Oligonucleotides O1 and O2 form ada

Oligonucleotides O1 and O2 form adapter O1O2, which has an MseI-compatible overhang at its end. Oligonucleotides O3 and O4 form adapter O3O4, which has an ApeKI-compatible overhang at its end. These two adapters are used for tester preparation (Fig. 1). Here, the tester represents a DNA population in which both desired and undesired genes are included. The role of the poly(dA)36 adapter O1O2 is to remove fragments without adapters (Fig. 1, type 4 fragments) and Scientific Reports
Nature Publishing Group
Removing PCR for the elimination of undesired DNA fragments cycle by cycle
Jiaojiao Huan, Kangkang Wan, [...], and Guoying Wang

Additional article information

Abstract
A novel removing polymerase chain reaction (R-PCR) technique was developed, which can eliminate undesired genes, cycle by cycle, with efficiencies of 60.9% (cDNAs), 73.6% (genomic DNAs), and ~ 100% (four DNA fragments were tested). Major components of the R-PCR include drivers, a thermostable restriction enzyme - ApeKI, and a poly(dA) adapter with mismatched restriction enzyme recognition sites. Drivers were generated from the undesired genes. In each cycle of R-PCR, drivers anneal to complementary sequences and allow extension by Taq DNA polymerase. Thus, ApeKI restriction sites in the undesired genes are recovered, and adapters of these undesired DNA fragments are removed. Using R-PCR, we isolated maize upregulated defense-responsive genes and Blumeria graminis specialized genes, including key pathogenesis-related effectors. Our results show that after the R-PCR reaction, most undesired genes, including very abundant genes, became undetectable. The R-PCR is an easy and cost-efficient method to eliminate undesired genes and clone desired genes.

Polymerase chain reaction (PCR), developed by Kary B. Mullis, is a technique used to amplify many copies of a region of DNA1,2,3. PCR is a fast, inexpensive and widely used technique to amplify desired sequence fragments. However, how undesired genes may be removed from a gene pool that includes both desired and undesired genes remains a challenge. Genes are turned on or off in different biological processes, such as cellular growth, organogenesis and disease development. To identify and clone specifically expressed genes is the first step and a key strategy to explore these biological processes4. To measure and isolate specifically expressed genes, a variety of methods have been developed including differential display PCR, RNA fingerprinting, serial analysis of gene expression (SAGE), real-time quantitative PCR, subtractive suppression hybridization (SSH), microarrays, and high-throughput next-generation sequencing technologies5,6,7,8,9.

Differential display PCR is a highly sensitive method to investigate regulated genes; however, it generates a large number of false positives and requires a large number of primer pairs. SSH is a very popular subtraction method and is available as a kit. However, there are two potential problems with SSH. The first is gene redundancy. If there are a few genes that are highly differentially expressed, then they will appear as a large number in the SSH results. The second problem is generating many false positives10. DNA microarrays represent a high-throughput technique to measure a large number of genes within a single experiment. The use of DNA microarrays holds considerable promise in our understanding of genes and their impact on disease, drug discovery and development. The disadvantages of the microarrays include insufficient sensitivity because of hybridization; sequences must be known in advance; lack of reproducibility; lack of standardization; and expense. Advantages of high-throughput sequencing technologies include that they are highly efficient, and sequences do not need to be known in advance. Their disadvantages include sequencing only very short sequences, complicated post-sequencing data analysis and expense11,12. Each method has its own advantages and drawbacks, and no method can easily and efficiently remove undesired DNA fragments. The PCR method is a highly effective technique with few drawbacks. Restriction enzymes cleave DNA at specific nucleotide sequences. The R-PCR method proposed in this study makes use of a restriction enzyme that has only restriction activity and cuts in a predictable and consistent manner. As a time-saver, the enzyme ApeKI can digest one unit of assay DNA substrate in 5 min (New England Biolab Inc., USA). SSH is still a popular technique that allows isolation and cloning of differentially expressed genes. Here, we describe a novel method R-PCR, which inherits the merits of PCR, restriction enzymes and SSH.

Results
Outline of the R-PCR method
The R-PCR method is essentially divided into three main sections (Fig. 1 and Supplementary Fig. 1) and includes specifically designed testers, drivers, a single primer, a thermostable restriction enzyme (ApeKI), a thermostable Taq DNA polymerase and dNTPs. A brief description of the R-PCR method is as follows: 1) Section 1, tester and driver preparation. The preparation of tester and driver starts from samples digestion with ApeKI and MseI. The tester is made by ligation with an adaptor containing a polyA tail and then oligo-dT column purification. The driver is made by ligation of different adaptors, PCR amplification, and digestion with MseI. 2) Section 2, R-PCR reactions. The tester and driver are mixed and subjected to R-PCR with a single primer in the presence of ApeKI, which results in linear amplification of the desired fragments without ApeKI digestion due to design of a mismatch in the adaptor. In contrast, common undesired fragments are extended from the 3′ end of the driver to create the ApeKI site, which is cut, removing those fragments from further amplification. 3) Section 3, recovery of the desired fragments and the products are cloned. Recovery of the desired fragments from linear amplification in the previous step is carried out using selective PCR primers, and the products are cloned by Invitrogen's TOPO TA cloning system. Detailed procedure refers to Figure 1 and Supplementary Figure 1.

Figure 1
Figure 1
Three main sections of the R-PCR method.
The R-PCR design
A critical design aspect for R-PCR is the following nine oligonucleotides and related adapters.

