวภาพ Dingguoเซี่ยงไฮ้ จีน) และ incubated ที่ 37 ° C สำหรับ 1 h หลังจากซักผ้าสำหรับครั้งที่สามกับโซลูชันการล้าง μl 250 (0.01 โมล/l PBS, pH 7.4ประกอบด้วย 0.5% Tween 20, PBST), บ่อที่ถูกบล็อก ด้วย 1% บีเอสเอใน PBST ค้างคืนที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจากซักผ้า 50 μl ของ CPFX มาตรฐานที่ความเข้มข้นแตกต่างกันก่อนผสมกับ μl 50 ของมาบ CPFX ต่อต้าน(1:15, 000) และส่วนผสมถูกเพิ่มใน triplicate ไปดีละตาม ด้วยการบ่มที่ 37 ° C สำหรับ 1 h. แต่ละบ่อ มี PBSTใช้คนเดียว หรือ กับมาบ CPFX ป้องกันเพียงอย่างเดียวเป็นการควบคุมค่าลบพื้นหลังอ่านใน ic-ELISA ในเวลาต่อมา แผ่นได้ล้าง และมาบผูกถูกพิสูจน์ ด้วยเมาส์ป้องกันแพะ HRPนโยบาย (1/6000 ใน PBST) ที่ 37 ° C สำหรับ 0.5 h ผูก HRP วินาทีแอนตี้พบกับพื้นผิวของ μl 100 ของทหารไทยเหลวพื้นผิว (1 ml TMB(1.5 mg):5 มลของมล H2O2(0.03%):4 ของ 0.2 M NaAcpH ที่ 5.3) สำหรับ 10 นาที และปฏิกิริยาเอนไซม์ในระบบถูกยกเลิกโดยการเพิ่มของกรดซัลฟิวริก โมล/l 2 (50 μl ต่อดี), ตามด้วยอ่าน absorbance ที่ 450 nm ใน microplate อ่าน เส้นโค้งมาตรฐานได้รับ โดยการพล็อต absorbance กับลอการิทึมของ CPFXความเข้มข้น ซึ่งถูกติดตั้งให้ 4 พารามิเตอร์โลจิสติกสมการ: y = (D−A) / [1 + (x / C) B] + A ต่ำสุดคือabsorbance ที่ความเข้มข้นอนันต์ B เป็นความชันของเส้นโค้งในการการผันคำจุด C คือ ความเข้มข้นของ IC50 และ D คือ สูงสุดabsorbance ของ CPFX มีขีดจำกัดของการตรวจสอบ (ลอด)คำนวณเป็นวิธี ตามที่อธิบายไว้โดย Wang et al. (2007)นอกจากนี้ยังได้กำหนดตก CPFX ในตัวอย่างที่เตรียมไว้โดย HPLC ใช้ขั้นตอน คล้ายกับที่ของถัง et al. (2006)2.6 การกู้คืนอัตราและค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ์ของการทดสอบสารละลายมาตรฐานของ CPFX ถูกเตรียม โดยผสม CPFX ด้วยการmetrices ของปลาแต่ละตัว อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (ด้วนและหยวน2001) กันสั้น ๆ ผสม CPFX ด้วยเมทริกซ์ของปลาในอัตราส่วนที่แตกต่างกัน(50 ng/g, 600 ng g และ 1250 ng/g) ตามลำดับ ตก CPFX ในส่วนผสมที่สกัด ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น จำนวน CPFXตกค้างใน filtrates ถูก assayed ic ELISA และ HPLC ที่คำนวณอัตราการกู้คืนและค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ์ (RSD)ตามสมการต่อไปนี้:กลับ cov eryð Þ% =ค่าที่วัดการ oretical ค่าลอก 100%

