In this study, we have examined whe

In this study, we have examined whether reducing the size of the adenovirus vector, through reduction in the length of the fibre protein, could result in enhanced delivery and distribution to muscle after systemic delivery. In general, reduction in the size of the fibre protein, with or without a polylysine motif to redirect virus binding to cell surface heparan sulphate proteoglycans, had little effect on enhancing muscle cell transduction following systemic or localised delivery. Previous studies have suggested that the Ad2 fibre protein, which is very similar to the Ad5 fibre protein, may naturally bend, which would effectively reduce the overall diameter of Ad5LlacZ to closer to that of Ad5SlacZ. The Ad2 (and Ad5) fibre protein shaft region contains 22 β-repeats. The twenty-first repeat, located just before the knob domain, is a non-consensus repeat that may allow for a small degree of bending between knob and shaft (van Raaij et al., 1999). More importantly, the third β-repeat is also non-consensus, and may provide significant flexibility to the fibre protein. In cryo-EM images, Ad2 fibre appears “kinked” in this approximate region (Chiu et al., 2001 and Stewart et al., 1997). Replacing these flexible repeats with the corresponding regions of the more rigid fibre from Ad37 abolished infection suggesting that bending of fibre does occur naturally and is important for Ad5 infection (Wu et al., 2003). Molecular modelling showed that the fibre protein would need to bend at an angle of at least ~70° to allow proper alignment of the RGD motif contained in penton protein with surface exposed integrins (Wu et al., 2003). If fibre is capable of folding back towards the body of the Ad virion at such an acute angle, it would reduce the distance that the Ad5 fibre protrudes from the main body of the Ad virion from 37 nm to only ~16 nm. Short fibre shaft proteins, such as that of Ad9 used in this study, are predicted to be rigid (Chiu et al., 2001). Thus, the effective difference in length of the short and long fibre proteins used in this study may not be dramatically different, which could contribute to the similar transduction profiles observed for these viruses.

Another factor that could contribute to the similar transduction efficiencies of Ad5SlacZ and Ad5LlacZ may be the impact of the negative charge conferred on the virion by the Ad5 hexon protein. As discussed by Shayakhmetov and Lieber (2000), the surface exposed hypervariable regions of hexon from Ad serotypes with naturally short fibre proteins tend to be neutral or positively charged (Crawford-Miksza and Schnurr, 1996), allowing for the relatively close apposition of the Ad virion and negatively-charged cell membrane. In contrast, the hypervariable regions on the Ad5 hexon have a strong negative charge that may act as a significant repulsive force when combined with the short fibre protein, compromising efficient interaction of virus with the cell (Shayakhmetov and Lieber, 2000).

As others have also shown (Guo et al., 1996 and Worgall et al., 1997), we observed that regardless of the route of administration, Ad naturally preferentially accumulates in the liver, leading to high level gene expression in this tissue. Many of the successes in preclinical studies using Ad-mediated gene transfer involve diseases of the liver or use the liver as a protein-production factory for secreted protein (Brunetti-Pierri and Ng, 2011). Ad vectors have a natural tropism for liver and can persist and express a transgene for greater than 7 years after a single IV injection in non-human primates (Brunetti-Pierri et al., 2013). However, as demonstrated in this study, use of Ad vectors to target gene expression to alternative tissues remains a challenging aspect of Ad vector development.

Materials and methods
Cell culture
All cell culture media and reagents were obtained from Invitrogen (Burlington, ON). 293 (Graham et al., 1977), 293N3S (Graham, 1987) and A549 (American Type Culture Collection) cells were grown in monolayer in minimum essential medium (MEM) supplemented with 2 mM Glutamax, 0.1 mg/ml streptomycin and 100 U/ml penicillin, and 10% foetal bovine serum (FBS). MN1 cells (Salazar-Grueso et al., 1991) were maintained in Dulbecco׳s modified Eagle׳s medium (DMEM, Sigma-Aldrich) supplemented with 10% FBS, 2 mM l-Glutamax, 0.1 mg/ml streptomycin and 100 U/ml penicillin, and were a kind gift of Dr. Jocelyn Cote (University of Ottawa). C2C12 cells (Blau et al., 1985) were grown in DMEM supplemented with 10% FBS, 2 mM l-glutamine, 0.1 mg/ml streptomycin and 100 U/ml penicillin, and confluent plates were switched to medium supplemented with 2% horse serum to induce differentiation. C2C12 cells were allowed to differentiate for 4 days before infection.

