1. IntroductionIn recent years, miR

1. Introduction
In recent years, miRNA profiling for the identification of human body fluids and tissues has strongly inspired the field of forensic molecular biology [1], [2] and [3]. The so-called miRNome, the entirety of all miRNAs expressed at a given time point and under certain conditions, represents a unique cell signature which thereby enables the determination of its biological origin. Utilizing qPCR technology, which is characterized by high sensitivity and specificity, miRNA expression patterns can easily be evaluated. Nevertheless, to achieve accurate and reproducible data, non-biological variances in between examined sample sets and runs need to be corrected by using suitable and verified references which fit the experimental requirements for a specific setup. In the present study, we therefore determined the stability of 10 candidate references in a set of forensically relevant body fluids and skin cells by using the global mean normalization algorithm geNorm [4]. Identified genes were applied as normalizers for the analysis of cell type-specific target gene expression levels. Furthermore, the same data set was corrected independently with U6B, and the results of both approaches were compared to assess the impact of the chosen normalizers on the relative quantity of miRNA targets.

2. Material and methods
2.1. Samples

Blood, saliva, semen and skin samples were collected and stored dry on FTA cards or sterile cotton swabs. miRNA was extracted using the miRNeasy Mini kits (Qiagen) as quickly as possible after sample taking to prevent degradation. The quantity of RNA was determined using the NanoDrop 2000 UV/Vis spectrophotometer (Thermo Scientific).

2.2. Validation of endogenous controls

Expression of candidate references (miR26b, miR92, miR191, miR374, miR423, miR484, RNU24, RNU48, RNU44 and RNU47) was analyzed using the Fast SYBR® Green Master Mix with previously conducted cDNA synthesis of RNA samples using TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription kit (both Life Technologies). PCR efficiencies were calculated using LinRegPCR (2014.5) [5] and the most stable expressed genes were determined using geNorm. For the heterogeneous group of samples examined, the mean gene stability value M was increased to 1 before analyzing the data [6].

2.3. cDNA synthesis and qPCR of target-specific genes

Multiplexed cDNA synthesis was performed using the TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription kit for creating custom reverse transcription (RT) pools (Life Technologies). For this purpose, a RT primer pool was created consisting of individual RT primers for miR451 and miR16 (blood-specific), miR205 and miR658 (saliva-specific), miR10b and miR135b (semen-specific) and miR203 (skin-specific). All TaqMan® assays were run in triplicate.

2.4. Data analysis

LinRegPCR corrected qPCR data were normalized against the validated references (miR92 and miR374) and against the standard reference U6B using the software qbaseplus (Biogazelle). Finally, normalized relative quantities (NRQs) were compared.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