O1: 5′-TTACCACGACCACCCTATTGCTGCTGC-3′
O1-short: 5′-TTACCACGACCACCCTATTGCTG-3′
O2: 5′-TAGCAGAAGCAATAGGGTGGTCGTGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3′
O3: 5′-ACGAGGTGCGGTCTTGGACTACTT-3′
O4: 5′-CWGAAGTAGTCCAAGACCGCACCTCGT-3′
O5: 5′-CGACATTCTGTAGGAAACACTAGGACTT-3′
O6: 5′-TAAAGTCCTAGTGTTTCCTACAGAATGTCG-3′
O7: 5′-GGGTTGCGATACGATTGTTATAGGTCAC-3′
O8: 5′-CWGGTGACCTATAACAATCGTATCGCAACCC-3′
Oligonucleotides O1 and O2 form adapter O1O2, which has an MseI-compatible overhang at its end. Oligonucleotides O3 and O4 form adapter O3O4, which has an ApeKI-compatible overhang at its end. These two adapters are used for tester preparation (Fig. 1). Here, the tester represents a DNA population in which both desired and undesired genes are included. The role of the poly(dA)36 adapter O1O2 is to remove fragments without adapters (Fig. 1, type 4 fragments) and fragments that have O3O4 adapters at both ends (Fig. 1, type 3 fragments) via oligo-dT spin column purification. It is essential that adapter O1O2 harbors two overlapping ApeKI recognition sites with one mismatched base pair (Fig. 1). The mismatched base pair can save this adapter from digestion, but once a correct match is recovered in R-PCR cycling, our results show that ApeKI can efficiently cut off the overlapping recognition sites. To construct the tester, DNA was digested by ApeKI and MseI, and then two adapters, O1O2 and O3O4, were added (Fig. 1 and Supplementary Fig. 1).Oligonucleotides O5 and O6 form adapter O5O6, which has an MseI-compatible overhang at its end. Oligonucleotides O7 and O8 form adapter O7O8, which has an ApeKI-compatible overhang at its end. These two adapters are for the driver preparation (Fig. 1 and Supplementary Fig. 1). Here, the driver represents a DNA population in which only undesired genes (a reference) are included. To obtain the excess driver, we used primers O5 and O7 to amplify DNA fragments of undesired genes (genes from the control sample). The driver was obtained after the PCR products were digested by MseI and then purified by a commercial spin column.