Generation and propagation of viruses
All of the viruses used in this study are deleted of the Ad5 early region 1 (E1) and E3 regions, and were generated and propagated using standard techniques (Ross and Parks, 2009). A plasmid containing an Ad5 genome encoding a modified fibre protein with the Ad9 shaft and Ad5 knob was obtained from Drs. Dmitry Shayakhmetov and Andre Lieber (University of Washington) (Shayakhmetov and Lieber, 2000). The modified fibre gene was subcloned into an E1/E3-deleted Ad genomic plasmid, pRP2014 (Christou and Parks, 2011 and Poulin et al., 2010), and a cytomegalovirus immediate early enhancer/promoter-lacZ expression cassette (pCA38, (Addison et al., 1997)) was introduced to replace the E1-deletion, using RecA-mediated recombination (Chartier et al., 1996), as detailed previously (Willemsen, 2009), and designated Ad5SlacZ. To introduce the poly-lysine motif into the H–I loop of the knob domain of the short fibre, a BglII/PstI fragment containing part of the knob domain was first subcloned into pSP72 (Promega). This plasmid was PCR amplified with the synthetic oligonucleotides 5′ ata gcc ggc aaa aag aaa aag aaa aag aaa gga gca cca agt gca tac tct atg tca ttt tca tg 3′ and 5′ taa gcc ggc agt tgt gtc tcc tgt ttc ctg tgt acc g 3′, which prime in opposite directions around the plasmid, creating a linear molecule with compatible NgoMIV ends. Recircularization of the plasmid creates a molecule encoding a short fibre knob domain that has been changed from amino acids GDTT-PSAY to GDTT-AGKKKKKKKGA-PSAY. The modified fibre protein was recombined into pRP2014 to replace the native Ad5 fibre, and the CMV-lacZ expression cassette added to replace the E1-deletion, and designated Ad5SpKlacZ. Recombination of pCA38 and pRP2014 generated the control virus Ad5LlacZ. Particle counts were used to determine the titre of the vector; an aliquot of virus was diluted in assay buffer (1 mM EDTA, 0.1 SDS), heated for 20 min at 65 °C, and the absorbance determined as 1 A260=1.1×1012 particles.

Immunoblot analysis
To examine the level of incorporation of the modified fibre proteins, we assayed dilutions of the virus stock for hexon (loading control) and fibre signal by immunoblot. Viruses were diluted to 109 viral particles in a total of 10 μl of PBS, and combined with equal volume of 2× SDS/PAGE protein loading buffer (62.5 mM Tris HCl pH 6.8, 25% glycerol, 2% SDS, 0.01% bromophenol blue, 5% β-mercaptoethanol). Samples were boiled for 5 min, and separated by electrophoresis on a 12% SDS–polyacrylamide gel. The separated proteins were transferred to a polyvinylidene difluoride membrane (Immobilon-P, Millipore) and the membrane was probed with an antibody raised against all Ad capsid proteins (ab6982, 1/10,000; Abcam) or fibre (MS-1027-P0, 1/1000, NeoMarkers). Binding of the primary antibody was detected using a goat or mouse anti-rabbit secondary antibody conjugated to horseradish peroxidase (BioRad) and visualised by chemiluminescence reaction (Thermo Scientific ECL western blotting substrate) and autoradiography.

Infection assays in vitro
Triplicate 35 mm dishes of A549, MN1, or undifferentiated or differentiated C2C12 were seeded at a density of 0.3×106 cells per dish. The next day cells were infected at an multiplicity of infection (MOI) of 10 with Ad5LlacZ, Ad5SlacZ or Ad5SpKlacZ (or mock infected), except for one series of C2C12 cells, which was switched to differentiation medium (DMEM+2%HS), and infected after 4 days of differentiation. Crude protein extracts were prepared from the infected cells 24 h later by lysing the cells with 175 μl of Lysis Solution (Applied Biosystems). The samples were centrifuged at 9400g for 2 min at room temperature (RT) and the supernatant collected and stored at −80 °C. The samples were thawed and assayed for β-galactosidase (β-gal) activity using a commercial chemiluminescence assay (Galacto-star, Applied Biosystems) and a 20/20n luminometer (Turner BioSystems).

In vivo injections and tissue harvest
All animal experiments were approved by and performed according to the guidelines set by the Animal Research Ethics Board at the University of Ottawa (Ottawa, ON, Canada). Six to eight week-old C57Bl/6J mice (Charles River) were injected intravenously (IV) through the tail vein or intraperitoneally (IP) with 100 μl virus or PBS, or anaesthetised with halothane, and injected with virus or PBS in a volume of 25–30 μl in both the right and left tibialis anterior (TA) muscles. Three viral concentrations were used: 5×1011 VP/kg (low), 1×1012 VP/kg (middle) and 5×1012 VP/kg (high). One, two or three days later (as indicated in the specific experiment described below), the mice were euthanized with 100 μl euthanyl (CDMV Inc., Quebec City, QC). For determining the level of β-gal activity, liver and TA muscles from treated animals were removed and immediately frozen in liquid nitrogen and stored at −80 °C until processed as described below. For immunohistochemistry, TA muscles and the spinal cord were removed and immediately incubated in 2% paraformaldehyde (PFA) for 1 h, washed 3 times with PBS, and then incubated in 30% sucrose in PBS for 24–72 h. Tissues were equilibrate