บทนำในปีล่าสุด เที่ยวรวบสำหรับเนื้อเยื่อและของเหลวในร่างกายมนุษย์ได้ขอแรงบันดาลใจด้านอณูชีววิทยานิติ [1], [2] และ [3] MiRNome เรียกว่า ทั้งหมดของ miRNAs ทั้งหมดที่แสดงในเวลาที่กำหนดชี้ และภายใต้เงื่อนไข แสดงลายเซ็นเฉพาะเซลล์จึงช่วยให้การกำหนดของชีวภาพ ใช้เทคโนโลยี qPCR ซึ่งมีลักษณะความไวสูงและมีความจำเพาะ รูปแบบนิพจน์เที่ยวสามารถสามารถประเมิน อย่างไรก็ตาม เพื่อให้ได้ข้อมูลที่ถูกต้อง และจำลอง ผลต่างชีวภาพในระหว่างการตรวจสอบตัวอย่างตั้ง และทำงานจำเป็นต้องแก้ไข โดยใช้การอ้างอิงที่เหมาะสม และตรวจสอบซึ่งพอดีกับความต้องการทดลองสำหรับการตั้งค่าเฉพาะ ในการศึกษาปัจจุบัน เราจึงถูกกำหนดเสถียรภาพของผู้อ้างอิง 10 ในชุดของของเหลวในร่างกายเกี่ยวข้อง forensically และเซลล์ผิว โดยใช้ geNorm อัลกอริทึมการฟื้นฟูหมายถึงทั่วโลก [4] ระบุยีนถูกนำไปใช้เป็น normalizers สำหรับการวิเคราะห์ระดับเซลล์เป้าหมายเฉพาะชนิดยีนแสดงออก นอกจากนี้ แก้ไขข้อมูลชุดเดียวกันกับ U6B อิสระ และผลลัพธ์ของทั้งสองวิธีได้เปรียบเทียบการประเมินผลกระทบของ normalizers ท่านของเที่ยวเป้าหมายปริมาณสัมพันธ์2. วัสดุและวิธีการ2.1. ตัวอย่างตัวอย่างเลือด น้ำลาย น้ำเชื้อ และผิวถูกรวบรวม และจัดเก็บแห้งบนบัตรเขตการค้าเสรีหรือฝ้ายที่ผ่านการฆ่าเชื้อ เที่ยวถูกสกัดใช้ชุด Mini miRNeasy (Qiagen) อย่างรวดเร็วหลังจากได้รับตัวอย่างเพื่อป้องกันการย่อยสลาย ปริมาณของ RNA ที่ถูกกำหนดโดยใช้ spectrophotometer NanoDrop 2000 รโฟ (เทอร์โมวิทยาศาสตร์)2.2 การตรวจสอบของตัวควบคุมภายนอกนิพจน์การอ้างอิงของผู้สมัคร (miR26b, miR92, miR191, miR374, miR423, miR484, RNU24, RNU48, RNU44 และ RNU47) ได้วิเคราะห์โดยใช้ SYBR เร็ว®สีเขียวหลักผสมกับ cDNA ก่อนหน้านี้ดำเนินการสังเคราะห์ RNA อย่างใช้ TaqMan ® MicroRNA กลับถอดชุด (ทั้งชีวิตเทคโนโลยี) คำนวณประสิทธิภาพการ PCR โดยใช้ LinRegPCR (2014.5) [5] และกำหนดยีนที่แสดงออกมีความเสถียรมากที่สุดโดยใช้ geNorm สำหรับกลุ่มแตกต่างกันของตัวอย่างที่ตรวจสอบ ยีนหมายถึงความมั่นคงค่า M เพิ่มขึ้น 1 ก่อนวิเคราะห์ข้อมูล [6]2.3. cDNA สังเคราะห์และ qPCR ของยีนเป้าหมายเฉพาะการสังเคราะห์ multiplexed cDNA ทำใช้ชุด TaqMan ® MicroRNA กลับถอดถอดรหัสย้อนกลับที่กำหนดเองในการสร้างสระว่ายน้ำ (RT) (ชีวิตเทคโนโลยี) สำหรับวัตถุประสงค์นี้ สระไพร RT ที่สร้างประกอบด้วยไพรเมอร์ RT แต่ละ miR451 และ miR16 (เลือดเฉพาะ), miR205 และ miR658 (เฉพาะน้ำลาย), miR10b และ miR135b (เฉพาะน้ำเชื้อ) และ miR203 (เฉพาะผิว) ทั้งหมด TaqMan ® assays ถูกเรียกใช้ลข้อ2.4. ข้อมูลวิเคราะห์LinRegPCR แก้ไข qPCR ข้อมูลได้ตามปกติ กับการตรวจสอบการอ้างอิง (miR92 และ miR374) และเทียบ กับมาตรฐานอ้างอิง U6B ใช้ qbaseplus ซอฟต์แวร์ (Biogazelle) ในที่สุด ปริมาณสัมพัทธ์มาตรฐาน (NRQs) ได้เปรียบเทียบ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