Four types of DNA fragments were generated in the tester preparation (Fig. 1). Type 1 fragments: one end has the adapter O1O2 and the other end has the adapter O3O4. These are the only expected fragments for R-PCR. Type 2 fragments: both ends have adapter O1O2. Annealing and extension of primer O1 introduced the ApeKI recognition sites, which were digested. Thus, fragments with these adapters were removed. Type 3 fragments: both ends have adapter O3O4. As with random amplified polymorphic DNA (RAPD) and single primer amplification reaction (SPAR)13,14, this type of fragment could also be exponentially amplified during PCR15,16,17. Fortunately, they are removed by the oligo-dT spin column purification. There are many fragments that do not have any adapters in Type 4 fragments. These non-adapter-ligated fragments can serve as the driver and remove desired genes. Fortunately, they are also removed by oligo-dT spin column purification.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Oligonucleotides O1 และ O2 แบบฟอร์มการ์ด O1O2 ซึ่งมี overhang MseI-เข้ากันได้เป็นที่สิ้นสุดของ การ Oligonucleotides O3 และ O4 ฟอร์มการ์ด O3O4 ซึ่งมี overhang ความเข้ากันได้กับ ApeKI ที่จุดสิ้นสุด การ์ดเหล่านี้ทั้งสองจะใช้สำหรับการเตรียมเครื่องวัด (Fig. 1) ที่นี่ เครื่องวัดที่แสดงถึงประชากรดีเอ็นเอซึ่งยีนทั้งระบุ และไม่มีอยู่ บทบาทของโพลี (ดา) 36 อะแดปเตอร์ O1O2 จะเอาชิ้นส่วนไม่ มีอะแดปเตอร์ (Fig. 1 ชิ้นส่วนชนิดที่ 4) และรายงานทางวิทยาศาสตร์กลุ่มธรรมชาติประกาศเอา PCR สำหรับการตัดออกของชิ้นส่วนดีเอ็นเอไม่รอบโดยรอบJiaojiao หวน Kangkang วาน [...], และ วัง Guoyingรายละเอียดเพิ่มเติมบทคัดย่อเอาเทคนิคปฏิกิริยาลูกโซ่ (R PCR) พอลิเมอเรสนวนิยายกล่าว ซึ่งสามารถกำจัดยีนไม่ วน โดยรอบ มีประสิทธิภาพ 60.9% (cDNAs), 73.6% (genomic DNAs), และ ~ 100% (ชิ้นส่วนดีเอ็นเอ 4 ทดสอบ) ส่วนประกอบสำคัญของ R-PCR รวมโปรแกรมควบคุม ข้อจำกัดที่ thermostable เอนไซม์ - ApeKI และอะแดปเตอร์ poly(dA) ไซต์การจับเอนไซม์จำกัด โปรแกรมควบคุมถูกสร้างจากยีนไม่ ในแต่ละรอบของ R PCR ไดรเวอร์หลอมแบบการลำดับเสริม และอนุญาตให้ส่วนขยาย โดย Taq DNA พอลิเมอเรส ดังนั้น มีการกู้คืนไซต์จำกัด ApeKI ในยีนไม่ และอะแดปเตอร์ของชิ้นส่วนดีเอ็นเอเหล่านี้ไม่ถูกเอาออก ใช้ R-PCR เราแยกต่างหาก upregulated ข้าวโพดยีนตอบสนองต่อการป้องกัน และความ Blumeria graminis ยีน รวมถึงเบสที่เกี่ยวข้องกับพยาธิกำเนิดคีย์ ผลของเราแสดงว่า หลังจากปฏิกิริยา R PCR สุดไม่ยีน ยีนมากมากมาย รวมถึงเป็นสามค R-PCR เป็นวิธีง่าย และประหยัดเพื่อกำจัดไม่ยีน และโคลนยีนต้องพอลิเมอเรสปฏิกิริยาลูกโซ่ (PCR), พัฒนาขึ้น โดย Kary B. Mullis เป็นเทคนิคหนึ่งที่ใช้ขยายสำเนาจำนวนมากของพื้นที่ DNA1, 2, 3 PCR เป็นเทคนิคที่รวดเร็ว ราคาไม่แพง และใช้กันอย่างแพร่หลายขยายชิ้นส่วนลำดับที่ต้อง อย่างไรก็ตาม วิธียีนไม่อาจถูกลบออกจากกลุ่มยีนที่มียีนทั้งระบุ และไม่ เหลือความท้าทาย ยีนจะเปิด หรือปิดในชีวภาพกระบวนการต่าง ๆ เช่นโทรศัพท์มือถือเติบโต พัฒนาการเกิดของอวัยวะและโรค การระบุ และโคลนยีนที่แสดงเฉพาะเป็นขั้นตอนแรกและกลยุทธ์สำคัญในการสำรวจ processes4 ชีวภาพเหล่านี้ วัด และแยกเฉพาะแสดงยีน ความหลากหลายของวิธีได้รับการพัฒนารวมทั้งส่วนแสดงผล PCR ลายพิมพ์อาร์เอ็นเอ อนุกรม วิเคราะห์ยีน (ปราชญ์), PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ ปราบปราม subtractive hybridization (SSH), microarrays อัตราความเร็วสูงรุ่นถัดไปลำดับ technologies5, 6, 7, 8, 9ส่วนแสดงผล PCR เป็นวิธีการตรวจสอบยีนควบคุม ความไวสูง อย่างไรก็ตาม มันสร้างเท็จทำงานผิดพลาดเป็นจำนวนมาก และต้องการจำนวนคู่รองพื้น SSH เป็นวิธีนิยมมากลบ และมีเป็นชุด อย่างไรก็ตาม มีสองปัญหาที่อาจเกิดขึ้นกับ SSH แรกคือ ยีนซ้ำ ถ้ามียีนกี่ที่สูง differentially แสดง แล้วพวกเขาจะปรากฏเป็นจำนวนมากในผล SSH ปัญหาที่สองคือสร้าง positives10 เท็จหลาย DNA microarrays แสดงเทคนิควัดจำนวนมากของยีนภายในการทดลองเดียวสามารถประมวลผลได้สูง การใช้ DNA microarrays เก็บสัญญามากในความเข้าใจของเราของยีนและผลกระทบของโรค การค้นพบยาเสพติด และการพัฒนา ข้อเสียของ microarrays มีความไวไม่เพียงพอ เพราะ hybridization ต้องทราบลำดับล่วงหน้า ขาด reproducibility ขาดมาตรฐาน และค่าใช้จ่าย ข้อดีของการจัดลำดับอัตราความเร็วสูงเทคโนโลยีรวมถึงจะมีประสิทธิภาพสูง และลำดับไม่จำเป็นต้องทราบล่วงหน้า ข้อเสียของตนรวมถึงลำดับลำดับเพียงสั้น ๆ ซับซ้อนลำดับเบสหลังวิเคราะห์ข้อมูล และ expense11, 12 แต่ละวิธีมีข้อดีและข้อเสียของตัวเอง และวิธีไม่สามารถได้อย่างง่ายดาย และมีประสิทธิภาพเอาชิ้นส่วนดีเอ็นเอไม่ วิธี PCR เป็นเทคนิคที่มีประสิทธิภาพสูงกับข้อเสียเพียงเล็กน้อย เอนไซม์จำกัด cleave