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 วัสดุ
Ciprofloxacin (Content≥98.5%) ซื้อมาจากเจ้อเจียง
Guobang บริษัท ยา, เซรั่มอัลบูมิในขณะที่วัว (BSA)
ovalbumin (OVA) และมะรุม peroxidase (HPR) ที่ได้รับ
จากเทคโนโลยีชีวภาพ Dingguo 1-Ethyl-3 (dimethylaminopropyl) -
carbodiimide (EDC, purity≥99.3%) มาจากเซี่ยงไฮ้ Yanchang
เทคโนโลยีชีวเคมีและ 3,3 ' 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)
HRP-ผันแพะ IgG ต่อต้านกระต่าย RPMI 1640 hypoxanthine
thymidine aminopterin (HAT) กลาง, เซรั่มน่องชี้แจงไม่สมบูรณ์
แบบเสริม Freund ของ (IFA) และแบบเสริมที่สมบูรณ์ของ Freund (CFA)
ที่ซื้อมาจาก ซิกเคมี (เซนต์หลุยส์สหรัฐอเมริกา) เคมี
สารเคมีเช่นโซเดียมคลอไรด์, โพแทสเซียมคลอไรด์, กรดกำมะถัน
และฟอสเฟต dipotassium ไฮโดรเจนมาจากเซี่ยงไฮ้ Guoyao
สารเคมี จำกัด แอนติบอดีเมาส์ isotyping
น้ำยาที่ซื้อมาจาก Invitrogen (คาร์ลส, CA, USA) ปลา
ตัวอย่าง Carassius auratus, ปลานิล, Ictalurus punctatus,
Scophthalmus สังฆ, Eriocheir sinensis, Penaeus vannamei, Macrobrachium
rosenbergii, Trionyx เนซิสและ Oncorhynchus mykiss ถูก
ที่ได้จากฟาร์มเชิงพาณิชย์ในเขตชานเมืองของเซี่ยงไฮ้, จีน.
2.2 การสร้างโคลนกับ ciprofloxacin
conjugates ของ CPFX-BSA และ CPFX-พหูพจน์ถูกจัดทำโดยใช้
วิธีการ carbodiimide แก้ไขตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Huang et al.,
2008) และที่โดดเด่นด้วยการดูดซึม spectrophotometer, อิ,
และสเปกตรัมมวล สั้น ๆ ทั้งหมด 8 มก. บีเอสเอ 20 มิลลิกรัม CPFX
และ 240 มิลลิกรัม EDC ถูกผสมใน 4 มล. พีบีเอส (pH 5.0 0.01 โมล / ลิตร) วันที่ 28 องศาเซลเซียส
เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ส่วนผสมที่ถูก dialyzed กับ 200 เล่มของพีบีเอส (pH 5.0
0.01 โมล / ลิตร) เป็นเวลาสองวัน conjugates ถูกแห้งและเก็บไว้
ที่ -80 องศาเซลเซียส ในทำนองเดียวกันผันของ CPFX-พหูพจน์ถูกสร้างขึ้น.
โคลนที่ถูกสร้างขึ้นโดยขั้นตอนที่คล้ายกันอธิบายไว้
ก่อนหน้านี้ (Wang et al., 2007) สั้น ๆ , บุคคล Balb / C หนูจาก
สองมหาวิทยาลัยการแพทย์ทหารได้รับวัคซีนกับ 200 ไมโครกรัม
ของ CPFX-BSA (ละลายใน 0.01 โมล / ลิตรค่า pH 7.4 พีบีเอส) ในเอฟ 50% และ
เพิ่มขึ้นด้วยจำนวนเดียวกันของแอนติเจนใน 50% ที่ปรึกษาทางการเงินสำหรับ สามครั้ง.