Another factor that could contribute to the similar transduction efficiencies of Ad5SlacZ and Ad5LlacZ may be the impact of the negative charge conferred on the virion by the Ad5 hexon protein. As discussed by Shayakhmetov and Lieber (2000), the surface exposed hypervariable regions of hexon from Ad serotypes with naturally short fibre proteins tend to be neutral or positively charged (Crawford-Miksza and Schnurr, 1996), allowing for the relatively close apposition of the Ad virion and negatively-charged cell membrane. In contrast, the hypervariable regions on the Ad5 hexon have a strong negative charge that may act as a significant repulsive force when combined with the short fibre protein, compromising efficient interaction of virus with the cell (Shayakhmetov and Lieber, 2000).

As others have also shown (Guo et al., 1996 and Worgall et al., 1997), we observed that regardless of the route of administration, Ad naturally preferentially accumulates in the liver, leading to high level gene expression in this tissue. Many of the successes in preclinical studies using Ad-mediated gene transfer involve diseases of the liver or use the liver as a protein-production factory for secreted protein (Brunetti-Pierri and Ng, 2011). Ad vectors have a natural tropism for liver and can persist and express a transgene for greater than 7 years after a single IV injection in non-human primates (Brunetti-Pierri et al., 2013). However, as demonstrated in this study, use of Ad vectors to target gene expression to alternative tissues remains a challenging aspect of Ad vector development.

Materials and methods
Cell culture
All cell culture media and reagents were obtained from Invitrogen (Burlington, ON). 293 (Graham et al., 1977), 293N3S (Graham, 1987) and A549 (American Type Culture Collection) cells were grown in monolayer in minimum essential medium (MEM) supplemented with 2 mM Glutamax, 0.1 mg/ml streptomycin and 100 U/ml penicillin, and 10% foetal bovine serum (FBS). MN1 cells (Salazar-Grueso et al., 1991) were maintained in Dulbecco׳s modified Eagle׳s medium (DMEM, Sigma-Aldrich) supplemented with 10% FBS, 2 mM l-Glutamax, 0.1 mg/ml streptomycin and 100 U/ml penicillin, and were a kind gift of Dr. Jocelyn Cote (University of Ottawa). C2C12 cells (Blau et al., 1985) were grown in DMEM supplemented with 10% FBS, 2 mM l-glutamine, 0.1 mg/ml streptomycin and 100 U/ml penicillin, and confluent plates were switched to medium supplemented with 2% horse serum to induce differentiation. C2C12 cells were allowed to differentiate for 4 days before infection.

Generation and propagation of viruses
All of the viruses used in this study are deleted of the Ad5 early region 1 (E1) and E3 regions, and were generated and propagated using standard techniques (Ross and Parks, 2009). A plasmid containing an Ad5 genome encoding a modified fibre protein with the Ad9 shaft and Ad5 knob was obtained from Drs. Dmitry Shayakhmetov and Andre Lieber (University of Washington) (Shayakhmetov and Lieber, 2000). The modified fibre gene was subcloned into an E1/E3-deleted Ad genomic plasmid, pRP2014 (Christou and Parks, 2011 and Poulin et al., 2010), and a cytomegalovirus immediate early enhancer/promoter-lacZ expression cassette (pCA38, (Addison et al., 1997)) was introduced to replace the E1-deletion, using RecA-mediated recombination (Chartier et al., 1996), as detailed previously (Willemsen, 2009), and designated Ad5SlacZ. To introduce the poly-lysine motif into the H–I loop of the knob domain of the short fibre, a BglII/PstI fragment containing part of the knob domain was first subcloned into pSP72 (Promega). This plasmid was PCR amplified with the synthetic oligonucleotides 5′ ata gcc ggc aaa aag aaa aag aaa aag aaa gga gca cca agt gca tac tct atg tca ttt tca tg 3′ and 5′ taa gcc ggc agt tgt gtc tcc tgt ttc ctg tgt acc g 3′, which prime in opposite directions around the plasmid, creating a linear molecule with compatible NgoMIV ends. Recircularization of the plasmid creates a molecule encoding a short fibre knob domain that has been changed from amino acids GDTT-PSAY to GDTT-AGKKKKKKKGA-PSAY. The modified fibre protein was recombined into pRP2014 to replace the native Ad5 fibre, and the CMV-lacZ expression cassette added to replace the E1-deletion, and designated Ad5SpKlacZ. Recombination of pCA38 and pRP2014 generated the control virus Ad5LlacZ. Particle counts were used to determine the titre of the vector; an aliquot of virus was diluted in assay buffer (1 mM EDTA, 0.1 SDS), heated for 20 min at 65 °C, and the absorbance determined as 1 A260=1.1×1012 particles.