1. บทนำ
ในปีที่ผ่าน miRNA profiling สำหรับบัตรประจำตัวของของเหลวในร่างกายและเนื้อเยื่อของมนุษย์ได้รับแรงบันดาลใจอย่างยิ่งสาขาชีววิทยาโมเลกุลนิติวิทยาศาสตร์ [1], [2] และ [3] ที่เรียกว่า miRNome, ความสมบูรณ์ของ miRNAs ทั้งหมดแสดงที่จุดเวลาที่กำหนดและภายใต้เงื่อนไขบางอย่างแสดงให้เห็นถึงลายเซ็นที่ไม่ซ้ำกันซึ่งเซลล์จึงช่วยให้การกำหนดแหล่งกำเนิดทางชีวภาพของตน การใช้เทคโนโลยี qPCR ซึ่งโดดเด่นด้วยความไวและความจำเพาะสูง, miRNA รูปแบบการแสดงออกสามารถประเมินได้อย่างง่ายดาย อย่างไรก็ตามเพื่อให้เกิดข้อมูลที่ถูกต้องและแม่นยำแปรปรวนไม่ใช่ชีวภาพในระหว่างชุดตัวอย่างการตรวจสอบและการทำงานจะต้องมีการแก้ไขโดยใช้การอ้างอิงที่เหมาะสมและตรวจสอบซึ่งพอดีกับความต้องการของการทดลองสำหรับการติดตั้งเฉพาะ ในการศึกษาปัจจุบันเราจึงมุ่งมั่นที่มั่นคงของการอ้างอิง 10 ผู้สมัครที่อยู่ในชุดของที่เกี่ยวข้อง forensically ของเหลวในร่างกายและเซลล์ผิวโดยใช้ค่าเฉลี่ย geNorm ขั้นตอนวิธีการฟื้นฟูโลก [4] ยีนระบุถูกนำไปใช้เป็น normalizers สำหรับการวิเคราะห์เซลล์ชนิดเฉพาะระดับการแสดงออกของยีนเป้าหมาย นอกจากนี้ข้อมูลชุดเดียวกันได้รับการแก้ไขอย่างอิสระกับ U6B และผลของวิธีการทั้งสองที่ถูกเมื่อเทียบกับการประเมินผลกระทบของ normalizers ได้รับการแต่งตั้งในปริมาณญาติของเป้าหมาย miRNA ได้. 2 วัสดุและวิธีการ2.1 ตัวอย่างเลือดน้ำลายน้ำอสุจิและตัวอย่างผิวที่ถูกเก็บรวบรวมและจัดเก็บไว้แห้งบนบัตรเขตการค้าเสรีหรือฝ้าย swabs หมัน miRNA ถูกสกัดโดยใช้ชุด miRNeasy มินิ (Qiagen) ให้เร็วที่สุดเท่าที่เป็นไปได้หลังจากที่ตัวอย่างการป้องกันการเสื่อมสลาย ปริมาณของ RNA ถูกกำหนดโดยใช้ NanoDrop 2000 UV / Vis spectrophotometer (Thermo Scientific). 2.2 การตรวจสอบของการควบคุมภายนอกแสดงออกของผู้สมัครลำดับที่ (miR26b, miR92, miR191, miR374, miR423, miR484, RNU24, RNU48, RNU44 และ RNU47) คือการวิเคราะห์โดยใช้จานSYBR®กรีนโทผสมกับการดำเนินการก่อนหน้านี้การสังเคราะห์ cDNA ของกลุ่มตัวอย่างโดยใช้อาร์เอ็นเอTaqMan® ชุด microRNA ย้อนกลับถอดความ (ทั้งไลฟ์เทคโนโลยี) ประสิทธิภาพ PCR ถูกคำนวณโดยใช้ LinRegPCR (2,014.5) [5] และยีนที่แสดงความมีเสถียรภาพมากที่สุดได้รับการพิจารณาโดยใช้ geNorm สำหรับกลุ่มที่แตกต่างกันของกลุ่มตัวอย่างการตรวจสอบค่าความมั่นคงยีนเฉลี่ย M เพิ่มขึ้นเป็น 1 ก่อนที่จะวิเคราะห์ข้อมูล [6]. 2.3 การสังเคราะห์ยีนและ qPCR ของยีนเป้าหมายเฉพาะMultiplexed ยีนสังเคราะห์ได้รับการดำเนินการโดยใช้ชุดTaqMan® microRNA ย้อนกลับถอดความถอดความสำหรับการสร้างที่กำหนดเองย้อนกลับ (RT) สระว่ายน้ำ (ไลฟ์เทคโนโลยี) เพื่อจุดประสงค์นี้สระว่ายน้ำไพรเมอร์ RT ที่ถูกสร้างขึ้นประกอบด้วยไพรเมอร์ RT บุคคลสำหรับ miR451 และ miR16 (เลือดเฉพาะ) miR205 และ miR658 (น้ำลายเฉพาะ) miR10b และ miR135b (น้ำเชื้อที่เฉพาะเจาะจง) และ miR203 (ผิวเฉพาะ) ทั้งหมดตรวจTaqMan®วิ่งในเพิ่มขึ้นสามเท่า. 2.4 การวิเคราะห์ข้อมูลLinRegPCR แก้ไขข้อมูล qPCR เป็นปกติกับการตรวจสอบการอ้างอิง (miR92 และ miR374) และต่อ U6B มาตรฐานอ้างอิงใช้ qbaseplus ซอฟแวร์ (Biogazelle) สุดท้ายปกติปริมาณสัมพัทธ์ (NRQs) ถูกนำมาเปรียบเทียบ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