ดีเอ็นเอในนิวคลีโอไทด์ที่เฉพาะลำดับ วิธี R PCR ที่นำเสนอในการศึกษานี้ทำให้ใช้เอนไซม์จำกัดที่มีเพียงจำกัดกิจกรรม และตัดได้ และสอดคล้องกัน เป็นตัวเวลารักษา เอนไซม์ ApeKI สามารถย่อยหน่วยหนึ่งของพื้นผิว DNA วิเคราะห์ใน 5 นาที (นิวอิงแลนด์ Biolab Inc., USA) SSH เป็นเทคนิคยอดนิยมที่สามารถแยก และโคลนของ differentially แสดงยีน ที่นี่ เราอธิบายวิธีนวนิยาย R-PCR ที่บุญ PCR เอนไซม์จำกัด และ SSHผลลัพธ์เค้าร่างของวิธี R PCRวิธี R PCR เป็นหลักแบ่งสามหลัก (Fig. 1 และ 1 Fig. เสริม) และโดยเฉพาะออกแบบทดสอบ โปรแกรมควบคุม พื้นเดียว เป็นเอนไซม์จำกัด thermostable (ApeKI), thermostable Taq DNA พอลิเมอเรส และ dNTPs คำอธิบายโดยย่อของวิธี R PCR จะเป็นดังนี้: 1) เตรียมส่วน 1 เครื่องวัด และควบคุม เตรียมเครื่องทดสอบและโปรแกรมควบคุมเริ่มต้นจากตัวอย่างการย่อยอาหาร ApeKI และ MseI เครื่องวัดที่ถูกตั้งขึ้น โดยไข่กับอะแดปเตอร์ที่ประกอบด้วย polyA หางแล้วฟอกคอลัมน์ oligo dT โปรแกรมควบคุมที่ถูกตั้งขึ้น โดยไข่ ของอะแดปเตอร์ต่าง ๆ ขยาย PCR ย่อยอาหารกับ MseI 2 ส่วน 2 ปฏิกิริยา R PCR เครื่องวัดและควบคุมที่ผสม และ R-PCR ต้อง มีพื้นเดียวในต่อหน้าของ ApeKI มีผลขยายเชิงเส้นของการกระจายตัวที่ระบุโดยไม่ต้องย่อยอาหาร ApeKI ครบกำหนดในการออกแบบของอะแดปเตอร์ที่ไม่ตรงกัน ในทางตรงกันข้าม การกระจายตัวไม่ทั่วจะขยายจากท้าย 3′ โปรแกรมควบคุมที่จะสร้างเว็บไซต์ ApeKI ซึ่งถูกตัด เอาชิ้นส่วนเหล่านั้นจากการขยาย 3) ส่วน 3 กู้คืนข้อมูลของผลิตภัณฑ์และชิ้นส่วนต้องมีโคลน ชิ้นส่วนต้องกู้คืนจากขยายเส้นที่ดำเนินโดยใช้ไพรเมอร์ใช้ PCR และผลิตภัณฑ์เป็นโคลน โดยตาเดินของ Invitrogen โคลนระบบ ขั้นตอนโดยละเอียดอ้างถึงรูปที่ 1 และรูปที่ 1 ส่งเสริมการขายรูปที่ 1 รูปที่ 1สามส่วนหลักของวิธี R PCRแบบ R-PCRด้านการออกแบบที่สำคัญสำหรับ R PCR เป็น oligonucleotides ต่อไปนี้ 9 และอะแดปเตอร์ที่เกี่ยวข้องO1: 5′-TTACCACGACCACCCTATTGCTGCTGC-3′O1-สั้น ๆ: 5′-TTACCACGACCACCCTATTGCTG-3′O2: 5′-TAGCAGAAGCAATAGGGTGGTCGTGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3′O3: 5′-ACGAGGTGCGGTCTTGGACTACTT-3′O4: 5′-CWGAAGTAGTCCAAGACCGCACCTCGT-3′O5: 5′-CGACATTCTGTAGGAAACACTAGGACTT-3′O6: 5′-TAAAGTCCTAGTGTTTCCTACAGAATGTCG-3′O7: 5′-GGGTTGCGATACGATTGTTATAGGTCAC-3′O8: 5′-CWGGTGACCTATAACAATCGTATCGCAACCC-3′Oligonucleotides O1 และ O2 แบบฟอร์มการ์ด O1O2 ซึ่งมี overhang MseI-เข้ากันได้เป็นที่สิ้นสุดของ การ Oligonucleotides O3 และ O4 ฟอร์มการ์ด O3O4 ซึ่งมี overhang ความเข้ากันได้กับ ApeKI ที่จุดสิ้นสุด การ์ดเหล่านี้ทั้งสองจะใช้สำหรับการเตรียมเครื่องวัด (Fig. 1) ที่นี่ เครื่องวัดที่แสดงถึงประชากรดีเอ็นเอซึ่งยีนทั้งระบุ และไม่มีอยู่ บทบาทของโพลี (ดา) 36 อะแดปเตอร์ O1O2 จะเอาชิ้นส่วนไม่ มีอะแดปเตอร์ (Fig. 1 พิมพ์ชิ้นส่วนที่ 4) และบางส่วนของที่มีอะแดปเตอร์ O3O4 ที่ปลายทั้งสอง (Fig. 1 ชิ้นส่วนชนิด 3) ผ่านการฟอกคอลัมน์หมุน oligo dT มันเป็นสิ่งสำคัญที่อะแดปเตอร์ O1O2 harbors สองซ้อน ApeKI ไซต์ที่รู้ มีหนึ่งจับคู่ฐาน (Fig. 1) ฐานคู่ไม่ตรงสามารถบันทึกการ์ดนี้จากย่อยอาหาร แต่เมื่อจับถูกต้องควบคุมใน R-PCR จักรยาน ผลของเราแสดงว่า ApeKI สามารถตัดได้อย่างมีประสิทธิภาพออกไซต์การทับซ้อนกัน การสร้างแบบทดสอบ ดีเอ็นเอถูกต้อง โดย ApeKI และ MseI แล้ว มีเพิ่มอะแดปเตอร์ 2, O1O2 และ O3O4 (Fig. 1 และ Fig. เสริม 1) Oligonucleotides O5 และ O6 ฟอร์มการ์ด O5O6 ซึ่งมี overhang MseI-เข้ากันได้เป็นที่สิ้นสุดของ การ Oligonucleotides O7 และ O8 ฟอร์มการ์ด O7O8 ซึ่งมี overhang ความเข้ากันได้กับ ApeKI ที่จุดสิ้นสุด การ์ดเหล่านี้สองที่สำหรับการจัดเตรียมโปรแกรมควบคุม (Fig. 1 และ Fig. เสริม 1) ที่นี่ โปรแกรมควบคุมประชากรที่ดีเอ็นเอที่เฉพาะไม่ยีน (อ้างอิง) จะรวม การขอรับโปรแกรมควบคุมส่วนเกิน เราใช้ไพรเมอร์ O5 และ O7 ขยายชิ้นส่วนดีเอ็นเอของยีนไม่ (ยีนจากควบคุม) ไดรเวอร์กล่าวหลังจากที่ผลิตภัณฑ์ PCR เจ่า โดย MseI และบริสุทธิ์ตามคอลัมน์หมุนเชิงพาณิชย์แล้วมีสร้างสี่ชนิดของชิ้นส่วนดีเอ็นเอในเครื่องวัด (Fig. 1) ชิ้นส่วนชนิด 1: หนึ่งมีอะแดปเตอร์ O1O2 และสิ้นสุดอื่น ๆ มีอะแดปเตอร์ O3O4 เหล่านี้เป็นชิ้นส่วนที่คาดไว้เพียงสำหรับ R PCR พิมพ์ชิ้นส่วนที่ 2: ทั้งสองมีอะแดปเตอร์ O1O2 Annealing และขยายพื้น O1 แนะนำเว็บไซต์ของการรับรู้ที่ ApeKI ที่ถูกต้อง ดังนั้น ชิ้นส่วนอะแดปเตอร์เหล่านี้ถูกเอาออก พิมพ์บางส่วนของ 3: ทั้งสองมีอะแดปเตอร์ O3O4 เช่นเดียวกับการสุ่มเอาต์ polymorphic ดีเอ็นเอ (อาร์เอพีดี) และปฏิกิริยาการขยายพื้นที่เดียว (SPAR) 13,14 ส่วนชนิดนี้สามารถยังสร้างขยายระหว่าง PCR15, 16, 17 โชคดี พวกเขาจะถูกเอาออก โดยฟอกคอลัมน์หมุน oligo dT มีชิ้นส่วนจำนวนมากที่ไม่มีการ์ดใด ๆ ในชิ้นส่วน 4 ชนิด เหล่านี้ไม่ใช่การ์ดควบสามารถเป็นไดรเวอร์ และเอายีนที่ต้องการ โชคดี พวกเขาจะถูกเอาออก โดย oligo dT หมุนคอลัมน์ฟอก