Immunoblot analysis
To examine the level of incorporation of the modified fibre proteins, we assayed dilutions of the virus stock for hexon (loading control) and fibre signal by immunoblot. Viruses were diluted to 109 viral particles in a total of 10 μl of PBS, and combined with equal volume of 2× SDS/PAGE protein loading buffer (62.5 mM Tris HCl pH 6.8, 25% glycerol, 2% SDS, 0.01% bromophenol blue, 5% β-mercaptoethanol). Samples were boiled for 5 min, and separated by electrophoresis on a 12% SDS–polyacrylamide gel. The separated proteins were transferred to a polyvinylidene difluoride membrane (Immobilon-P, Millipore) and the membrane was probed with an antibody raised against all Ad capsid proteins (ab6982, 1/10,000; Abcam) or fibre (MS-1027-P0, 1/1000, NeoMarkers). Binding of the primary antibody was detected using a goat or mouse anti-rabbit secondary antibody conjugated to horseradish peroxidase (BioRad) and visualised by chemiluminescence reaction (Thermo Scientific ECL western blotting substrate) and autoradiography.

Infection assays in vitro
Triplicate 35 mm dishes of A549, MN1, or undifferentiated or differentiated C2C12 were seeded at a density of 0.3×106 cells per dish. The next day cells were infected at an multiplicity of infection (MOI) of 10 with Ad5LlacZ, Ad5SlacZ or Ad5SpKlacZ (or mock infected), except for one series of C2C12 cells, which was switched to differentiation medium (DMEM+2%HS), and infected after 4 days of differentiation. Crude protein extracts were prepared from the infected cells 24 h later by lysing the cells with 175 μl of Lysis Solution (Applied Biosystems). The samples were centrifuged at 9400g for 2 min at room temperature (RT) and the supernatant collected and stored at −80 °C. The samples were thawed and assayed for β-galactosidase (β-gal) activity using a commercial chemiluminescence assay (Galacto-star, Applied Biosystems) and a 20/20n luminometer (Turner BioSystems).

In vivo injections and tissue harvest
All animal experiments were approved by and performed according to the guidelines set by the Animal Research Ethics Board at the University of Ottawa (Ottawa, ON, Canada). Six to eight week-old C57Bl/6J mice (Charles River) were injected intravenously (IV) through the tail vein or intraperitoneally (IP) with 100 μl virus or PBS, or anaesthetised with halothane, and injected with virus or PBS in a volume of 25–30 μl in both the right and left tibialis anterior (TA) muscles. Three viral concentrations were used: 5×1011 VP/kg (low), 1×1012 VP/kg (middle) and 5×1012 VP/kg (high). One, two or three days later (as indicated in the specific experiment described below), the mice were euthanized with 100 μl euthanyl (CDMV Inc., Quebec City, QC). For determining the level of β-gal activity, liver and TA muscles from treated animals were removed and immediately frozen in liquid nitrogen and stored at −80 °C until processed as described below. For immunohistochemistry, TA muscles and the spinal cord were removed and immediately incubated in 2% paraformaldehyde (PFA) for 1 h, washed 3 times with PBS, and then incubated in 30% sucrose in PBS for 24–72 h. Tissues were equilibrate

0/5000

จาก: -

เป็น: -

ผลลัพธ์ (ไทย) 1: [สำเนา]

คัดลอก!