1 . แนะนำใน ปี ล่าสุด mirna โปรไฟล์สำหรับการระบุของของเหลวในร่างกายและเนื้อเยื่อได้ขอแรงบันดาลใจด้านอณูชีววิทยาทางนิติวิทยาศาสตร์ [ 1 ] , [ 2 ] และ [ 3 ] การ mirnome ที่เรียกว่าทั้งหมดทุก mirnas แสดงที่จุดที่กําหนดเวลาและภายใต้เงื่อนไขบางอย่าง ซึ่งเป็นเอกลักษณ์ จึงช่วยให้เซลล์เซ็นซึ่งการตัดสินใจของผู้ให้กำเนิดทางชีววิทยาของ การใช้เทคโนโลยี qpcr ซึ่งเป็นลักษณะความไวสูงและความจำเพาะ mirna การแสดงออกรูปแบบได้อย่างง่ายดายสามารถประเมิน อย่างไรก็ตาม เพื่อให้เกิดความถูกต้อง และข้อมูลชีวภาพ ซึ่งไม่ใช่ความแปรปรวนระหว่างการตรวจสอบตัวอย่างชุดและจะต้องได้รับการแก้ไขโดยการใช้ที่เหมาะสมและตรวจสอบการอ้างอิงที่เหมาะสมกับความต้องการทดลองสำหรับการตั้งค่าที่เฉพาะเจาะจง ในการศึกษา เราจึงกำหนดความมั่นคงของ 10 ผู้สมัครอ้างอิงในชุดของ forensically ของเหลวในร่างกายที่เกี่ยวข้องและเซลล์ผิวโดยการใช้ทั่วโลกหมายถึงบรรทัดฐาน genorm [ 4 ] การระบุยีนที่ถูกใช้เป็น normalizers สำหรับการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนในเซลล์ที่เฉพาะเจาะจงเป้าหมายระดับ นอกจากนี้ ข้อมูลชุดเดียวกันได้รับการแก้ไขอย่างอิสระกับ u6b และผลของทั้งสองวิธีเปรียบเทียบเพื่อศึกษาผลกระทบของการเลือก normalizers ที่ปริมาณสัมพัทธ์ของ mirna เป้าหมาย2 . วัสดุและวิธีการ2.1 . ตัวอย่างเลือด , น้ำลาย , น้ำอสุจิและหนังตัวอย่างและเก็บไว้แห้งบนบัตรหรือ swabs ฝ้าย เอฟทีเอ เป็นหมัน mirna ถูกสกัดโดยใช้ชุดมินิ mirneasy ( เพิ่ม ) ให้เร็วที่สุดหลังจากตัวอย่างการเพื่อป้องกันการย่อยสลาย ปริมาณ RNA ถูกกำหนดโดยใช้ nanodrop 2000 UV / VIS Spectrophotometer ( เทอร์โมวิทยาศาสตร์ )2.2 . การตรวจสอบภายในของการควบคุมการแสดงออกของการอ้างอิงของผู้สมัคร ( mir26b mir92 mir191 mir374 , , , , mir484 mir423 rnu24 rnu48 , , , , และ rnu44 rnu47 ) วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้®สีเขียว SYBR อย่างรวดเร็วต้นแบบผสมกับดีเอ็นเอการสังเคราะห์อาร์เอ็นเอตัวอย่างก่อนหน้านี้การใช้ taqman ® MIC กลับถอดชุด ( ทั้งชีวิต เทคโนโลยี ) เพิ่มประสิทธิภาพ ) คำนวณโดยใช้ linregpcr ( 2014.5 ) [ 5 ] และมีเสถียรภาพมากที่สุดแสดงออกยีนตัดสินใจใช้ genorm . สำหรับกลุ่มที่แตกต่างกันของตัวอย่างตรวจยีนหมายถึงค่าเสถียรภาพเพิ่มขึ้นเป็น 1 เมตร ก่อนการวิเคราะห์ข้อมูล [ 6 ]2.3 การสังเคราะห์ cDNA ของยีนที่เฉพาะเจาะจงและเป้าหมาย qpcrยีนสังเคราะห์มัลติเพลกซ์มีการใช้ taqman ® MIC ถอดความถอดความย้อนกลับย้อนกลับชุดสำหรับการสร้างที่กำหนดเอง ( RT ) สระว่ายน้ำ ( เทคโนโลยีกับชีวิต ) สำหรับวัตถุประสงค์นี้ ตัวสระ สร้างขึ้น ประกอบด้วย ไพรเมอร์รองพื้น RT และบุคคล mir451 mir16 ( เลือดที่เฉพาะเจาะจง ) และ mir205 mir658 ( น้ำลายที่เฉพาะเจาะจง ) และ mir10b mir135b ( น้ำเชื้อที่เฉพาะเจาะจง ) และ mir203 ( เฉพาะผิว ) วิธี taqman ®ทั้งหมดถูกเรียกทั้งสามใบ2.4 . การวิเคราะห์ข้อมูลแก้ไขข้อมูล linregpcr qpcr เป็นปกติกับตำแหน่งอ้างอิง ( mir92 และ mir374 ) และกับ u6b อ้างอิงมาตรฐานการใช้ซอฟต์แวร์ qbaseplus ( biogazelle ) ในที่สุด ปกติปริมาณสัมพัทธ์ ( nrqs ) เปรียบเทียบ