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

oligonucleotides O1 และ O2 O1O2 อะแดปเตอร์รูปแบบซึ่งมีที่แขวน MseI ที่เข้ากันได้ในตอนท้ายของ oligonucleotides O3 และอะแดปเตอร์แบบฟอร์ม O4 O3O4 ซึ่งมีที่แขวน ApeKI ที่เข้ากันได้ในตอนท้ายของ สองคนนี้อะแดปเตอร์ที่ใช้สำหรับการเตรียมการทดสอบ (รูปที่ 1). นี่แสดงให้เห็นถึงการทดสอบดีเอ็นเอของประชากรซึ่งทั้งสองยีนที่ต้องการและไม่ต้องการที่จะถูกรวม บทบาทของโพลี (dA) O1O2 อะแดปเตอร์ 36 คือการเอาเศษโดยไม่ต้องอะแดปเตอร์ (รูปที่ 1. ประเภท 4 ชิ้น) และรายงานทางวิทยาศาสตร์
ธรรมชาติกลุ่มสำนักพิมพ์
ถอด PCR สำหรับการกำจัดของดีเอ็นเอที่ไม่พึงประสงค์รอบโดยรอบ
Jiaojiao Huan, Kangkang วาน [... ] และ Guoying วังข้อมูลเพิ่มเติมบทความบทคัดย่อนวนิยายลบวิธี polymerase chain reaction (R-PCR) ได้รับการพัฒนาซึ่งสามารถขจัดยีนที่ไม่พึงประสงค์รอบโดยรอบที่มีประสิทธิภาพของ 60.9% (cDNAs) 73.6% ( จีโนมดีเอ็นเอ) และ ~ 100% (สี่ดีเอ็นเอได้มีการทดสอบ) ส่วนประกอบที่สำคัญของ R-PCR รวมถึงไดรเวอร์เอนไซม์ จำกัด อุณหภูมิ - ApeKI และโพลี (dA) อะแดปเตอร์ที่มีข้อ จำกัด ที่ไม่ตรงกันเว็บไซต์การรับรู้การทำงานของเอนไซม์ ไดร์เวอร์ถูกสร้างขึ้นจากยีนที่ไม่พึงประสงค์ ในวงจรของ R-PCR แต่ละไดรเวอร์หลอมลำดับเสริมและอนุญาตให้ขยายโดยดีเอ็นเอโพลิเมอร์ Taq ดังนั้น ApeKI เว็บไซต์ข้อ จำกัด ในยีนที่ไม่พึงประสงค์จะกู้คืนและอะแดปเตอร์ของดีเอ็นเอที่ไม่พึงประสงค์เหล่านี้จะถูกลบออก การใช้ R-PCR เราแยกข้าวโพด upregulated ยีนป้องกันการตอบสนองและ Blumeria graminis เฉพาะยีนรวมทั้งเอฟเฟคที่สำคัญที่เกี่ยวข้องกับการเกิดโรค ผลของเราแสดงให้เห็นว่าหลังจากปฏิกิริยา R-PCR ยีนที่ไม่พึงประสงค์มากที่สุดรวมทั้งยีนชุกชุมมากกลายเป็น undetectable R-PCR เป็นวิธีที่ง่ายและค่าใช้จ่ายที่มีประสิทธิภาพในการกำจัดยีนที่ไม่พึงประสงค์และโคลนยีนที่ต้องการ. โพลีเมอปฏิกิริยาลูกโซ่ (PCR) ที่พัฒนาโดย Kary Mullis บีเป็นเทคนิคที่ใช้ในการขยายจำนวนสำเนาของภูมิภาค DNA1,2 3 PCR เป็นไปอย่างรวดเร็วเทคนิคราคาไม่แพงและใช้กันอย่างแพร่หลายเพื่อขยายชิ้นส่วนลำดับที่ต้องการ แต่วิธีการที่ยีนที่ไม่พึงประสงค์อาจถูกลบออกจากสระว่ายน้ำของยีนที่มียีนทั้งที่ต้องการและยังคงความท้าทายที่ไม่พึงประสงค์ ยีนที่มีการเปิดหรือปิดในกระบวนการทางชีวภาพที่แตกต่างกันเช่นการเจริญเติบโตของเซลล์อวัยวะและการพัฒนาของโรค ในการระบุและโคลนยีนแสดงเฉพาะเป็นขั้นตอนแรกและเป็นกลยุทธ์ที่สำคัญในการสำรวจ processes4 ทางชีวภาพเหล่านี้ การวัดและแยกยีนที่แสดงออกโดยเฉพาะความหลากหลายของวิธีการได้รับการพัฒนารวมทั้งการแสดงผล PCR แตกต่าง, พิมพ์ลายนิ้วมือ RNA การวิเคราะห์อนุกรมการแสดงออกของยีน (SAGE) แบบ real-time PCR เชิงปริมาณลดผสมพันธุ์ปราบปราม (SSH) microarrays และสูง . ผ่านลำดับรุ่นต่อไป technologies5,6,7,8,9 PCR การแสดงผลที่แตกต่างกันเป็นวิธีที่มีความไวสูงในการตรวจสอบยีนที่ควบคุม; แต่จะสร้างเป็นจำนวนมากบวกเท็จและต้องใช้จำนวนมากของคู่ไพรเมอร์ SSH เป็นวิธีการลบความนิยมอย่างมากและสามารถใช้ได้เป็นชุด แต่มีสองปัญหาที่อาจเกิดขึ้นกับ SSH ประการแรกคือความซ้ำซ้อนของยีน หากมียีนบางตัวที่มีการแสดงออกแตกต่างกันอย่างมากแล้วพวกเขาก็จะปรากฏเป็นจำนวนมากในผล