ต่อจากนั้นตัวอย่างเลือดที่ได้รับจากบุคคลสำหรับหนู
วัดแอนติบอดี CPFX เฉพาะ หลังจากแอนติบอดี titers
ถึง 1: 60,000 หนูได้เสียสละและเซลล์ม้ามของพวกเขาถูก
ผสมกับ SP2 / 0 เซลล์ myeloma ตามด้วยการตรวจคัดกรองไฮบริ
ใช้วิธี ELISA ทางอ้อม นอกจากนี้เซลล์ไฮบริที่ถูก
ฉีดเข้าไปใน Balb / C หนูสำหรับการเหนี่ยวนำของน้ำในช่องท้องและ mAb ใน
น้ำในช่องท้องบริสุทธิ์โดยใช้ขนาด 5 ml โปรตีน G-Sepharose 4B ไหลเร็ว
คอลัมน์ตามคำแนะนำของผู้ผลิต (ปักกิ่งค้นหา
ไบโอเทค, ปักกิ่ง) นอกจากนี้รองของ mAb ถูกกำหนด
โดยใช้แอนติบอดีเมาส์ isotyping สารเคมีและของ
ความสัมพันธ์ของวัดตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (โจว et al., 2009)
ปฏิกิริยาข้ามของการต่อต้าน CPFX mAb มีต่อ analogues quinolone และ
ยาปฏิชีวนะที่ถูกประเมิน (Holtzapple et al., 1997) ทดลอง
โปรโตคอลได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการคุ้มครองวิจัยสัตว์
เซี่ยงไฮ้ Ocean University.
2.3 immunodiffusion
กระจกแผ่นถูกเท 3 มล. วุ้น 1% และมีเจาะ
หลุม ต่อจากนั้นหลุมกลางได้รับเต็มไปด้วย antiserum
(01:20) ในขณะที่หลุมต่อพ่วงถูกเพิ่มเข้ามาด้วยแอนติเจนเดียวของ
CPFX-ไข่หรือไข่ตามลำดับตามด้วยการบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา
24 ชั่วโมง ตกตะกอนแอนติเจน / แอนติบอดีที่ซับซ้อนได้รับการพิจารณาเป็น
เชิงบวกสำหรับการทดสอบ immunodiffusion.
2.4 การเตรียมสารตัวอย่างและเทคนิคการสกัด
พาณิชย์ C. auratus ทุมนิล, punctatus I. เอสสังฆอี
เนซิสพีกุ้งขาว, M. rosenbergii ตเนซิสและโอ mykiss
(5.0 กรัม / ตัวอย่าง) เป็นตัวอย่าง ในเพิ่มขึ้นสามเท่าและโพรพิลีนอยู่ใน
หลอดหมุนเหวี่ยง ตัวอย่างปลาผสมกับ
วิธีการแก้ปัญหาการสกัด (30 มล.) 1 M HCl-acetonitrile (4/500, v / v) หลังจาก
ถูกการ vortex เวลา 5 นาทีและหมุนเหวี่ยงที่ 495 กรัมและ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 นาที,
supernatants ถูกเก็บรวบรวมและสารตกค้างเป็นอีกครั้งที่สกัด
ด้วยวิธีการเดียวกันอีกครั้งตามด้วยการเหวี่ยง ต่อมา
supernatants เก็บเกี่ยว, โหลดบน separatory
ช่องทางและผสมกับเฮกเซน (25 มล.) หลังจากที่สั่นสะท้านสำหรับ
5 นาทีและการตั้งถิ่นฐานแบบคงที่แล้วเป็นเวลา 5 นาที, ชั้นน้ำที่ถูก
ลบออกและชั้นอินทรีย์ระเหยถูกสำหรับแห้งกร้านของ
สารตกค้างที่ใช้ระเหยน้ำวน ตกค้างส่งผลให้ถูก
กลืนหายไปใน 1.0 มล. ของการแก้ปัญหาการสกัดและการกรองผ่าน 0.45 ไมครอน
กรองเข็มฉีดยาที่ใช้แล้วทิ้งพร้อมกับเยื่อเซลลูโลสอะซิเตท.
2.5 วิธี ELISA แข่งขันทางอ้อม
CPFX ตกค้างในตัวอย่างปลาที่ถูกตรวจพบโดยใช้
mAb ตาม IC-ELISA ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Watanabe et al., 2002).