ในการศึกษานี้ เราได้ตรวจสอบว่าการลดขนาดของเวกเตอร์ adenovirus โดยลดความยาวของเส้นใยโปรตีน อาจทำในส่งที่เพิ่มขึ้นและกระจายไปยังกล้ามเนื้อหลังจากการจัดระบบ ทั่วไป ลดขนาดของเส้นใยโปรตีน มี หรือไม่ มีแปลน polylysine ไวรัสรวมถึงเซลล์ผิว heparan ซัลเฟต proteoglycans การเปลี่ยนเส้นทางได้ผลน้อยในการเสริมสร้างกล้ามเนื้อเซลล์ transduction ขั้นไหน หรือระบบการจัดส่ง การศึกษาก่อนหน้านี้ได้แนะนำว่า Ad2 เส้นใยโปรตีน ซึ่งจะคล้ายกับเส้นใยโปรตีน Ad5 อาจธรรมชาติงอ ซึ่งจะมีประสิทธิภาพลดขนาดโดยรวมของ Ad5LlacZ ให้ใกล้ชิดกับ Ad5SlacZ Ad2 (และ Ad5) เส้นใยโปรตีนเพลาภูมิภาคประกอบด้วย 22 β-ทำซ้ำ ยี่สิบแรกซ้ำ อยู่ก่อนโดเมนกิ๊ป มีซ้ำไม่มีมติที่อาจทำให้ตัวเล็กดัดระหว่างกิ๊ปและเพลา (แวน Raaij et al., 1999) ที่สำคัญ β-ซ้ำสามก็ไม่ช่วย และอาจมีความยืดหยุ่นอย่างมีนัยสำคัญในโปรตีนเส้นใย ในภาพ cryo EM ไฟเบอร์ Ad2 แล้ว "kinked" ในภูมิภาคนี้โดยประมาณ (Chiu et al., 2001 และสจ๊วตและ al., 1997) แทนความยืดหยุ่นเหล่านี้ซ้ำกับภูมิภาคที่สอดคล้องกันของเส้นใยที่เข้มงวดมากขึ้นจากการติดเชื้อ Ad37 ยุติแนะนำว่า ดัดของเส้นใยเกิดขึ้นตามธรรมชาติ และมีความสำคัญสำหรับเชื้อ Ad5 (Wu et al., 2003) แบบจำลองโมเลกุลพบว่า โปรตีนเส้นใยจะต้องงอที่มุมน้อย ~ 70° ให้จัดตำแหน่งที่เหมาะสมของแปลน RGD อยู่ในโปรตีน penton ด้วยผิวสัมผัส integrins (Wu et al., 2003) หากเส้นใยมีความสามารถในการพับกลับสู่ร่างกายของ virion โฆษณาดังกล่าวเป็นมุมเฉียบพลัน มันจะช่วยลดระยะที่เส้นใย Ad5 protrudes จากบอดี้ของ virion โฆษณาจาก 37 nm ถึงเฉพาะ ~ 16 nm เส้นใยสั้นก้านโปรตีน เช่นที่ใช้ในการศึกษานี้ Ad9 คาดว่า จะเป็นงวด (Chiu et al., 2001) ดังนั้น ความแตกต่างที่มีประสิทธิภาพในระยะสั้น และยาวเส้นใยโปรตีนที่ใช้ในการศึกษานี้ไม่ได้แตกต่างอย่างมาก ซึ่งอาจนำไปสู่โพรไฟล์ transduction คล้ายที่พบในไวรัสเหล่านี้ปัจจัยอื่นที่อาจนำไปสู่ประสิทธิภาพ transduction คล้ายของ Ad5SlacZ และ Ad5LlacZ อาจมีผลกระทบของประจุลบใน virion ที่ปรึกษา โดยโปรตีน hexon Ad5 ตามที่อธิบายไว้ โดย Shayakhmetov และ Lieber (2000), พื้นผิวสัมผัส hypervariable แคว้น hexon จากโฆษณา serotypes ด้วยโปรตีนเส้นใยสั้นตามธรรมชาติมีแนวโน้มที่จะเป็นกลาง หรือคิดค่าธรรมเนียมบวก (ครอฟอร์ด Miksza และ Schnurr, 1996), การ apposition ค่อนข้างปิดโฆษณา virion และคิดในเชิงลบเซลล์เมมเบรน ในทางตรงกันข้าม ภูมิภาค hypervariable บน Ad5 hexon มีประจุลบแข็งแรงซึ่งอาจทำหน้าที่เป็นกองทัพ repulsive อย่างมีนัยสำคัญเมื่อรวมกับโปรตีนเส้นใยสั้น สูญเสียประสิทธิภาพการโต้ตอบระหว่างไวรัสกับเซลล์ (Shayakhmetov และ Lieber, 2000)ผู้อื่นได้แสดง (กัว et al., 1996 และ Worgall และ al., 1997), เราสังเกตว่า ไม่ว่าเส้นทางของการจัดการ โฆษณาธรรมชาติโน้ตสะสมในตับ นำไปสูงระดับยีนในเนื้อเยื่อนี้ ความสำเร็จในการศึกษา preclinical ใช้ถ่ายโอนยีน mediated โฆษณามากมายเกี่ยวข้องกับโรคตับ หรือใช้ตับเป็นโรงงานผลิตโปรตีนโปรตีน secreted (Brunetti-Pierri และ Ng, 2011) โฆษณาเวกเตอร์มีการเบนของพืชธรรมชาติสำหรับตับ และสามารถคงอยู่ และแสดง transgene สำหรับมากกว่า 7 ปีหลังจากการฉีด IV เดียวใน primates ไม่ใช่มนุษย์ (Brunetti Pierri et al., 2013) อย่างไรก็ตาม ดังที่แสดงในการศึกษานี้ ใช้โฆษณาเวกเตอร์การยีนเป้าหมายเพื่อทดแทนเนื้อเยื่อยังคง