SSH ปัญหาที่สองคือการสร้าง positives10 เท็จหลายคน ดีเอ็นเอ microarrays ตัวแทนเทคนิคสูงผ่านการวัดเป็นจำนวนมากของยีนที่อยู่ในการทดลองเดียว การใช้ดีเอ็นเอ microarrays ถือสัญญามากในความเข้าใจของเราของยีนและผลกระทบต่อการเกิดโรค, การค้นพบยาเสพติดและการพัฒนา ข้อเสียของ microarrays รวมถึงความไวไม่เพียงพอเพราะการผสมพันธุ์; ลำดับจะต้องรู้จักล่วงหน้า ขาดการทำสำเนา; ขาดมาตรฐาน; และค่าใช้จ่าย ข้อดีของเทคโนโลยีลำดับสูงผ่านรวมถึงว่าพวกเขาจะมีประสิทธิภาพสูงและลำดับไม่จำเป็นต้องเป็นที่รู้จักล่วงหน้า ข้อเสียของพวกเขามีเพียงลำดับลำดับที่สั้นมากในการวิเคราะห์ข้อมูลการโพสต์ลำดับที่ซับซ้อนและ expense11,12 แต่ละวิธีมีข้อดีของตัวเองและข้อเสียและวิธีการไม่ได้อย่างง่ายดายและมีประสิทธิภาพสามารถเอาชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ไม่พึงประสงค์ วิธี PCR เป็นเทคนิคที่มีประสิทธิภาพสูงที่มีข้อบกพร่องน้อย ข้อ จำกัด เอนไซม์ดีเอ็นเอที่ยึดลำดับเบสที่เฉพาะเจาะจง วิธี R-PCR เสนอในการศึกษาครั้งนี้ทำให้การใช้เอนไซม์ จำกัด ที่มีกิจกรรมข้อ จำกัด เท่านั้นและตัดในลักษณะที่คาดเดาได้และสอดคล้องกัน ในฐานะที่เป็นประหยัดเวลาเอนไซม์ ApeKI สามารถย่อยหนึ่งหน่วยของพื้นผิวการทดสอบดีเอ็นเอใน 5 นาที (นิวอิงแลนด์ Biolab อิงค์สหรัฐอเมริกา) SSH ยังคงเป็นเทคนิคที่นิยมที่ช่วยให้การแยกและการโคลนยีนแสดงออกแตกต่างกัน ที่นี่เราจะอธิบายวิธีการนวนิยาย R-PCR ซึ่งสืบทอดประโยชน์ของ PCR เอนไซม์ข้อ จำกัด และ SSH. ผลโครงร่างของวิธี R-PCR วิธี R-PCR จะแบ่งออกเป็นหลักออกเป็นสามส่วนหลัก (รูปที่. 1 และเสริมรูป . 1) และรวมถึงการทดสอบการออกแบบเฉพาะไดรเวอร์ไพรเมอร์เดียวเอนไซม์ จำกัด อุณหภูมิ (ApeKI) ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ Taq อุณหภูมิและ dNTPs คำอธิบายสั้น ๆ ของวิธี R-PCR มีดังนี้ 1) ส่วนที่ 1 ทดสอบและการเตรียมการขับรถ การเตรียมการทดสอบและคนขับรถเริ่มจากตัวอย่างการย่อยอาหารที่มี ApeKI และ MseI การทดสอบจะทำโดย ligation กับอะแดปเตอร์ที่มีหางPólyaแล้วฟอกคอลัมน์ Oligo-dT คนขับจะทำโดย ligation ของอะแดปเตอร์ที่แตกต่างกันขยาย PCR และการย่อยอาหารที่มี MseI 2) ส่วนที่ 2 ปฏิกิริยา R-PCR การทดสอบและคนขับรถจะผสมและเป็นไป R-PCR ด้วยไพรเมอร์เดียวในการปรากฏตัวของ ApeKI ซึ่งส่งผลให้การขยายเชิงเส้นของชิ้นส่วนที่ต้องการโดยไม่ต้องย่อยอาหาร ApeKI เนื่องจากการออกแบบที่ไม่ตรงกันของอะแดปเตอร์ ในทางตรงกันข้ามที่ไม่พึงประสงค์ที่พบชิ้นส่วนจะยื่นออกมาจากปลาย 3 'ของผู้ขับขี่ในการสร้างเว็บไซต์ ApeKI ซึ่งถูกตัดเอาชิ้นส่วนที่มาจากการขยายเพิ่มเติม 3) ส่วนที่ 3 การฟื้นตัวของชิ้นส่วนที่ต้องการและผลิตภัณฑ์ที่มีการโคลน การฟื้นตัวของชิ้นส่วนที่ต้องการจากการขยายเชิงเส้นในขั้นตอนก่อนหน้านี้จะดำเนินการโดยใช้ไพรเมอร์ PCR เลือกและผลิตภัณฑ์ที่มีการโคลนโดย Invitrogen ของระบบ TOPO TA โคลน ขั้นตอนโดยละเอียดหมายถึงรูปที่ 1 และเสริมรูปที่ 1 รูปที่ 1 รูปที่ 1 สามส่วนหลักของวิธี R-PCR. ออกแบบ R-PCR ด้านการออกแบบที่สำคัญสำหรับ R-PCR เป็นดังต่อไปนี้เก้า oligonucleotides และอะแดปเตอร์ที่เกี่ยวข้อง. O1: 5 '-TTACCACGACCACCCTATTGCTGCTGC-3' O1 สั้น: 5'-TTACCACGACCACCCTATTGCTG-3 ' O2: 