สั้น ๆ , 150 นาโนกรัมของ CPFX-พหูพจน์ใน 100 ไมโครลิตรของพีบีเอส (0.01 โมล / ลิตรค่า pH 7.4 ที่ถูก
เพิ่มเข้าไปในแต่ละดีของแผ่นวิธี ELISA (Dingguo เทคโนโลยีชีวภาพ,
เซี่ยงไฮ้, จีน) และบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชม. หลังจากล้างสำหรับ
สามครั้ง 250 ไมโครลิตรแก้ปัญหาซักผ้า (0.01 โมล / ลิตรพีบีเอสพีเอช 7.4 ,
ที่มี 0.5% Tween 20 PBST) หลุมถูกบล็อกกับบีเอสเอ 1%
ใน PBST ค้างคืนที่ 4 องศาเซลเซียส. หลังจากล้าง 50 ไมโครลิตรของ CPFX มาตรฐานที่
มีความเข้มข้นแตกต่างกันเป็นครั้งแรกที่ผสมกับ 50 ไมโครลิตรของการต่อต้าน CPFX mAb
(1 : 15,000 บาท) และส่วนผสมที่ถูกเพิ่มเข้ามาแล้วเพิ่มขึ้นสามเท่าในแต่ละดี
. ตามด้วยการบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมงหลุมบุคคลที่มี PBST
คนเดียวหรือกับการต่อต้าน CPFX mAb คนเดียวถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบสำหรับ
พื้นหลังการอ่านใน ic- วิธี ELISA. ต่อแผ่นที่ถูก
ล้างและผูกพัน mAb ได้รับการตรวจสอบกับ HRP-แพะต่อต้านเมาส์
ซีรั่ม (1/6000 ใน PBST) ที่ 37 ° C เป็นเวลา 0.5 ชม. ผูกพัน HRP สอง
แอนติบอดีพบกับพื้นผิว 100 ไมโครลิตรทหารไทยของเหลว
พื้นผิว (1 มล. ทหารไทย (1.5 มก.): 5 มิลลิลิตร H2O2 (0.03%): 4 มล. 0.2 M NAAC
ค่า pH 5.3) เป็นเวลา 10 นาทีและปฏิกิริยาของเอนไซม์ถูกยกเลิกโดย
นอกเหนือจาก 2 โมล / ลิตร กรดกำมะถัน (50 ไมโครลิตรต่อกัน) ตามด้วย
การอ่านการดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตรในเครื่องอ่าน microplate เส้นโค้งมาตรฐาน
ที่ได้รับจากการวางแผนการดูดกลืนแสงกับลอการิทึมของ CPFX
ความเข้มข้นซึ่งถูกติดตั้งกับสี่พารามิเตอร์โลจิสติก
สม: Y = (D-A) / [1+ (x / C) B
] + ซึ่งเป็น ขั้นต่ำ
การดูดกลืนแสงที่มีความเข้มข้นที่ไม่มีที่สิ้นสุด, B เป็นเส้นโค้งลาดชันที่
จุดโรคติดเชื้อ, C คือความเข้มข้นของ IC50 และ D เป็นสูงสุด
การดูดกลืนแสงในกรณีที่ไม่มี CPFX ขีด จำกัด ของการตรวจสอบ (LOD) ก็
เป็นวิธีการคำนวณตามที่อธิบายไว้โดย Wang et al, (2007).
CPFX ตกค้างในตัวอย่างที่เตรียมไว้ยังได้รับการพิจารณา
โดยวิธี HPLC โดยใช้ขั้นตอนคล้ายกับที่ของอัล Tang et (2006).