กว้างท้าทายของเวกเตอร์โฆษณาวัสดุและวิธีการเพาะเลี้ยงเซลล์สื่อวัฒนธรรมเซลล์และ reagents ทั้งหมดได้รับมาจาก Invitrogen (เบอร์ลิงตัน ON) 293 (เกรแฮม et al., 1977), 293N3S (แกรแฮม 1987) และเซลล์ (อเมริกันวัฒนธรรมคอลเลกชันชนิด) ถูกปลูก monolayer ในกลางจำเป็นต่ำสุด (MEM) เสริม ด้วย 2 มม. Glutamax, streptomycin 0.1 mg/ml และ 100 U/ml ยาเพนนิซิลลิน และ 10% foetal วัวซีรั่ม (FBS) A549 เซลล์ MN1 (Salazar Grueso et al., 1991) ถูกจัดเก็บอยู่ใน Dulbecco׳s ปรับเปลี่ยนสื่อ Eagle׳s (DMEM ซิก Aldrich) เสริม ด้วย 10% FBS, l-Glutamax มม. 2, streptomycin 0.1 mg/ml และ 100 U/ml ยา เพนนิซิลลิน และของขวัญประเภทของดร. Jocelyn โกตดิ (มหาวิทยาลัยออตตาวา) C2C12 เซลล์ (Blau และ al., 1985) ได้เติบโตขึ้นใน DMEM เสริม ด้วย 10% FBS, 2 มม. l glutamine, streptomycin 0.1 mg/ml และ 100 U/ml ยา เพนนิซิลลิน และแผ่น confluent ถูกสลับไปยังสื่อเสริม ด้วยเซรั่มม้า 2% เพื่อก่อให้เกิดการสร้างความแตกต่าง เซลล์ C2C12 ได้รับอนุญาตให้แยกความแตกต่างสำหรับ 4 วันก่อนที่จะติดเชื้อการสร้างและการแพร่กระจายของไวรัสAll of the viruses used in this study are deleted of the Ad5 early region 1 (E1) and E3 regions, and were generated and propagated using standard techniques (Ross and Parks, 2009). A plasmid containing an Ad5 genome encoding a modified fibre protein with the Ad9 shaft and Ad5 knob was obtained from Drs. Dmitry Shayakhmetov and Andre Lieber (University of Washington) (Shayakhmetov and Lieber, 2000). The modified fibre gene was subcloned into an E1/E3-deleted Ad genomic plasmid, pRP2014 (Christou and Parks, 2011 and Poulin et al., 2010), and a cytomegalovirus immediate early enhancer/promoter-lacZ expression cassette (pCA38, (Addison et al., 1997)) was introduced to replace the E1-deletion, using RecA-mediated recombination (Chartier et al., 1996), as detailed previously (Willemsen, 2009), and designated Ad5SlacZ. To introduce the poly-lysine motif into the H–I loop of the knob domain of the short fibre, a BglII/PstI fragment containing part of the knob domain was first subcloned into pSP72 (Promega). This plasmid was PCR amplified with the synthetic oligonucleotides 5′ ata gcc ggc aaa aag aaa aag aaa aag aaa gga gca cca agt gca tac tct atg tca ttt tca tg 3′ and 5′ taa gcc ggc agt tgt gtc tcc tgt ttc ctg tgt acc g 3′, which prime in opposite directions around the plasmid, creating a linear molecule with compatible NgoMIV ends. Recircularization of the plasmid creates a molecule encoding a short fibre knob domain that has been changed from amino acids GDTT-PSAY to GDTT-AGKKKKKKKGA-PSAY. The modified fibre protein was recombined into pRP2014 to replace the native Ad5 fibre, and the CMV-lacZ expression cassette added to replace the E1-deletion, and designated Ad5SpKlacZ. Recombination of pCA38 and pRP2014 generated the control virus Ad5LlacZ. Particle counts were used to determine the titre of the vector; an aliquot of virus was diluted in assay buffer (1 mM EDTA, 0.1 SDS), heated for 20 min at 65 °C, and the absorbance determined as 1 A260=1.1×1012 particles.