5'-TAGCAGAAGCAATAGGGTGGTCGTGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 ' O3: 5'-ACGAGGTGCGGTCTTGGACTACTT-3 ' O4: 5'-CWGAAGTAGTCCAAGACCGCACCTCGT-3 ' O5: 5'-CGACATTCTGTAGGAAACACTAGGACTT -3 ' O6: 5'-TAAAGTCCTAGTGTTTCCTACAGAATGTCG-3 ' O7: 5'-GGGTTGCGATACGATTGTTATAGGTCAC-3 ' O8: 5'-CWGGTGACCTATAACAATCGTATCGCAACCC-3 ' oligonucleotides O1 และ O2 อะแดปเตอร์แบบฟอร์ม O1O2 ซึ่งมีที่แขวน MseI ที่เข้ากันได้ในตอนท้ายของ oligonucleotides O3 และอะแดปเตอร์แบบฟอร์ม O4 O3O4 ซึ่งมีที่แขวน ApeKI ที่เข้ากันได้ในตอนท้ายของ สองคนนี้อะแดปเตอร์ที่ใช้สำหรับการเตรียมการทดสอบ (รูปที่ 1). นี่แสดงให้เห็นถึงการทดสอบดีเอ็นเอของประชากรซึ่งทั้งสองยีนที่ต้องการและไม่ต้องการที่จะถูกรวม บทบาทของโพลี (dA) 36 อะแดปเตอร์ O1O2 คือการเอาเศษโดยไม่ต้องอะแดปเตอร์ (รูปที่ 1. ประเภท 4 ชิ้น) และชิ้นส่วนที่มีอะแดปเตอร์ O3O4 ที่ปลายทั้งสอง (รูปที่ 1. ชนิด 3 ชิ้น) ผ่านคอลัมน์หมุน Oligo-dT การฟอก มันเป็นสิ่งสำคัญที่อะแดปเตอร์ O1O2 ท่าเรือทับซ้อนกันสองเว็บไซต์ที่ได้รับการยอมรับ ApeKI กับคู่ฐานที่ไม่ตรงกันหนึ่ง (รูปที่ 1). คู่ฐานที่ไม่ตรงกันสามารถบันทึกอะแดปเตอร์จากการย่อยนี้ แต่เมื่อการแข่งขันที่ถูกต้องมีการกู้คืนในการขี่จักรยาน R-PCR ผลของเราแสดงให้เห็นว่า ApeKI สามารถตัดออกได้อย่างมีประสิทธิภาพในเว็บไซต์ที่ได้รับการยอมรับที่ทับซ้อนกัน เพื่อสร้างการทดสอบดีเอ็นเอถูกย่อยโดย ApeKI และ MseI แล้วสองอะแดปเตอร์และ O1O2 O3O4 ถูกเพิ่ม (รูป. 1 และเสริมรูปที่ 1). .Oligonucleotides O5 และอะแดปเตอร์ O6 O5O6 รูปแบบซึ่งมีที่แขวน MseI ที่เข้ากันได้ ในตอนท้ายของ oligonucleotides O7 และอะแดปเตอร์แบบฟอร์ม O8 O7O8 ซึ่งมีที่แขวน ApeKI ที่เข้ากันได้ในตอนท้ายของ สองคนนี้มีอะแดปเตอร์สำหรับการเตรียมความพร้อมคนขับ (รูป. 1 และเสริมรูปที่ 1). ที่นี่คนขับรถหมายถึงประชากรดีเอ็นเอซึ่งมีเพียงยีนที่ไม่พึงประสงค์ (อ้างอิง) ที่จะถูกรวม เพื่อให้ได้คนขับส่วนเกินที่เราใช้ไพรเมอร์และ O5 O7 เพื่อขยายดีเอ็นเอของยีนที่ไม่พึงประสงค์ (ยีนจากตัวอย่างควบคุม) คนขับรถที่ได้รับหลังจากที่ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกย่อยโดย MseI บริสุทธิ์แล้วโดยคอลัมน์หมุนเชิงพาณิชย์. สี่ประเภทของดีเอ็นเอถูกสร้างขึ้นในการเตรียมการทดสอบ (รูปที่ 1). พิมพ์ 1 ชิ้นส่วน: ปลายด้านหนึ่งมี O1O2 อะแดปเตอร์และส่วนอื่น ๆ ที่มีอะแดปเตอร์ O3O4 เหล่านี้เป็นชิ้นส่วนที่คาดว่าเฉพาะสำหรับ R-PCR ประเภทที่ 2 เศษปลายทั้งสองมี O1O2 อะแดปเตอร์ หลอมและการขยายตัวของไพรเมอร์ O1 แนะนำเว็บไซต์ที่ได้รับการยอมรับ ApeKI ซึ่งถูกย่อย ดังนั้นชิ้นส่วนที่มีอะแดปเตอร์เหล่านี้ถูกถอดออก พิมพ์ 3 ชิ้นส่วนปลายทั้งสองมี O3O4 อะแดปเตอร์ เช่นเดียวกับดีเอ็นเอ polymorphic สุ่มขยาย (RAPD) และปฏิกิริยาการขยายไพรเมอร์เดียว (ปะทะ) 13,14 ประเภทของส่วนนี้อาจจะมีการชี้แจงในระหว่างการขยาย PCR15,16,17 โชคดีที่พวกเขาจะถูกลบออกโดยการทำให้บริสุทธิ์คอลัมน์หมุน Oligo-dT มีชิ้นส่วนจำนวนมากที่ไม่ได้มีอะแดปเตอร์ใด ๆ ในแบบที่ 4 เป็นเศษเล็กเศษน้อย เหล่านี้ชิ้นส่วนที่ไม่ใช่อะแดปเตอร์ ligated สามารถทำหน้าที่เป็นคนขับรถและเอายีนที่ต้องการ โชคดีที่พวกเขาจะถูกลบออกโดยการหมุนบริสุทธิ์คอลัมน์ Oligo-dT