2.6 อัตราการกู้คืนและค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ์ของการทดสอบ
CPFX สารละลายมาตรฐานถูกจัดทำขึ้นโดยการผสมกับ CPFX
metrices ของปลาแต่ละบุคคลตามที่ระบุไว้ก่อนหน้านี้ (ด้วนและหยวน
2001) สั้น ๆ ผสม CPFX กับการฝึกอบรมของปลาในอัตราส่วนที่แตกต่างกัน
(50 นาโนกรัม / กรัม 600 นาโนกรัม / กรัมและ 1,250 ng / g) ตามลำดับตกค้าง CPFX ใน
ส่วนผสมสกัดตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ปริมาณของ CPFX
ตกค้างใน filtrates ได้รับการวิเคราะห์โดย IC-ELISA และ HPLC
อัตราการกู้คืนและค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ์ (RSD) จะถูกคำนวณ
ตามสมการต่อไปนี้:
เรื่อง COV eryðÞ% = ค่าที่วัดได้
ค่า oretical × 100%;

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . วัสดุ
ซิโปรฟลอกซาซิน ( เนื้อหา≥ 98.5 % ) ซื้อมาจาก Zhejiang
guobang เภสัชกรรม Co . , ในขณะที่อัลบูมิน ( BSA )
โอวัลบูมิน ( OVA ) และเอนไซม์มะรุม ( สูง ) ที่ได้รับจากเทคโนโลยีชีวภาพ dingguo
. การ 1-ethyl-3 - ( dimethylaminopropyl ) -
carbodiimide ( EDC , ความบริสุทธิ์≥ 99.3 % ) คือจากเซี่ยงไฮ้ yanchang
ชีวเคมีเทคโนโลยี และสำหรับพวกเขา . 55 ’ - tetramethylbenzidine ( TMB )
HRP และ IgG anti กระต่ายแพะ RPMI 1640 ไฮโปแซนทีน
เร่งรีบเพียง ( หมวก ) กลางลูกวัว , เซรั่มกระจ่าง ไม่ครบ
Freund เป็นผู้ช่วย ( IFA ) และสมบูรณ์ Freund เป็นผู้ช่วย ( CFA )
ซื้อมาจาก Sigma เคมี ( St . Louis , MO , USA ) เคมี
สารเคมี เช่น โซเดียม คลอไรด์ , โพแทสเซียมคลอไรด์ , กรดซัลฟูริค
ไดไฮโดรเจนฟอสเฟต และสารเคมีจากเซี่ยงไฮ้ guoyao
.
isotyping เมาส์โมโนโคลนอล แอนติบอดี เพื่อซื้อจาก Invitrogen ( Carlsbad , CA , USA ) ปลา
ตัวอย่าง Carassius auratus นิล punctatus ictalurus , , ,
scophthalmus แม็กซิมัส eriocheir ไซแนนซิส Penaeus vannamei , Macrobrachium rosenbergii , trionyx ไซแนนซิส
, ,คอรินชัส mykiss เป็นและที่ได้จากฟาร์ม
เชิงพาณิชย์ในเขตชานเมืองของเซี่ยงไฮ้
2.2 . การผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อซิโปรฟลอกซาซินและสารประกอบของ cpfx-bsa

แก้ไข cpfx-ova เตรียมใช้วิธี carbodiimide ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( Huang et al . ,
) ) และลักษณะ absorption spectrophotometer electrophoresis
, และมวลสเปกตรัม . สั้น ๆ รวม 8 ประเทศมิลลิกรัม
cpfx 20 มก. และ 240 EDC มก. ผสม 4 ml PBS ( pH 5.0 , 0.01 mol / L ) ที่ 28 ° C
2 H . ส่วนผสมที่ผ่านกับ 200 เล่มของ PBS ( pH 5.0 ,
0.01 โมลต่อลิตร ) เป็นเวลา 2 วัน ซึ่งเป็นสารประกอบโปรตีนและเก็บไว้
ที่− 80 องศา เช่นเดียวกัน คือ cpfx-ova ถูกสร้างขึ้น ซึ่งถูกสร้างขึ้นโดย