วิเคราะห์ Immunoblotตรวจสอบระดับของการประสานของโปรตีนเส้นใยปรับเปลี่ยน เรา assayed dilutions หุ้นไวรัส hexon (โหลดควบคุม) และสัญญาณไฟเบอร์ โดย immunoblot ไวรัสถูกผสมกับอนุภาคไวรัส 109 ในทั้งหมด 10 μl ของ PBS และรวมกับระดับเสียงเท่ากับ 2 × SDS/หน้า โปรตีนโหลดบัฟเฟอร์ (62.5 มม.ทริสเรทติ้ง HCl pH 6.8 กลีเซอร 25%, 2% SDS, 0.01% bromophenol บลู 5% β-mercaptoethanol) ตัวอย่างมีต้มสำหรับ 5 นาที และคั่น ด้วย electrophoresis ใน 12% SDS – polyacrylamide เจ โปรตีนที่แยกได้โอนย้ายไปที่เยื่อหุ้ม difluoride polyvinylidene (Immobilon P มาก) และเมมเบรนจะถูกพิสูจน์ ด้วยแอนติบอดีที่ขึ้นกับโปรตีน capsid โฆษณาทั้งหมด (ab6982, 1/10000 Abcam) หรือเส้นใย (MS-1027-P0, 1/1000, NeoMarkers) ผูกของแอนติบอดีหลักพบใช้แพะ หรือเมาส์กระต่ายป้องกันรองแอนติบอดีกลวงเพื่อ horseradish peroxidase (BioRad) และ visualised โดย autoradiography chemiluminescence ปฏิกิริยา (เทอร์โม ECL วิทยาศาสตร์ตะวันตก blotting วิธีพื้นผิว)การเพาะเลี้ยงเชื้อ assaysจาน 35 มม. triplicate A549, MN1 หรือ undifferentiated หรือสังเกต C2C12 ถูก seeded ที่ความหนาแน่นของ 0.3 × 106 เซลล์ต่อจาน เซลล์วันถัดไปติดเชื้อที่มีมากมายหลายหลากของเชื้อ (อย) 10 กับ Ad5LlacZ, Ad5SlacZ หรือ Ad5SpKlacZ (หรือจำลองสินค้ารวมติด), ยกเว้นเซลล์ C2C12 หนึ่งชุดซึ่งสร้างความแตกต่างปานกลางสลับ (DMEM + 2% HS), และการติดเชื้อหลังจาก 4 วันของการสร้างความแตกต่าง สารสกัดจากโปรตีนหยาบถูกเตรียมจากเซลล์ติดเชื้อ 24 h ในภายหลัง โดย lysing เซลล์กับ 175 μl Lysis โซลูชัน (Biosystems ใช้) ตัวอย่างถูก centrifuged ที่ 9400g 2 นาทีที่อุณหภูมิห้อง (RT) และ supernatant รวบรวม และจัดเก็บไว้ที่ −80 องศาเซลเซียส ตัวอย่างถูก thawed และ assayed สำหรับกิจกรรมβ-galactosidase (β-gal) ใช้ทดสอบ chemiluminescence พาณิชย์ (ดาว Galacto, Biosystems ใช้) และ luminometer 20/20n (Turner BioSystems)ฉีดในสัตว์ทดลองและการเก็บเกี่ยวเนื้อเยื่อสัตว์ทดลองทั้งหมดได้อนุมัติ และดำเนินการตามแนวทางที่กำหนด โดยคณะกรรมการจริยธรรมวิจัยสัตว์ที่ของที่นี่ (ออตตาวา ON แคนาดา) หกถึงแปดสัปดาห์เก่า C57Bl/6J หนู (แม่น้ำชาร์ลส์) ถูกฉีด intravenously (IV) ผ่านหลอดเลือดดำหาง หรือ intraperitoneally (IP) ด้วย μl ไวรัสหรือ PBS, 100 หรือ anaesthetised กับ halothane และฉีดไวรัสหรือ PBS ปริมาณของ μl 25 – 30 ในทั้งด้านขวา และซ้ายแอนทีเรียร์ (TA) กล้ามเนื้อ tibialis ใช้ความเข้มข้นไวรัส 3: 5 × 1011 VP/kg (ต่ำ), 1 × 1012 VP/kg (กลาง) และ 5 × 1012 VP/kg (สูง) หนึ่ง สอง หรือสามวันภายหลัง (ตามระบุในทดลองเฉพาะที่อธิบายไว้ด้านล่าง), เมาส์มี euthanized กับ euthanyl μl 100 (CDMV Inc. ควิเบก QC) ในการกำหนดระดับของกิจกรรมβ gal ตับและกล้ามเนื้อตาจากสัตว์บำบัดถูกเอาออกทันทีแช่แข็งในไนโตรเจนเหลว และเก็บไว้ที่ −80 ° C จนกว่าจะดำเนินการตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง Equilibrate immunohistochemistry กล้ามเนื้อตา และสันหลัง ถูกเอาออก และ incubated ใน paraformaldehyde 2% (รับ) ทันทีสำหรับ h 1 ล้าง 3 ครั้ง ด้วย PBS แล้ว incubated ใน 30% ซูโครสใน PBS สำหรับเนื้อเยื่อ h. 24 – 72 ได้