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

โอลิโกนิวคลีโอไทด์ 01 และ O2 แบบอะแดปเตอร์ o1o2 ซึ่งมี msei เข้ากันได้แขวนที่ปลายของมัน โอลิโกนิวคลีโอไทด์และรูปแบบ o3o4 O3 o4 อะแดปเตอร์ซึ่งมี apeki เข้ากันได้แขวนที่ปลายของมัน เหล่านี้สองอะแดปเตอร์จะใช้ในการเตรียมสอบ ( รูปที่ 1 ) มาทดสอบเป็นประชากรในดีเอ็นเอซึ่งทั้งสองที่ต้องการและไม่ต้องการยีนที่จะถูกรวมบทบาทของพอลิ ( ดา ) 36 อะแดปเตอร์ o1o2 คือการลบเศษโดยไม่ต้องอะแดปเตอร์ ( ภาพที่ 1 , 4 ชนิด เศษ ) และรายงานทางวิทยาศาสตร์

เอาเชื้อกลุ่มสำนักพิมพ์ธรรมชาติเพื่อกำจัดที่ไม่พึงประสงค์ดีเอ็นเอวงจรโดยวงจร
jiaojiao วาน kangkang วาน , [ . . . ] และ guoying หวัง

เพิ่มเติมบทความข้อมูล


บทคัดย่อนิยายเอาปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส ( r-pcr ) เทคนิคที่ถูกพัฒนาขึ้น ซึ่งสามารถกำจัดที่ไม่พึงประสงค์ยีน , วงจรโดยวงจรที่มีประสิทธิภาพภายใน ( cdnas ) 1.5 % ( genomic จำเพาะ ) และ ~ 100% ( สี่ชิ้นส่วนดีเอ็นเอทดสอบ ) ส่วนประกอบหลักของ r-pcr รวมถึงไดรเวอร์ , เอนไซม์ thermostable - apeki และพอลิ ( ดา ) อะแดปเตอร์กับเอนไซม์ที่ไม่ตรงกันการเว็บไซต์ไดรเวอร์ถูกสร้างจากยีนที่ไม่พึงปรารถนา ในแต่ละรอบของ r-pcr ไดรเวอร์เนล เพื่อลำดับคู่และอนุญาตให้ขยายโดย Dmitri Lytov ได้ดี . ดังนั้น apeki จำกัดเว็บไซต์ในยีนที่ไม่พึงปรารถนาจะกู้และอะแดปเตอร์เหล่านี้ไม่ต้องการชิ้นส่วนดีเอ็นเอจะถูกลบออก การใช้ r-pcr เราแยกข้าวโพด upregulated ป้องกันการตอบสนองและยีน blumeria graminis เฉพาะยีนซึ่งรวมถึงคีย์ที่เกี่ยวข้องอีกครั้งหนึ่ง . ผลของเราแสดงให้เห็นว่า หลังจาก r-pcr ปฏิกิริยาไม่พึงประสงค์มากที่สุดรวมทั้งยีนยีนชุกชุมมากจึงไม่สามารถวัดได้ การ r-pcr เป็นง่าย และต้นทุนวิธีที่มีประสิทธิภาพเพื่อกำจัดยีนที่ไม่พึงประสงค์และโคลนยีนที่ต้องการ

Polymerase chain reaction ( PCR ) ที่พัฒนาโดย แครี่ บี ลิส เป็นเทคนิคที่ใช้เพื่อขยายขอบเขตของ dna1,2 หลายเล่ม ,3 . PCR เป็นอย่างรวดเร็วและราคาไม่แพง และใช้กันอย่างแพร่หลายเทคนิคเพื่อขยายส่วนที่ต้องการตามลําดับ อย่างไรก็ตาม วิธีการที่ไม่พึงประสงค์ที่อาจถูกลบออกจากยีนพูลที่มีทั้งยีนที่ต้องการและไม่ต้องการยังคงท้าทาย ยีนจะเปิดหรือปิดในกระบวนการทางชีวภาพต่างๆ เช่น การเจริญเติบโตของเซลล์ แกโนเจเนซีสและพัฒนาโรคการระบุและการโคลนยีน โดยแสดงเป็นขั้นตอนแรกและเป็นกลยุทธ์สำคัญที่จะสำรวจเหล่านี้ทางชีวภาพ processes4 . ตรวจวัดและแยกเฉพาะแสดงออกยีน , ความหลากหลายของวิธีการได้รับการพัฒนา ได้แก่ Differential Display PCR DNA fingerprinting การวิเคราะห์อนุกรมของการแสดงออกของยีน ( Sage ) , เวลาจริงปริมาณ PCR , ใช้การปราบปราม hybridization ( SSH )ิและช่วยจัดลำดับการทำงาน technologies5,6,7,8,9

Differential Display PCR เป็นวิธีการศึกษายีนควบคุมความไวสูง อย่างไรก็ตาม จะสร้างจำนวนมากของผลบวกปลอมและต้องใช้จำนวนมากของไพรเมอร์คู่ SSH เป็นวิธีลบที่นิยมมากและสามารถใช้งานเป็นชุด อย่างไรก็ตาม มี 2 ปัญหาที่อาจเกิดกับ SSH .