ก่อนหน้านี้อธิบายขั้นตอนที่คล้ายกัน ( Wang et al . , 2007 ) สั้น ๆส่วนตัวหนูสายพันธุ์ Balb / C
2 จากมหาวิทยาลัยการแพทย์ทหารถูกฉีดกระตุ้นด้วย 200 μ g
ของ cpfx-bsa ( ละลายใน 0.01 โมลต่อลิตร PBS pH 7.4 ) ใน CFA 50%
เพิ่มขึ้นด้วยจำนวนเดียวกันของแอนติเจนใน 50% ไอ 3 ครั้ง
ในภายหลัง ตัวอย่างเลือดที่ได้จากหนูที่บุคคลสำหรับ
วัด cpfx แอนติบอดีที่เฉพาะเจาะจง . หลังจากแอนติบอดีโดย 1:60000
ถึง ,หนูยอมพลีชีพและเซลล์ม้ามของพวกเขา
ผสมกับ SP2 / 0 เซลล์มาก รองลงมา คือ การคัดกรอง ทำให้
ใช้วิธีทางอ้อม นอกจากนี้ เซลล์ไฮบริโดมาได้
ฉีดเข้าไปในหนูสายพันธุ์ Balb / C ในการบวมน้ำ และมาบใน
บวมน้ำบริสุทธิ์โดยใช้ 5 มิลลิลิตรโปรตีน G sepharose-4b ไหล
รวดเร็วคอลัมน์ ตามคำสั่งของผู้ผลิต (
ค้นหาปักกิ่งเทคโนโลยีชีวภาพ , ปักกิ่ง ) นอกจากนี้ รองของมาบตั้งใจ
โดยใช้เมาส์โมโนโคลนอลแอนติบอดี isotyping reagents และ
6 วัดตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( โจว et al . , 2009 )
ขอประทาน anti cpfx มาบต่อ analogues ควิโนโลนและ
ยาปฏิชีวนะมีการประเมิน ( holtzapple et al . , 1997 ) ทดลอง
โปรโตคอลได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการคุ้มครองสัตว์ในงานวิจัยของมหาวิทยาลัยมหาสมุทรเซี่ยงไฮ้
.
2.3 immunodiffusion
แก้วจานที่ถูกเท 3 วุ้น 1% มิลลิลิตรและต่อยกับ
หลุม ต่อมาหลุมกลางถูกโหลด ด้วยแอนติ
( 1 : 20 ) ในขณะที่หลุมต่อพ่วงเพิ่มกับแอนติเจนเดียว
cpfx-ova หรือ OVA ตามลำดับ ตามมาด้วย เพาะที่อุณหภูมิ 37 องศา C
ตลอด 24 ชั่วโมงตกตะกอนแอนติเจนแอนติบอดีที่ซับซ้อน / เป็นบวกสำหรับการทดสอบ immunodiffusion
.
2.4 . การเตรียมตัวอย่างและเทคนิคการสกัด
โฆษณา C . auratus . niloticus ฉัน punctatus เอส แม็กซิมัส ไซแนนซิส E .
, P . vannamei , M . rosenbergii , ต. mykiss ไซแนนซิสและ O .
( 5.0 กรัม / ตัวอย่าง ) จำนวนทั้งสามใบ และวางไว้ในหลอด centrifuge โพรพิลีน

ปลาตัวอย่างที่ผสมกับสารละลายสกัด ( 30 ml )
1 M HCl –ไน ( 4 / 500 , v / v ) หลังจากถูก vortexed
5 นาที ไฟฟ้าที่ 495 กรัม 4 ° C เป็นเวลา 15 นาที
supernatants การเก็บรวบรวมและการตกค้างจะสกัด
กับกระบวนการเดียวกันอีกครั้ง ตามด้วยสาร . ต่อมา
supernatants ถูก harvested โหลดบนกรวยตัว
,และผสมกับบีบ ( 25 ml . ) หลังจากที่เขย่าอย่างแรงสำหรับ
5 นาทีจากนั้นนิคมคงที่นาน 5 นาทีชั้นน้ำคือ
ลบออกและชั้นสารอินทรีย์ระเหยแห้งกร้านของ
ตกค้างใช้ Vortex ระเหย ผลตกค้างเป็น 1.0 มิลลิลิตรของสารละลาย
ละลายในการสกัดและกรองผ่าน 0.45 μ M
ไส้กรองเมมเบรนเซลลูโลสอะซิเตททิ้งเข็มฉีดยาพร้อม .
2.5 ทางอ้อมแข่งขัน )
cpfx ตกค้างในปลาตัวอย่าง ตรวจพบการใช้ IC )
) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( วาตานาเบะ et al . , 2002 ) .