การแปล กรุณารอสักครู่..

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:[สำเนา]

คัดลอก!

การแปล กรุณารอสักครู่..

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:[สำเนา]

คัดลอก!

ในการศึกษาครั้งนี้ได้มีการตรวจสอบว่า การลดขนาดของเวกเตอร์อะดิโนไวรัส ผ่านการลดความยาวของเส้นใยโปรตีน อาจมีผลในการเพิ่มและการกระจายไปยังกล้ามเนื้อหลังจากจัดส่งระบบ โดยทั่วไป การลดขนาดของเส้นใยโปรตีน มีหรือไม่มี polylysine แรงจูงใจที่จะเปลี่ยนเส้นทางไวรัสผูกพันกับเซลล์ผิว heparan proteoglycans ซัลเฟต ,ไปมีผลต่อการเสริมสร้างเซลล์กล้ามเนื้อดังต่อไปนี้ผ่านระบบ หรือแค่ส่ง การศึกษาก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่า ad2 เส้นใยโปรตีน ซึ่งจะคล้ายกับเส้นใยโปรตีนธรรมชาติ ad5 อาจโค้งซึ่งจะได้อย่างมีประสิทธิภาพลดขนาดโดยรวมของ ad5llacz ใกล้ชิดที่ ad5slacz . การ ad2 ( และ ad5 ) ภูมิภาคเพลาโปรตีนเส้นใยประกอบด้วย 22 บีตา - วนกลับมาที่เดิมย้ำ 21 ตั้งอยู่เพียงก่อนที่ลูกบิด โดเมน เป็นฉันทามติที่ไม่ซ้ำอาจอนุญาตให้ระดับเล็กของลูกบิด และดัดระหว่างเพลา ( รถตู้ raaij et al . , 1999 ) ที่สำคัญที่สามบีตา - ย้ำยังไม่เอกฉันท์ และอาจมีความยืดหยุ่นอย่างมีนัยสำคัญเพื่อเส้นใยโปรตีน แช่แข็งมันภาพ ad2 เส้นใยปรากฏ " kinked " ในภูมิภาคนี้ประมาณ ( Chiu et al . ,2001 และสจ๊วต et al . , 1997 ) การทำซ้ำยืดหยุ่นเหล่านี้ที่สอดคล้องกับภูมิภาคของเส้นใยแข็งมากขึ้น จาก ad37 ยกเลิกการติดเชื้อบอกว่าดัดหรือเกิดขึ้นโดยธรรมชาติ และเป็นสิ่งสำคัญสำหรับการติดเชื้อ ad5 ( Wu et al . , 2003 )การสร้างแบบจำลองโมเลกุลพบว่าโปรตีนใยจะต้องงอเป็นมุมอย่างน้อย ~ 70 องศาให้เหมาะสมตำแหน่งของ rgd แม่ลายเป็นต้นโปรตีนที่มีอยู่ในพื้นผิวสัมผัส integrins ( Wu et al . , 2003 ) ถ้าไฟเบอร์สามารถกลับพับต่อร่างกายของโฆษณาไวริออนดังกล่าวที่แหลมมุมมันจะลดระยะทางที่ ad5 เส้นใยยื่นออกมาจากร่างกายหลักของโฆษณาไวริออนจาก 37 นาโนเมตรเท่านั้น ~ 16 nm . โปรตีนเส้นใยเพลาสั้น เช่นที่ ad9 ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ คาดว่าจะแข็ง ( Chiu et al . , 2001 ) ดังนั้น ความแตกต่างในความยาวของผลสั้น และ ยาว เส้นใยโปรตีนที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ อาจจะไม่แตกต่างกันอย่างมากซึ่งอาจนำไปสู่การแปรรูปแบบคล้ายกันว่า ไวรัสเหล่านี้

อีกปัจจัยหนึ่งที่อาจส่งผลให้ประสิทธิภาพพลังงานของ ad5slacz คล้ายกัน และ ad5llacz อาจผลกระทบของประจุลบ ) ในสภาพแวดล้อมการโฮสต์โดย ad5 Hexon โปรตีน ตามที่กล่าวไว้โดย shayakhmetov เลเบอร์ ( 2000 ) และพื้นผิวสัมผัสออกภูมิภาคของ Hexon จากเส้นใยโปรตีนธรรมชาติ ( ด้วยโฆษณาสั้นมีแนวโน้มที่จะเป็นกลางหรือมีประจุบวก ( ครอฟอร์ดและ miksza ชเนอร์ , 1996 ) อนุญาตให้เหมาะค่อนข้างใกล้ชิดของโฆษณาและไวริออนประจุลบเซลล์เมมเบรน ในทางตรงกันข้าม

การแปล กรุณารอสักครู่..

ภาษาอื่น ๆ

การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.