สั้น 150 นาโน cpfx-ova 100 μ L ของ PBS ( 0.01 โมลต่อลิตร pH 7.4 )
เพิ่มในแต่ละวิธีดีของแผ่น ( dingguo เทคโนโลยีชีวภาพ
เซี่ยงไฮ้จีน ) บ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจากล้างสำหรับ
3 ครั้งกับ 250 μผมซักผ้าแก้ปัญหา ( 0.01 โมลต่อลิตรพีบีเอส pH 7.4
ที่มี 0.5% Tween 20 , pbst ) บ่อที่ถูกบล็อกด้วย 1% BSA
ใน pbst ค้างคืนที่ 4 องศา หลังจากซัก 50 μผมของ cpfx มาตรฐาน
ความเข้มข้นก่อนผสมกับ 50 μผม anti cpfx
( 1 : 15 )000 ) และส่วนผสมจะถูกเพิ่มเข้าไปแล้วทั้งสามใบแต่ละดี
ตามบ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง แต่ละบ่อ มี pbst
คนเดียวหรือกับ anti cpfx มาบคนเดียวที่ใช้ควบคุมเชิงลบสำหรับ
หลังอ่าน IC วิธีอีไลซ่า ต่อมาจานถูกล้างและผูกเป็น
) ตรวจสอบ HRP แพะเซราป้องกันเมาส์
( 1 / 6000 pbst ) ที่อุณหภูมิ 37 ° C 0.5 ชั่วโมง ผูกพัน HRP ที่สอง
แอนติบอดีพบกับพื้นผิวของ 100 μ L (
ธนาคารทหารไทย ( TMB เหลว 1 มิลลิลิตร ( 1.5 มก. ) : 5 ml ของ H2O2 ( 0.03% ) : 4 มล. 0.2 M naac
พีเอช 5.3 ) เป็นเวลา 10 นาที และปฏิกิริยาเอนไซม์ถูกยกเลิกโดย
นอกจาก 2 โมลต่อลิตรกรดซัลฟูริก ( 50 μผมต่อด้วย ) ตามด้วย
อ่านค่า 450 nm ในการอ่านพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย .
เส้นโค้งมาตรฐานได้โดยการวางแผนดูดกลืนกับลอการิทึมของ cpfx
ความเข้มข้นที่พอดีกับสี่พารามิเตอร์โลจิสติก
สมการ Y = d ( − 1 ) / [ ( x / c ) B
) ที่เป็นค่าความเข้มข้นต่ำสุดที่อนันต์
, B เป็นเส้นโค้งความชันที่
จุด การผันคำ , C มีความเข้มข้นของ ic50 และ D คือสูงสุด
การดูดกลืนแสงในการขาดของ cpfx . ขีดจำกัดของการตรวจหา ( LOD ) คือ
คำนวณโดยวิธีตามที่อธิบายไว้โดย Wang et al . ( 2550 ) .
cpfx ตกค้างในตัวอย่างยังเตรียมกำหนด
โดย HPLC โดยใช้วิธีการคล้ายกับที่ของ Tang et al . ( 2006 ) .
2.6 อัตราการกู้คืนและค่าส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ์ (
cpfx มาตรฐานสารละลายที่เตรียมโดยการผสม cpfx ด้วย
metrices ของปลาแต่ละตัว ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( ต้วน และหยวน
2001 )สั้น ๆ , cpfx ผสมกับเมทริกซ์ของปลาที่แตกต่างกันอัตราส่วน
( 50 นาโนกรัม / กรัม , 600 กรัม / กรัม และ 1 , 250 นาโนกรัม / กรัม ตามลำดับ cpfx ตกค้างใน
ส่วนผสมสกัดตามที่อธิบายไว้ข้างต้น จำนวน cpfx
ตกค้างในสารละลายซีรั่มด้วยวิธี ELISA IC และ HPLC .
กู้คะแนน และส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ์ ( RSD ) ได้

ตามสมการต่อไปนี้Re : ปิดธุรกิจðÞ % = ค่าที่วัดได้ค่า
oretical × 100%